骨質(zhì)疏松癥中l(wèi)ncRNA可調(diào)控的骨代謝相關(guān)因子

余子維 陳劍峰 鄧喬松 李冠莘 張楠

南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院,江蘇 無錫 214000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是由于骨代謝失衡導致的骨吸收大于骨形成、進而使骨的脆性增加而易引起骨折的一種疾病。我國40歲及以上人群中男性的骨質(zhì)疏松癥患病率為5.0 %,女性為20.6 %,同時具有女性患病率遠高于男性、50歲及以上人群的患病率遠高于其他年齡段、絕經(jīng)后婦女的患病率遠高于絕經(jīng)前婦女等特點,尤其對于絕經(jīng)后婦女而言,骨折的風險大大增加,需要盡早進行預防和治療[1-2]。許多危險因素都可以導致骨密度的降低,例如內(nèi)分泌疾病(糖尿病)、胃腸道疾病(炎癥性腸病)和風濕性疾病等。此外,一些藥物也能夠?qū)е鹿琴|(zhì)丟失,如免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和抗驚厥藥等[3]。目前抗骨質(zhì)疏松藥物主要包括抗重塑藥物、骨合成代謝藥物兩大類。這些藥物可維持或改善骨密度并降低骨折風險,然而接受這些藥物治療的患者可能會出現(xiàn)嚴重的副作用。例如,長期使用雙膦酸鹽會增加兩種罕見危害的風險:非典型股骨骨折和頜骨壞死,雌激素-孕激素增加了未指明的骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)減少狀態(tài)的女性患心血管疾病和認知障礙的風險,也增加了浸潤性乳腺癌的風險[4]。此外,患者對于藥物治療的依從性和持續(xù)性的不理想亦會導致骨折風險的增加[5]。因此,迫切需要為骨質(zhì)疏松癥的治療尋找新的靶點。

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一類不具有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA,主要包括小非編碼RNA如miRNA、siRNA、circRNA等以及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。其中LncRNA的長度大于200個核苷酸,雖然lncRNA不編碼蛋白質(zhì),但lncRNA生物學的某些方面與mRNA相似。大多數(shù)lncRNA由RNA聚合酶II(Pol II)轉(zhuǎn)錄,并通過聚腺苷酸化穩(wěn)定,而非聚腺苷酸化的lncRNA可以通過二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,例如3'末端的三螺旋結(jié)構(gòu)[6]。有研究表明lncRNA在表觀遺傳修飾和基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,具有調(diào)節(jié)多種生理和病理過程的能力[7],因此近年來出現(xiàn)了許多有關(guān)lncRNA的心血管疾病、自身免疫性疾病、癌癥以及神經(jīng)退行性疾病的研究。此外,有研究證明,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者(OP組)與健康對照組(NC組)相比,有70種lncRNA存在表達差異[8],因此LncRNA可能為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點。

1 lncRNA與骨保護素

骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是由成骨細胞(osteoblast,OB)產(chǎn)生的分泌型糖蛋白,主要通過OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)影響骨代謝。此信號傳導通路發(fā)現(xiàn)于破骨細胞的分化過程,主要作用機制是OPG與RANK競爭性的結(jié)合RANKL,阻隔RANK與RANKL之間的結(jié)合,從而延緩破骨細胞的分化,抑制骨吸收[9]。

LncRNA H19在肝癌細胞中過表達可增強其在體外誘導破骨細胞成熟的能力,促進其在體內(nèi)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。黃昭[10]在研究中發(fā)現(xiàn)H19調(diào)控的基因主要位于MAPK信號通路。過表達H19的細胞及對應小鼠骨轉(zhuǎn)移灶中,p-p38及其下游效應蛋白表達水平降低,OPG表達水平下調(diào),敲低H19則表達水平升高。在敲低H19的細胞中抑制p38 MAPK信號通路后,OPG表達水平下調(diào)。同時,回復因敲低引起的p-p38上調(diào)后,OPG表達水平提高。因此H19可以通過介導p38 MAPK通路的失活來抑制OPG的表達。近幾年有更多的研究表明OPG的甲基化狀態(tài)可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要因素之一[11],Yu等[12]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1能夠通過影響OPG的甲基化狀態(tài)來抑制OPG的表達。過表達lncRNA SNHG1對OPG的表達有明顯的抑制作用,而沉默SNHG1則增強了OPG的表達。此外,用DNA脫甲基劑5-Aza處理骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)增加了OPG的表達水平,抑制了OPG的甲基化,而SNHG1的過表達則消除了這些影響。為了進一步證實這一結(jié)論,又研究了lncRNA SNHG1在體內(nèi)骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中的影響。轉(zhuǎn)染sh-SNHG1(沉默SNHG1)可明顯改善雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)組的骨質(zhì)疏松變化,而與sh-OPG(沉默OPG)共同轉(zhuǎn)染則部分逆轉(zhuǎn)了SNHG1沉默的效果。因此,lncRNA SNHG1能夠增強OPG的甲基化,從而下調(diào)OPG的表達。

激素類藥物治療能夠抑制BMSC的增殖[13],Fu等[14]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA NORAD在股骨頭壞死(SONFH)組織和地塞米松(Dex)處理的骨髓間充質(zhì)干細胞中表達下調(diào),而miR-26a-5p表達上調(diào)。通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn),敲低NORAD后,檢測到OPG表達水平降低,RANK、RANKL表達水平升高。NORAD過表達后,OPG表達量增加,RANK和RANKL表達量減少,而轉(zhuǎn)染miR-26a-5p模擬物則明顯抑制了這些影響。此外,NORAD的過表達使細胞增殖能力增強,細胞凋亡受到抑制,而miR-26a-5p的過表達則削弱了這些效應,因此lncRNA NORAD能夠通過調(diào)控miR-26a-5p影響OPG的分泌。

2 lncRNA與骨特異性堿性磷酸酶

骨特異性堿性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase,BALP)是非特異型堿性磷酸酶的一種亞型,由成骨細胞分泌的一種細胞外酶,主要在成骨過程中水解磷酸酯,促進沉積羥基磷灰石并水解焦磷酸鹽,解除對骨礦物質(zhì)形成的抑制作用,有利于骨形成。因此,BALP是反應成骨細胞活性和骨形成的特異性指標,其濃度反映了骨代謝的總體情況[15]。

lncRNA H19在骨和軟骨發(fā)育中起著重要作用,可導致軟骨細胞外基質(zhì)降解,能夠用作評估骨關(guān)節(jié)炎(OA)進展和預后的診斷[16],Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在骨關(guān)節(jié)炎患者的外周血表達量顯著高于對照組,這提示lncRNA H19可能與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)。此外,Pearson相關(guān)性分析顯示,lncRNA H19與骨關(guān)節(jié)炎患者中骨代謝指標Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)、骨鈣素N端中分子片段(N-MID)、骨鈣素(BGP)和BALP呈負相關(guān)。其他研究報告了miR-141可以通過調(diào)節(jié)lncRNA H19和其靶基因miR-675來調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖[18],因此猜測BALP的分泌可能與miR-141/lncRNA H19/miR-675通路有關(guān)。Pan等[19]的研究采用qRT-PCR定量檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA HAGLR在骨折組織中下調(diào)。敲低HAGLR降低了小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)的增殖,提高了凋亡率,下調(diào)了BALP、骨鈣素以及轉(zhuǎn)化生長因子β受體2(TGFBR2)的表達。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)OP模型組的血清雌二醇(E2)水平比lncRNA p21組顯著下降,血清骨形成標志物[BGP、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)和BALP]模型組顯著高于lncRNAp21組,然而模型組中Wnt/β-catenin信號通路[21](一種成骨細胞通路,活化后能夠上調(diào)BALP活性的表達)的表達水平顯著低于lncRNAp21組。因此,lncRNAp21能夠通過增加E2分泌激活Wnt/β-catenin信號通路,最終刺激模型組的成骨分化,促進分泌BALP。Shen等[22]研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中l(wèi)ncRNA NEF、ALP表達水平低于正常組,抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP)、組織蛋白酶K(CTSK)表達水平高于正常組。Pearson相關(guān)分析顯示lncRNA NEF與骨質(zhì)疏松大鼠的ALP表達呈正相關(guān),與TARP、CTSK呈負相關(guān)性。此外,與陰性對照組相比,感染敲低LncRNA NEF的慢病毒細胞的ALP活性與LncRNA NEF水平均降低。因此,lncRNA可能通過調(diào)控ALP的表達,參與成骨分化的過程。

3 lncRNA與腫瘤壞死因子α

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)有α和β兩種亞型。TNF-β激活凋亡和炎癥信號與TNF-α相似,通過淋巴毒素-β(LTβR)受體發(fā)出信號,并激活典型和非典型的NF-κB信號。LTβR通過刺激NF-κB途徑在炎癥、淋巴器官形成以及保留B和T淋巴細胞的結(jié)構(gòu)和分區(qū)中發(fā)揮重要作用[23]。TNF-α是破骨細胞的重要調(diào)節(jié)因子,可以參與骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)代謝。TNF-α可以促進破骨祖細胞的分化以及破骨細胞前體細胞的有絲分裂,刺激破骨細胞增殖[24],增強破骨細胞的形成與活性。在病理性骨缺失如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、慢性炎癥引起的骨吸收組織中,TNF-α濃度均有提高,說明TNF-α是調(diào)節(jié)骨代謝的重要因子[25]。

LncRNA在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(POP)中起著重要的關(guān)鍵作用,Yu等[26]的研究通過隨訪POP患者發(fā)現(xiàn),lncRNA CASC11和TNF-α的血漿水平在POP患者中顯著上調(diào),此外在破骨細胞中過表達CASC11后,TNF-α上調(diào),POP患者接受治療后CASC11和TNF-α的血漿水平下降。因此,lncRNA CASC11可通過上調(diào)TNF-α促進骨吸收并推動POP的發(fā)展,但具體調(diào)控的分子機制尚不清楚,缺乏體內(nèi)實驗去進一步證明它們之間的作用。TNF-α可通過激活MAPK/NFATc1通路誘導破骨細胞的分化和成熟[27],Zhu等[28]研究發(fā)現(xiàn)miR-454-3p在293 T細胞中被敲低后,lncRNA MEG8和TNF-α的表達水平顯著增加,MEG8在293 T細胞中過表達后,miR-454-3p的表達量下降,TNF-α的表達量升高,促進小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)細胞破壞骨骼。因此,lncRNA MEG8/miR-454-3p靶向TNF-α形成調(diào)控網(wǎng)絡促進骨破壞。Hippo/YAP通路是成骨細胞分化的重要信號通路之一,TNF-α可以通過調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號通路影響B(tài)MSC的成骨分化[29],Han等[30]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度越高,小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)增殖率越低,lncRNA TUG1的表達水平越低,而過表達lncRNA TUG1后能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α對MC3T3-E1細胞的凋亡作用,抑制Hippo/YAP通路活性,促進成骨分化,但敲低TUG1則減弱了這些效果。因此,可以確定lncRNA TUG1能夠改善TNF-α對成骨分化的抑制作用,但這兩者之間的調(diào)控作用還不清晰,需要進一步探索。

4 lncRNA與轉(zhuǎn)化生長因子β

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor,TGF-β)是能夠刺激細胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化的生長因子,是參與骨形成和骨修復的重要調(diào)節(jié)因子。在骨組織中,TGF-β廣泛存在,是參與骨代謝的重要細胞因子,能夠刺激成骨細胞的增殖和分化,促進骨形成,而對破骨細胞具有促進和抑制的雙重作用。TGF-β還可影響膠原合成,參與調(diào)節(jié)骨和軟骨形成,促進骨修復[24]。當血中TGF-β濃度下降時,可誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥等代謝性骨病,而在癌癥的骨轉(zhuǎn)移過程中,TGF-β卻能夠促進大量破骨細胞成熟,導致骨溶解,形成骨質(zhì)破壞。

lncRNA-SOX2OT在促進骨轉(zhuǎn)移(BoM)中起著至關(guān)重要的作用,Ni等[31]研究發(fā)現(xiàn)用敲低lncRNA-SOX2OT的外泌體誘導處理后,RAW264.7細胞中TGF-β的表達水平降低,過表達lncRNA-SOX2OT后,細胞中則觀察到相反的結(jié)果。此外,BoM的特征是通過調(diào)節(jié)TGF-β/pTHrP/RANKL信號通路導致破骨細胞異常分化和功能障礙。因此,lncRNA-SOX2OT可以通過調(diào)節(jié)破骨細胞中的TGF-β/pTHrP/RANKL信號通路來調(diào)節(jié)破骨細胞分化并刺激BoM。在癌癥的骨轉(zhuǎn)移中,轉(zhuǎn)移到骨骼的癌細胞由TGF-β信號驅(qū)動,這可能導致異常的骨重塑過程,Lang等[32]研究發(fā)現(xiàn)在lncRNA PCAT7高表達樣本中TGF-β信號傳導也顯著富集,PCAT7過表達和miR-324-5p敲低均有效增強TGF-β信號傳導的熒光素酶活性,而敲低PCAT7或miR-324-5p過表達均抑制其活性。此外,miR-324-5p模擬物能夠逆轉(zhuǎn)過表達PCAT7促進TGF-β活性的作用,且敲低PCAT7導致TGF-β活性減弱的作用,能夠被miR-324-5p抑制解除。因此,認為PCAT7通過抑制miR-324-5p激活TGF-β信號促進骨轉(zhuǎn)移。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)是多潛能干細胞,在一定條件下可以分化成各種細胞,其增殖和凋亡的調(diào)控是影響骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因素之一[33],Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA RAD51-AS1促進了BMSC細胞凋亡,減弱細胞活力和成骨分化,而過表達RAD51-AS1則起到了相反的作用。此外,敲除RAD51-AS1后,SMAD7和SMURF2蛋白水平明顯增加,然而,RAD51-AS1的過表達則出現(xiàn)相反的效果。在機制上,有研究發(fā)現(xiàn)SMURF2能與SMAD7結(jié)合形成E3(泛素-蛋白質(zhì)連接酶),針對TGF-β受體進行降解以抑制TGF-β通路[35]。因此,lncRNA RAD51-AS1能夠通過SMAD7和SMURF2激活TGF-β信號通路進而促進BMSC的細胞增殖和成骨分化。

5 lncRNA與白細胞介素

白細胞介素(interleukin,IL)是由多種細胞產(chǎn)生的、具有重要調(diào)節(jié)作用的一類細胞因子,在傳遞信息、激活與調(diào)節(jié)免疫細胞,介導T、B細胞活化、增殖與分化及參與炎癥反應中起到重要作用。其中IL-1和IL-6都屬于細胞因子家族成員之一。大多數(shù)的有核細胞皆可以產(chǎn)生IL-1,IL-6可由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞和T細胞等合成。IL-1和IL-6可以促進破骨細胞增殖與分化,加強骨吸收、抑制成骨細胞活性、破壞骨形成,最終導致骨代謝失衡、骨密度下降,誘發(fā)骨質(zhì)疏松[36]。

有研究表明,癌細胞分泌的因子會影響骨細胞的生長和分化,而骨微環(huán)境分泌的因子會促進癌癥向骨轉(zhuǎn)移[37],Aimy Sebastian等[38]研究發(fā)現(xiàn)將溶骨性前列腺癌細胞系(PC3)與WT成骨細胞共培養(yǎng),可使PC3細胞中與癌癥相關(guān)的lncRNA MALAT1上調(diào),與單獨的PC3相比,MALAT1在與WT成骨細胞共培養(yǎng)的前列腺癌細胞中被上調(diào),這表明成骨細胞分泌的因子會上調(diào)MALAT1。另外,由成骨細胞分泌的因子已被證明在調(diào)節(jié)癌癥向骨轉(zhuǎn)移方面起著重要作用[39],而IL-6是成骨細胞分泌的因子且在成骨細胞共培養(yǎng)中出現(xiàn)了差異性表達。因此,IL-6的分泌可能影響到lncRNA MALAT1的表達。Gao等[40]研究發(fā)現(xiàn)RANKL能夠促進小鼠巨噬細胞RAW264.7分化為破骨細胞,但IL-10削弱了這一作用,同時破骨細胞的標志物表達水平下降,表明IL-10可以抑制巨噬細胞向破骨細胞的分化。在RANKL誘導RAW264.7后,lncRNA MEG3的表達升高,然而,IL-10的添加削弱了這個效果,通過檢測發(fā)現(xiàn)IL-10的添加增加了細胞中MEG3的甲基化水平,抑制MEG3表達。此外,敲低MEG3,破骨細胞標志物水平顯著降低。因此,IL-10可能通過lncRNA MEG3抑制破骨細胞分化,從而抑制骨溶解。

除上述五個和骨質(zhì)疏松相關(guān)的因子能夠被lncRNA調(diào)控外,還有甲狀旁腺素(PTH)、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽(CTX)、胰島素樣生長因子(IGF)等,能夠被lncRNA GAS5[41]、lncRNA HHIP-AS1[42]、lncRNA BCAR4[43]、lncRNA AC132 217.4[44]、lncRNA PCAT6[45]等長鏈非編碼RNA所調(diào)控。

6 小結(jié)

綜上所述,許多l(xiāng)ncRNA可以通過不同的信號通路影響與骨形成和骨吸收相關(guān)因子的分泌。目前,研究中發(fā)現(xiàn)最多的lncRNA有H19、HAGLR、NORAD、MALAT1和DANCR可通過充當內(nèi)源性miRNA海綿來調(diào)節(jié)基因表達。此外,一些lncRNA,如lncRNA TUG1、lncRNA TUG1、lncRNA RAD51-AS1也可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin、Hippo/YAP、TGF-β信號通路來影響骨代謝。然而,對于骨質(zhì)疏松癥相關(guān)領(lǐng)域的lncRNA研究仍處于初期,在未來的研究中,仍有許多問題亟待解決。盡管本綜述概括了lncRNA調(diào)控的相關(guān)因子,但大多數(shù)lncRNA的作用機制尚未得到完整研究,且研究僅進行了體外實驗,并沒有進行骨質(zhì)疏松動物模型的體內(nèi)驗證實驗。因此,需要進一步研究lncRNA對OP相關(guān)因子調(diào)控的具體作用機制。其次,目前已知lncRNA能夠調(diào)控的OP相關(guān)因子的種類較少,僅僅只有一小部分。因此,研究人員應加大對lncRNA其他相關(guān)因子的研究。