基于主要成分分析不同大米肽的品質(zhì)與綜合評(píng)價(jià)

胡武瑤，黃晶，黃瑩，趙彤，陳曦，楊曉*

中國健康促進(jìn)基金會(huì)抗衰老營養(yǎng)與健康研發(fā)中心（武漢 430000）

大米肽主要含有肽混合物及少量的游離氨基酸、水分、糖分和無機(jī)鹽[1]*，具有低敏性[2]*、易消化吸收[3]*以及生物學(xué)效應(yīng)[4]*的特點(diǎn)。大米肽的氨基酸構(gòu)成模式與人體的需求模式基本一致[5]*，能夠?yàn)槿梭w提供所需的各種氨基酸和肽營養(yǎng)。大米肽還具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)的保健功能，如降血脂[3]*、降膽固醇[4-5]*、降血壓[6]*、抗氧化[7]*、增強(qiáng)肌肉[8]*等作用。大米肽已被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)為具有免疫功能的食品，且已被作為功能性成分添加到保健食品中。

隨著對(duì)大米肽功能的深入研究，大米肽在食品中的應(yīng)用也逐漸廣泛，它可以改變食品的品質(zhì)、風(fēng)味，也能增強(qiáng)食品的功能性[9]*，由于目前缺乏大米肽的國家或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致市面上大米肽的品質(zhì)參差不齊。大米肽的品質(zhì)決定其營養(yǎng)特性和功能特性[10]*，因此此次研究采用高效凝膠色譜法和氨基酸分析儀等技術(shù)，以大米肽的蛋白質(zhì)含量、肽含量、分子量分布和氨基酸分析作為品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，并結(jié)合主成分分析對(duì)23種不同大米肽進(jìn)行品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)，以期為市場上大米肽的品質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)，為大米肽生產(chǎn)企業(yè)和大米肽產(chǎn)品提供產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的理論依據(jù)，有利于促進(jìn)大米肽行業(yè)的技術(shù)水平和市場的迅速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備與試劑

S-433Dup全自動(dòng)氨基酸分析儀[賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司]；MTN-2800D-12氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜（配有GPC數(shù)據(jù)處理軟件，美國Agilent公司）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；K1100全自動(dòng)凱式定氮儀（海能未來技術(shù)集團(tuán)股份有限公司）；JRX-10S曲線升溫消化爐（濟(jì)南精銳分析儀器有限公司）；202-2AB電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AB204-A分析天平（上海梅特勒-托利多儀器公司）。

鈉緩沖液A-1、鈉緩沖液B-1、鈉樣品稀釋液、17種氨基酸混合標(biāo)樣、鉀鈉緩沖液、鈉再生液、茚三酮[賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司]；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、三氯乙酸（色譜純）、胰島素、桿菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；濃鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；23種大米肽采購自23家不同的生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量測定

參考GB 5009.5—2016[11]*中第一法凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 肽含量測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容至50 mL，混勻靜置5 min，過濾去除初濾液，濾液作為備用液。然后測定濾液中的蛋白質(zhì)含量，測得的結(jié)果即為酸溶蛋白的含量。

稱取30.00 mg的大米肽粉，用稀釋液定容至10 mL，然后離心取上清液，用0.22 μm濾膜過濾后用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測定大米肽樣品中的游離氨基酸，肽含量按式（1）計(jì)算。

1.2.3 相對(duì)分子量分布測定

本次臨床試驗(yàn)，共發(fā)現(xiàn)不良事件19例，其中試驗(yàn)組9例（7.63%），對(duì)照組10例（8.33%），兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)研究者判定為不良反應(yīng)7例，其中試驗(yàn)組4例（3.39%），對(duì)照組3例（2.50%），均表現(xiàn)為皮膚刺激癥狀，兩組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組生命體征及實(shí)驗(yàn)室檢查，未發(fā)現(xiàn)有臨床意義的異常改變。

采用高效凝膠色譜法（High performance gel chromatography，HPGFC）測定大米肽樣品的分子量分布。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用流動(dòng)相配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的不同相對(duì)分子質(zhì)量的胰島素、桿菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按一定比例混勻后，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣，即可得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作線性回歸方程。

樣品處理：準(zhǔn)確稱取10.00 mg大米肽樣品于10 mL容量瓶種，用流動(dòng)相定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液即為待測樣品。

色譜條件：色譜柱 TSK-GELG 2000swxL300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相：V乙腈+V水+V三氯乙酸=20+80+0.1；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；檢測時(shí)間：30 min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：室溫。

1.2.4 氨基酸組成和含量測定

稱取80.00 mg大米肽樣品于水解管中，加10 mL 6 mol/L的HCl（含0.2%苯酚），吹氮?dú)?～5 min后擰緊瓶蓋，放入110 ℃烘箱中水解22 h，冷卻至室溫，將水解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水定容并過濾。取0.5 mL濾液至蒸發(fā)皿中，在60 ℃烘箱中蒸干，蒸干后加0.5 mL超純水，蒸干，再加0.5 mL超純水，蒸干。加入3 mL樣品稀釋液，待完全溶解后用0.22 μm濾膜過濾，取0.3 mL濾液加0.6 mL樣品稀釋液，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測定大米肽樣品中的氨基酸組成和含量。

1.2.5 綜合評(píng)價(jià)方法

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 23種大米肽的蛋白質(zhì)含量分析

23種大米肽的蛋白質(zhì)含量結(jié)果見表1。從表1可以看出：蛋白質(zhì)含量≥90%的樣品占26.1%；85%≤蛋白含量＜90%的樣品占56.5%；80%≤蛋白含量＜85%的樣品占17.4.0%。這說明大米肽的蛋白含量較高，是很好的蛋白質(zhì)來源。23種大米肽的蛋白含量各不相同，這可能是因?yàn)槠湓蟻碓春凸に嚥町愒斐傻腫12]*。

表1 23種大米肽的蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

蛋白質(zhì)含量的高低是衡量以蛋白為主要成分的產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。由于目前缺乏大米肽的國標(biāo)，參考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[13]*按蛋白含量進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)，蛋白含量≥90%為一級(jí)，85%≤蛋白含量＜90%為二級(jí)，80%≤蛋白含量＜85%為三級(jí)。23種大米肽中有26.1%可分為一級(jí)，有56.5%可分為二級(jí)，有17.4%可分為三級(jí)，這說明以蛋白質(zhì)含量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)，23種大米肽的質(zhì)量主要集中在二級(jí)。

2.2 23種大米肽的肽含量分析

23種大米肽的肽含量結(jié)果如表2所示。結(jié)合表1和表2的結(jié)果可知，酸溶蛋白含量占總蛋白含量的90%以上樣品占比73.9%，這說明大米肽樣品中小分子量的肽是其主要組成部分，是因?yàn)楦叻肿恿康鞍踪|(zhì)在酸性條件下易被沉淀，較低分子量的蛋白質(zhì)水解物即酸溶蛋白易溶于酸性溶液[14]*。從表2的游離氨基酸結(jié)果可以看出，游離氨基酸含量≥5%的樣品占39.1%，游離氨基酸含量＜5%的樣品占60.9%。大米肽提取過程本質(zhì)是大米蛋白經(jīng)酶解的過程。當(dāng)酶解程度不夠時(shí)，水解產(chǎn)物的分子量大，產(chǎn)率低；當(dāng)水解過度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量游離氨基酸，難以得到所需分子量范圍的大米肽產(chǎn)品[15]*，但由于無論如何控制酶水解過程，均會(huì)產(chǎn)生一定量的游離氨基酸，所以游離氨基酸含量的指標(biāo)也可作為衡量大米肽品質(zhì)的重要參數(shù)。

肽含量是評(píng)價(jià)大米肽品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，因?yàn)榇竺纂牡纳锘钚灾饕呻捏w現(xiàn)，肽含量越高，大米肽純度越高。從表2的肽含量結(jié)果可以看出，23種大米肽樣品的肽含量≥80%和肽含量≤70%均僅占17.4%，而70%＜肽含量＜80%的樣品占82.6%，這說明23種大米肽的肽含量主要集中在70%～80%范圍內(nèi)，且23種大米肽的肽含量均不相同，這可能是因?yàn)槠渌鈺r(shí)所選擇的酶和酶解條件不同所致，酶作為一種具有專一性的特殊蛋白質(zhì)，其活化中心不同，水解得到的肽片段也將不同，所以水解得到的肽含量也會(huì)存在一定的差異[16]*。

表2 23種大米肽的肽含量測定結(jié)果

2.3 23種大米肽的分子量分布分析

分子量的大小直接決定了大米肽可被人體吸收利用的效率[17]*，決定著大米肽的營養(yǎng)價(jià)值。研究表明，肽段的分子量越小越容易被人體吸收，其生物活性可能越高[18]*，所以分子量分布也是評(píng)估大米肽產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。23種大米肽的分子量分布的結(jié)果如表3所示。23種大米肽的分子量主要集中在2 700 Da以下，且分子量分布主要集中在630～189 Da和1 200～630 Da這兩個(gè)區(qū)間范圍內(nèi)，占比分別為33.48%～66.73%和14.29%～26.97%，這說明23種大米肽中小分子肽是其主要組成部分，這與2.2小節(jié)中酸溶蛋白結(jié)果一致，與王申等[19]*的研究結(jié)果相似。23種大米肽的分子量分布均不同，這可能是因?yàn)榇竺纂奶崛r(shí)所用酶不同，而不同酶的酶解位點(diǎn)不同，即使同一大米蛋白在不同蛋白酶的作用下，也會(huì)產(chǎn)生不同分子量大小的肽片段。

表3 23種大米肽的分子量分布測定結(jié)果 單位：%

接表3

2.4 23種大米肽的氨基酸分析

氨基酸成分分析是研究各種肽類物質(zhì)構(gòu)造、特性和營養(yǎng)價(jià)值的重要手段[20]*。大米肽的生物活性與其氨基酸組成和含量緊密相關(guān)，對(duì)23種大米肽進(jìn)行氨基酸分析，氨基酸組成和含量測定結(jié)果見表4，由于采用酸水解法，色氨酸被破壞，故表4中無色氨酸。

從表4可以看出，23種大米肽的氨基酸含量豐富，富含人體所必需氨基酸，且氨基酸組成和含量均不相同。23種大米肽的總氨基酸（TAA）含量在78.31%～100.40%范圍內(nèi)，必需氨基酸（EAA）的含量在16.31%～32.16%范圍內(nèi)，EAA占TAA的18.15%～34.46%；疏水氨基酸（HAA）含量在27.34%～59.57%范圍內(nèi)，HAA占TAA的33.22%～59.33%；支鏈氨基酸（BCAA）的含量在6.96%～17.54%。有研究表明疏水氨基酸與肽的抗氧化活性存在一定的相關(guān)性[21]*，疏水性氨基酸含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)[22]*。BCAA可通過雷帕霉素機(jī)械靶蛋白（mTOR）途徑刺激肌肉合成代謝、抑制運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉蛋白分解，并在組織生長和修復(fù)中其重要作用[23]*。

表4 23種大米肽的水解氨基酸分析 單位：%

23種大米肽均含有較高的谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），其次是精氨酸（Arg）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala），這與周侃等[24]*的研究結(jié)果相似。Glu在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程種占據(jù)重要地位，是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一[25]*。Asp是一種良好的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，可以用于治療心臟病、肝臟病和高血壓癥，具有防止和恢復(fù)疲勞的作用[26]*。Leu具有螯合金屬離子的作用，可通過降低金屬離子的氧化還原電勢來穩(wěn)定金屬離子的氧化態(tài)，從而減少金屬離子的催化氧化，達(dá)到抗氧化的作用[27]*。研究報(bào)道，Arg、Leu、Ala、纈氨酸（Vla）、酪氨酸（Tyr）等與肽的抗氧化活性有關(guān)[28]*。

接表4

2.5 23種大米肽的品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)

表5中顯示了主成分方差貢獻(xiàn)率，表6顯示了主成分載荷矩陣。從表5可以看出，主成分1和主成分2的累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.631%，說明兩個(gè)主成分可基本代表最初變量的所有信息。從表6可以看出，對(duì)第1主成分正向影響較大的為肽含量、酸溶蛋白含量和HAA/TAA含量，載荷數(shù)分別為0.971，0.942和0.914。以各個(gè)指標(biāo)的載荷權(quán)數(shù)和主成分特征值，計(jì)算各指標(biāo)的特征向量。用特征向量為權(quán)重，得出主成分得分Z的計(jì)算公式：

表5 主成分方差貢獻(xiàn)率

表6 品質(zhì)指標(biāo)的主成分載荷矩陣

式中：Z1、Z2分別是第1和第2主成分得分；X1～X7分別為大米肽的蛋白、酸溶蛋白量、游離氨基酸、肽、分子量分布在1 200～189肽段、EAA/TAA和HAA/TAA含量。以各主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，由主成分得分和對(duì)應(yīng)的權(quán)重線性加權(quán)求和，得到品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)模型F，如式（4）所示。

根據(jù)模型計(jì)算出23種大米肽品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)值并進(jìn)行排序，結(jié)果見表7。從表7可以看出，樣16、樣18和樣4是綜合評(píng)價(jià)排名前3的大米肽樣品。

表7 23種大米肽的主成分得分與排序

3 結(jié)論

隨著大米肽的功能性被逐漸發(fā)掘，市面上也出現(xiàn)了越來越多的大米肽產(chǎn)品，但是大米肽的品質(zhì)參次不齊，難以判別其品質(zhì)優(yōu)劣。此次研究以23種大米肽的蛋白質(zhì)含量、肽含量、分子量分布、氨基酸分析作為品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用主成分分析法建立了不同大米肽品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)模型。結(jié)果顯示：23種大米肽的蛋白含量均大于80%，且56.5%的大米肽的蛋白含量在85%～90%的范圍內(nèi)；有86.2%大米肽的肽含量在70%～80%范圍內(nèi)，其分子量均主要集中在2 700 Da以下，且分子量在630～189 Da為其主要組成部分占大米肽的33.48%～66.73%；均含有人體必需氨基酸，Glu和Asp是大米肽中含量較高的氨基酸；采用主成分分析對(duì)23種大米肽樣品進(jìn)行品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示樣16、樣18和樣4是綜合評(píng)價(jià)靠前的大米肽樣品。目前由于缺乏對(duì)大米肽提取原料的分析對(duì)比研究，酶解技術(shù)尚不成熟以及缺乏生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)體系的參考，導(dǎo)致各企業(yè)所生產(chǎn)的大米肽品質(zhì)良莠不齊，從而限制了大米肽進(jìn)一步市場化，影響了大米肽在普通食品、保健食品、烘焙食品以及嬰幼兒食品等中的應(yīng)用。此次研究通過對(duì)23種大米肽的品質(zhì)分析與綜合評(píng)價(jià)，對(duì)大米肽工業(yè)化生產(chǎn)過程中的品質(zhì)控制具有一定的參考價(jià)值，從而促進(jìn)大米肽行業(yè)技術(shù)水平的提升，有利于大米肽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。