哺乳動物免疫球蛋白基因及其表達機制研究進展

陶曉釗，薄欣宇，段樹楠，任戰(zhàn)軍，董響貴，王淑輝

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西咸陽 712100）

免疫球蛋白是有頜脊椎動物在體液免疫過程中由B 淋巴細胞分泌的關(guān)鍵效應分子，用來進行有效的識別和清除抗原。在高等脊椎動物中免疫球蛋白重鏈基因呈“易位子”形式排列，其基因座由VH 基因片段，DH 基因片段和JH 基因片段以及下游的多種不同類型的CH 基因線性排列。C 區(qū)氨基酸序列穩(wěn)定，用于決定Ig 的類型[1]，哺乳動物有5 種Ig 重鏈基因：μ、δ、γ、ε 和α，兩種輕鏈基因：κ、λ，不同重鏈與輕鏈組成完整Ig的分子分別稱之為IgM、IgG、IgA、IgD 和IgE[2]。

為了應對環(huán)境中種類繁多的病原，保護機體免受病原體的侵害，機體必須產(chǎn)生多樣性的抗體來抵御復雜多變的抗原。有研究表明，人體可以利用有限的基因組針對抗原產(chǎn)生無限多種類的抗原受體[3]。在探究動物免疫球蛋白基因的整個進化過程中，研究人員需要解決的關(guān)鍵問題是，各種機制如何產(chǎn)生免疫球蛋白V 區(qū)庫，以及C 區(qū)如何多樣化以產(chǎn)生。免疫球蛋白V 區(qū)多樣性產(chǎn)生機制包括V（D）J 重組（V(D)J recombination）[4]、體細胞超突變（Somatic hypermutation，SHM）[5]和基因轉(zhuǎn)換（Gene conversion，GC）[6]。在過去的幾十年里，人們對小鼠和人類的免疫球蛋白基因進行了深入的研究，我們對抗體多樣性產(chǎn)生和其他相關(guān)分子機制的理解也獲得近一步深入。然而，在牛中出現(xiàn)的超長CDR3的結(jié)構(gòu)，兔中發(fā)現(xiàn)了IgD編碼基因缺失的現(xiàn)象，駱駝中發(fā)現(xiàn)了僅由重鏈組成免疫球蛋白[7]，這些是在人類和小鼠的研究中沒有發(fā)現(xiàn)的，說明不同的動物可能會利用不同機制來實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)。因此需要對哺乳動物的免疫球蛋白基因及其多樣性機制進行更加深入的探究，了解不同動物的免疫機制過程，從而清楚其抗病機理，為提高其抗病力研究提供一定的參考。

1 豬免疫球蛋白基因及其表達機制

豬抗體重鏈和輕鏈的基因的編碼方式與其他正常哺乳動物相同。有大約30 個VH基因且其核苷酸相似性大于75%，屬于同1 個基因家族，2個功能性DH基因和1 個功能性JH基因，14～60 Vκ 基因，5 Jκ 片段、12～13 個功能性Vλ基因和兩個功能性Jλ基因[8]，豬的Ig 基因只在CDR區(qū)域存在差異。在核酸表達水平上，7 個VH片段，2 個有功能性DH基因和1 個JH片段共同參與90%以上的VDJ重組[9,10]。下游有編碼Cμ、Cδ、Cγ、Cε和Cα基因。豬IgH基因座的定位顯示只有2 個功能性DH和1 個功能性JH，表明V(D)J重組對豬的VH基因庫貢獻甚微[11]。通過研究新生仔豬VDJ轉(zhuǎn)錄本的分子特征發(fā)現(xiàn)，CDR3的連接多樣且不對稱，D-J連接比V-DJ連接貢獻更高的多樣性。閱讀框架II 的使用頻率是框架III 的兩倍，CDR3的多樣性是通過重鏈不同基因片段的連接引入許多N-核苷酸的插入，從而產(chǎn)生不同長度的CDR[11,12]。

與其他物種不同，豬在蛋白質(zhì)水平上具有平衡的λ 鏈和κ 鏈比率（分別為52%和48%）[13]。在其基因座的研究上也發(fā)現(xiàn)了相同的比例，在兩個輕鏈基因座上都觀察到了數(shù)量相似的功能性Vλ和Vκ基因[14]。豬λ基因座可以鑒定出22 個Vλ基因，其中只有9 個具有功能。至于κ 位點，有一個Cκ前面有5 個Jκ 片段，雖然可以識別出14 個Vκ 基因，但其中只有9 個是功能性的，因此與功能性Vλ基因的數(shù)量相同[15]。由于V 基因片段和J 基因片段數(shù)目有限，豬免疫球蛋白輕鏈V 無法同重鏈一樣利用CDR3中的連接多樣性，主要利用的是SHM。SHM 可以使有限的免疫基因產(chǎn)生多種的抗體來應對不同的抗原。SHM 主要的作用方式是在V 區(qū)引入點突變，其他方式有使堿基插入或者缺失[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SHM 多發(fā)生在V(D)J重組區(qū)和J 基因片段下游內(nèi)含子處，在其他位置發(fā)生的頻率很低[17]。

2 牛免疫球蛋白基因及其表達機制

與人類和小鼠一樣，牛表達5 類IgH 鏈：μ、δ、γ、E和α。但與人類中存在的4 個IgG 亞類（γ1、γ2、γ3和γ4編碼）和兩個IgA 亞類（α1和α2編碼）相比，在牛中只發(fā)現(xiàn)了三個γ基因（γ1、γ2和γ3）和一個α基因[18,19]，且牛δ基因的存在直到2002 年才得到證實[20]。此前的研究一直認為，牛免疫球蛋白重鏈基因在第21 號染色體上[21]和第11 號染色體上[22]，且都具有功能性。Ma 等[23]通過原位雜交等實驗發(fā)現(xiàn)，所有功能性牛IGH基因位于BTA21上，并且在BTA11上僅存在截短的μCH2外顯子。在某種程度上，不同物種蛋白質(zhì)水平上的λ/κ 比率被認為是基因組中V 基因數(shù)量最多的鏈的反映[24]。對?；蚪M進行測序和注釋，牛κ 基因位點緊湊簡單，可能是因為牛優(yōu)先使用λ 鏈。牛免疫球蛋白λ 輕鏈恒定區(qū)（IGLC）基因的序列分析表明，牛免疫球蛋白λ輕鏈基因座由四個連接恒定基因重組單元組成，長度約為20kb。重組信號序列的詳細檢查表明四個連接恒定基因重組單元的RNA 剪接位點和編碼 序 列 中，只有兩個IGLC基因（IGLC2和IGLC3）具有功能，而IGLC1和IGLC4似乎是假基因，也說明了在這四個基因中，IGLC3優(yōu)先在牛中表達[25]?；谂；蚪M分析確定了25 個功能性Vλ，但只有是8 個功能性Vκ 基因，而輕鏈中，牛優(yōu)先使用λ 鏈（96%）[26]。

除經(jīng)典的V(D)J 重組、體細胞超突變和基因轉(zhuǎn)換等抗體多樣性產(chǎn)生機制外，牛還具有利用超長CDRH3產(chǎn)生抗體多樣性的機制。根據(jù)編碼序列的長度和身份，在基因座中鑒定的23 個IGHD片段可以分為9 個亞組（稱為IGHD1至IGHD9）。除了IGHD9 的兩個成員（大小為14nt）外，所有其他功能性IGHD片段的長度都超過30 nt，其中IGHD8基因（149bp）最長。這些非常長的種系IGHD片段在牛中產(chǎn)生異常大的H 鏈CDR3長度變異性中起著關(guān)鍵作用[27]。超長CDRH3基因鏈是?？贵w多樣性產(chǎn)生的一個獨特機制。牛的超長的CDRH3區(qū)產(chǎn)生機制是通過不同的數(shù)量和位置的二硫鍵作用來獲得大量的抗原結(jié)合構(gòu)型[28]。

3 羊免疫球蛋白基因及其表達機制

通過Vlambda Vkappa 和V（H）cDNA 克隆的序列分析評估綿羊抗體庫，盡管在Vkappa 鏈的連接區(qū)域發(fā)生了有限的多樣性[29]，但所有胚系免疫球蛋白鏈基本上都屬于種系結(jié)構(gòu)。綿羊有9個VH片段，按照氨基酸序列相似性劃分為同一IGHV1家族[30]。綿羊基因組包含60～90 個Vλ基因，分布在至少六個不同的家族中[31]。綿羊在VλcDNA 的CDR3區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了顯著差異的長度多態(tài)性。從FR1到FR3的一些cDNA 序列相同，但它們的CDR3長度各不相同。CDR3的長度變化不太可能是由某個隨機過程產(chǎn)生的[32]，其在所有發(fā)育階段的免疫球蛋白可變區(qū)均有表達，但是表達的偏好性有所不同，JH1 具有更強的表達偏好性[33]。

山羊免疫球蛋白輕鏈VJ重組時對V 基因的利用存在偏好性，λ 鏈中主要表達Vλ2和Vλ3，κ 鏈主要表達Vκ2和Vκ4[34]。山羊免疫球蛋白基因參與VDJ重組的主要是VH2，DH1和JH1基因片段，而N-核苷酸和P-核苷酸的插入是CDR3多樣性的重要因素[35]，但是VDJ重組多樣性機制對于構(gòu)建山羊抗體庫的作用的比較小，SHM 在山羊免疫球蛋白重鏈可變區(qū)表達譜多樣性中是更為重要的機制[36]。山羊IgH位點存在于7個基因組支架上，包含10 個VH，3 個DH和6個JH段[37]。VH根據(jù)序列相似性將基因分為兩個基因家族，體細胞超突變引入的點突變是這些表達可變區(qū)中存在的主要突變。與人和馬相比，DH-DH融合在山羊V(D)J 重組中發(fā)生頻率更高。這些結(jié)果為山羊免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域基因組位點和庫多樣性提供了不同的見解。

4 駱駝免疫球蛋白基因及其表達機制

駝科動物是唯一能產(chǎn)生功能性重鏈抗體的哺乳動物。在1990 年代初期，在駱駝科動物中發(fā)現(xiàn)了其免疫系統(tǒng)中存在非常規(guī)抗體：以天然沒有輕鏈的同源二聚體形式存在，因此這種抗體被稱為僅重鏈抗體[38]。駱駝科血清同時含有常規(guī)雜四聚體抗體和獨特的功能性重鏈抗體（HCAb）。這些同源二聚體抗體的H 鏈由1 個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域VHH（Variable domain of camelid heavy chain antibodies）和2 個恒定結(jié)構(gòu)域組成。HCAbs由于第一恒定結(jié)構(gòu)域的缺失和VHH 側(cè)的重塑表面而無法結(jié)合輕鏈，這通常與常規(guī)抗體中的L 鏈相關(guān)。組成HCAb 的遺傳元件已被鑒定，但這些抗體從其專用基因到抗原特異性和親和力成熟的真正的抗體的體內(nèi)生成仍然存在很多的未知機制[39]。在駱駝體內(nèi)，重鏈抗體IgG2和IgG3占總IgG的75%，且IgG3相較于IgG2鉸鏈區(qū)較長，其中重鏈抗體IgG2和IgG3由于供體剪接位點的點突變，缺少H鏈（CH1）的第一個恒定結(jié)構(gòu)域。將重鏈抗體的可變區(qū)進行分離獲得的短肽被稱為納米抗體，納米抗體在疾病免疫機制中發(fā)揮重要作用，具有一定的研究價值[40]。

5 兔免疫球蛋白免疫球蛋白基因及其表達機制

在大多數(shù)哺乳動物中，IgD通常是1 種具有1 個或多個鉸鏈結(jié)構(gòu)域的三結(jié)構(gòu)域分子，有時還有一個開關(guān)結(jié)構(gòu)域。然而，在家兔中，IgD完全缺失，其基因組缺失了編碼恒定區(qū)Cδ的基因序列，因此，家兔IgH只有四種CH基因類型[41]。Cγ基因在其他大多數(shù)哺乳動物中以多拷貝和亞型的形式存在，而家兔的IgH位點中僅有一個拷貝。相反，通常其他物種中只有一個Cα基因，而家兔則有多達13 個Cα基因，其中10 個被檢測到能夠表達出來[42]。通過測定兔Cμ基因座下游13.5 kb 基因組DNA 的核苷酸序列，沒有在該區(qū)域找到兔子C delta 基因座，但發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的重復元素密集分布[43]。家兔所有的VH基因片段的核苷酸序列相似性較大，屬于一個基因家族[44]，在90%的表達譜中都使用VH1片段[45]、4 個DH和JH4基因片段[46]。

兔κ 輕鏈基因家族的特點是存在兩個恒定區(qū)（Cκ）基因，其中Cκ1基因編碼主要是免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)，Cκ2基因則在家兔中不表達或表達極少[47]。κ 輕鏈存在兩種同型形式且其表達水平存在很大差異。通常情況下，κ1的表達水平很高，而κ2幾乎是沉默的，其原因是κ2基因座中缺少3′ 增強子所以出現(xiàn)κ1同種型被優(yōu)先利用的現(xiàn)象[48]。然而在Cκ2基因下游約7kb 處發(fā)現(xiàn)了一個強大的增強子活性區(qū)域，該區(qū)域的序列在兔、人和小鼠之間高度保守[49]。

雖然VH、DH和JH基因片段的有限使用會導致VDJ重排有限，但由于N-核苷酸的插入，V(D)J基因重排產(chǎn)生的多樣性結(jié)果比預期要大得多。

6 小結(jié)

通過對不同哺乳動物免疫球蛋白機理進行分析，發(fā)現(xiàn)不同物種可能使用不同的機制來實現(xiàn)相似的功能，例如：駱駝科動物只有重鏈的免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)，以及牛利用超長CDR3來實現(xiàn)免疫球蛋白的多樣性，這表明動物免疫球蛋白基因及表達機制具有極高的多樣性。與人類和小鼠相比，上述哺乳動物的免疫球蛋白胚系可變區(qū)基因庫都相對較小，未來的研究還需要完整地探究不同動物的免疫球蛋白基因座以及這些物種中多樣化的作用機制，以達到了解物種進化歷程，以及為分子抗病育種提供理論支持。