FAAS法測定海帶中微量元素的不確定度評定

劉蘭英，呂新，李瑩，羅土炎，上官亮，李玥仁*

1. 福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所（福州 350003）；

2. 福建省農產品質量安全重點實驗室（福州 350003）

海帶中含有豐富的膳食纖維、多糖、多酚等功能性物質，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒及提高免疫力等多種藥理活性[1-2]*，是一種經(jīng)濟價值很高的海藻養(yǎng)殖品種。同時海帶還含有極豐富的微量元素，微量元素在維持生命及人體正常新陳代謝中發(fā)揮重要作用，其含量與海帶的營養(yǎng)價值密切相關[3-4]*。因此，開展海帶中微量元素的檢測分析對于評估其營養(yǎng)價值具有重要意義。測量不確定度是表征合理地賦予被測量值分散性的非負參數(shù)[5]*，將測量不確定度引入海帶微量元素的檢測過程中，對于測量結果可信程度的評價很有必要。

現(xiàn)有方法主要是利用火焰原子吸收光譜法（FAAS）、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測定食品中微量元素的含量。其中，關于FAAS法測定食品中微量元素的不確定度評定主要集中在飲用水[6-7]*、糧食[8-9]*、酒類[10-11]*、奶粉[12-13]*等方面。如：趙立群等[9]*對小麥粉中鋅的不確定度評定結果表明，測量不確定度主要來源于方法回收率，其次是校準曲線擬合和測量重復性；彭珍華等[10]*對葡萄酒中鐵的不確定度評定結果表明，測量不確定度主要來源于標準工作溶液配制和校準曲線擬合；鐘加成等[13]*對嬰兒配方乳粉中鋅的不確定度評定結果表明，測量不確定度主要來源于樣品溶液中鋅濃度的測定和測量重復性。然而在眾多研究中，關于海帶中微量元素測量不確定度的報道還比較欠缺。

試驗以GB 5009.90—2016《食品安全國家標準 食品中鐵的測定》和GB 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》為檢測依據(jù)，采用FAAS法對海帶中鐵、鋅2個微量元素進行測定，參照JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》的要求和規(guī)定，對測量不確定度進行相應分析，以期為海帶中微量元素含量檢測的質量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

海帶樣品（取自福州市連江縣某海帶養(yǎng)殖區(qū)）。

硝酸（優(yōu)級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鐵、鋅標準儲備液（1 000 μg/mL：國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

1.2 主要儀器與設備

AA-6880原子吸收光譜儀（日本島津公司）；G-400智能控溫電加熱器、TOPEX微波消解儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；AL204電子天平（梅特勒公司）。

1.3 樣品前處理

將海帶樣品烘干、粉碎混合均勻后，稱取0.3 g左右（精確至0.000 1 g）于微波消解內罐中。加入5.0 mL硝酸溶液，置于微波消解儀中進行消解，消解升溫程序：120 ℃保持5 min，160 ℃保持10 min，190℃保持20 min。消解結束后冷卻至室溫，取出消解內罐，置于配套電加熱器中趕酸至1.0 mL左右，冷卻后將消解液轉移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。

1.4 標準溶液配制

準確吸取適量鐵、鋅標準儲備液（1 000 μg/mL），用1%硝酸溶液稀釋配成質量濃度均為10 μg/mL的標準中間液；吸取適量此標準中間液，配成鐵的質量濃度分別為0.0，0.05，0.1，0.2，0.4和0.6 μg/mL以及鋅的質量濃度分別為0.0，0.1，0.2，0.4，0.8和1.0 μg/mL的標準系列工作液。

1.5 樣品測定

儀器預熱至穩(wěn)定后，將鐵、鋅標準系列工作液按質量濃度由低到高的順序分別注入火焰原子化器，測定其吸光度，得到標準曲線，再分別測定空白樣液和樣品溶液的吸光度，通過校準曲線得到消解液中鐵、鋅的質量濃度。

1.6 數(shù)學模型

海帶樣品中待測元素的數(shù)學模型見式（1）。

式中：X為試樣中待測元素含量，mg/kg；ρ為試樣溶液中待測元素的質量濃度減去空白溶液中待測元素的質量濃度，μg/mL；V為試樣消化液定容體積，mL；f為試樣稀釋倍數(shù)；m為試樣質量，g。

2 結果與分析

2.1 測量結果

對海帶樣品進行12次測定，測定結果如表1所示。

表1 海帶樣品中鐵、鋅的測定結果

2.2 測量不確定度來源識別

根據(jù)檢測過程和數(shù)學模型，采用基本因果圖分析測量不確定度的來源（圖1）。海帶中鐵、鋅的測量不確定度分量主要來源有樣品質量（m）、樣品消解液定容體積（V）、樣品溶液質量濃度（ρ）、消化液稀釋因子（f）、樣品測量重復性（Rep）和方法回收率（Rec）。其中，測量重復性（Rep）包括樣品測定過程中稱量、定容等操作的重復性，為總試驗的一個合成重復性分量。

圖1 海帶中鐵、鋅測量不確定度評定因果關系圖

2.3 測量不確定度分量的量化

2.3.1 樣品質量（m）引入的不確定度

樣品稱量過程產生的不確定度主要由天平校準和重復性2個分量組成，由于引入已確定的合成重復性，因此沒有必要考慮稱量的重復性。

試驗樣品稱量所使用的天平為特種準確度等級，從校準證書上獲得，測量范圍在0～50 g時，天平的最大允許誤差為±0.5 mg，該不確定度分量需計算2次（皮重1次、毛重1次）。假設服從均勻分布，取包含因子3，則樣品稱量過程產生的標準不確定度試驗海帶平均質量為m=0.304 5 g，即304.5 mg，則樣品質量引入的相對標準不確定度urel(m)=0.408 2/304.5=0.001 34。

2.3.2 樣品消解液定容體積（V）引入的不確定度

樣品消解液定容過程產生的不確定度主要由容量瓶校準、溫度效應和體積重復性3個分量組成，同樣這里不考慮體積重復性。

2.3.2.1 容量瓶校準所產生的不確定度

試驗海帶樣品消解后使用25 mL容量瓶定容，所用容量瓶經(jīng)計量校準均為合格，依據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器》標準規(guī)定，25 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.03 mL。按照CNAS GL006：2019推薦，玻璃器皿假定為三角分布，取包含因子6，得到由容量瓶校準所產生的標準不確定度u1(V25)=

2.3.2.2 溫度效應所產生的不確定度

試驗使用的容量瓶校準溫度為22.7 ℃，樣品消解液定容時環(huán)境溫度為25 ℃，液體的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4*℃-1*，則溫度波動（2.3 ℃）產生的液體體積變化區(qū)間為±（25 mL×2.3 ℃×2.1×10-4*℃-1*）=±0.012 08 mL。假設服從均勻分布，得到由溫度效應所產生的標準不確定度

將上述2個分量合成，得到樣品消解液定容體積引入的標準不確定度u(V25)=u12*(V25)+u22*(V25)=其相對標準不確定度

2.3.3 樣品溶液質量濃度（ρ）引入的不確定度

樣品溶液質量濃度測定過程產生的不確定度主要由標準工作溶液配制、校準曲線擬合、檢測儀器校準3個分量組成。

2.3.3.1 標準工作溶液配制所產生的不確定度urel(ρ1)

由標準物質證書查得，鐵、鋅標準貯備液的相對擴展不確定度均為0.7%（包含因子k=2），換算成相對標準不確定度urel(ρstock)=0.7%/2=0.003 5。標準溶液配制過程中，鐵、鋅元素使用到1 mL，5 mL移液器和50 mL容量瓶，分別進行不確定度分析。

依據(jù)JJG196—2006規(guī)定，50 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.05 mL，同2.3.2的計算，得出由50 mL容量瓶定容所產生的相對標準不確定度urel(V50)=0.000 494。從校準證書上獲得，標稱容量1 mL的移液器，在移取0.1，0.5和1.0 mL體積時的容量允差分別為±2.0%，±1.0%和±1.0%，因未給出移取0.25 mL體積的容量允差，故移取0.25 mL體積的容量允差取最大值±2.0%。標稱容量5 mL的移液器，在移取0.5，2.5和5.0 mL體積時的容量允差分別為±1.0%，±0.5%和±0.6%，因未給出移取2.0，3.0和4.0 mL體積的容量允差，故移取2.0，3.0和4.0 mL體積的容量允差取最大值±1.0%。假設服從均勻分布，則各移液體積對應的相對標準不確定度為：

鐵元素標準溶液配制過程中使用50 mL容量瓶6次，1 mL移液器分別移取0.25 mL體積1次、0.5 mL體積2次、1.0 mL體積1次，5 mL移液器分別移取2.0 mL、3.0 mL體積各1次，故鐵元素標準溶液配制中所產生的相對標準不確定度為uFe,rel2*(ρ1)=urel2*(ρstock)+6×urel2*(V50)+urel2*(0.25)+2×urel2*(0.5)+urel2*(1.0)+urel2*(2.0)+urel2*(3.0)=0.017 712*。鋅元素標準溶液配制過程中使用50 mL容量瓶6次，1 mL移液器分別移取0.5 mL體積2次、1.0 mL體積1次，5 mL移液器分別移取2.0、4.0、5.0 mL體積各1次，故鋅元素標準溶液配制中所產生的相對標準不確定度為uZn,rel2*(ρ1)=urel2*(ρstock)+6×urel2*(V50)+2×urel2*(0.5)+urel2*(1.0)+urel2*(2.0)+urel2*(4.0)+urel2*(5.0)=0.013 862*。

2.3.3.2 校準曲線擬合所產生的不確定度urel(ρ2)

采用FAAS法測定海帶中的鐵、鋅含量，分別對配制的6個標準系列工作液進行3次測定，得到相應吸光度，結果如表2所示。

表2 標準系列工作溶液測定結果

對海帶樣品消解液進行12次測量后，由吸光度求得樣品中鐵、鋅的平均質量濃度：ρFe=0.307 μg/mL；ρZn=0.194 μg/mL（表1），則此過程帶來的標準不確定度為：

式中：SR為曲線的標準偏差；Yj為第i個校準溶液的第j次吸光度；Xi為擬合曲線第i個校準溶液的質量濃度，μg/mL；B1為曲線斜率；B0為曲線截距；n為測量校準溶液的次數(shù)，n=18；P為測量樣品溶液的次數(shù)，P=12；為擬合曲線各校準點濃度的平均值（n次）。mL；鋅元素SR=0.02046，?=0.417 μg/mL。

計算得到：鐵元素SR=0.00131，=0.225 μg/

將各值代入u(ρ2)的計算中，得出由校準曲線擬合所產生的標準不確定度，分別為uFe(ρ2)=0.004 23 μg/mL，uZn(ρ2)=0.014 64 μg/mL。其相對標準不確定度為uFe,rel(ρ2)=0.013 78，uZn,rel(ρ2)=0.075 46。

2.3.3.3 儀器校準所產生的不確定度urel(ρ3)

根據(jù)火焰原子吸收光譜儀檢定證書，其擴展不確定度為0.004 μg/mL（包含因子k=2），換算成標準不確定度urel(ρ3)=0.004/2=0.002 μg/mL，其相對標準不確定度分別為uFe,rel(ρ3)=0.006 51，uZn,rel(ρ3)=0.010 31。

合并3個分量，則樣品溶液質量濃度測定過程引入的相對標準不確定度為urel(ρ)=計算得到uFe,rel(ρ)=0.023 36，uZn,rel(ρ3)=0.077 41。

2.3.4 方法回收率（Rec）引入的不確定度

對海帶中鐵、鋅進行6次加標回收試驗，加標量分別為75 μg和4.5 μg，6次回收試驗的加標回收率結果見表3。根據(jù)貝塞爾公式，回收率試驗的標準偏差為計算得到sFe(Rec)=3.00%、sZn(Rec)=5.39%。則方法回收率引入的標準不確定度為計算得到uFe(Rec)=1.23%，uZn(Rec)=2.20%，其相對標準不確定度為uFe,rel(Rec)=0.011 39，uZn,rel(Rec)=0.020 19。

表3 海帶樣品加標回收測定結果

2.3.5 測量重復性（Rep）引入的不確定度

在相同條件下，對同一海帶樣品進行12次獨立的重復測定（表1），同2.3.4的計算，得出重復性試驗的標準偏差分別為sFe(Rep)=8.623 5 mg/kg，sZn(Rep)=0.409 0 mg/kg。則樣品重復性測量引入的標準不確定度為uFe(Rep)=2.489 4 mg/kg，uZn(Rep)=0.118 1 mg/kg，其相對標準不確定度為uFe,rel(Rep)=0.009 88，uZn,rel(Rep)=0.007 43。

2.3.6 消化液稀釋因子（f）引入的不確定度

試驗海帶測定過程中，因樣品消化液中鐵含量超出校準曲線的線性范圍，故對消化液進行10倍稀釋，用1 mL移液器移取1 mL測試液到10 mL容量瓶中，定容至刻度，則稀釋因子帶來的不確定度主要由稀釋過程中容量瓶定容和使用移液器引起的不確定度分量組成。其中，移液器移取體積所產生的不確定度同2.3.3的計算，可知urel(1.0)=0.005 77。依據(jù)JJG196—2006規(guī)定，10 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.02 mL，同2.3.2的計算，得出由10 mL容量瓶定容所產生的相對標準不確定度urel(V10)=0.000 862，故鐵元素由消化液稀釋因子引入的相對標準不確定度uFe,rel2*(f)=urel2*(V10)+urel2*(1.0)=0.005 832*。

2.4 合成標準不確定度

綜合各不確定度分量，試驗海帶中鐵、鋅含量測定的相對合成標準不確定度為計算得到鐵元素ucrel(X)=0.028 47，鋅元素ucrel(X)= 0.080 42。

海帶經(jīng)重復測定12次后，樣品中各元素的平均含量分別為XFe=252 mg/kg，XZn=15.9 mg/kg（表1），其合成標準不確定度uc(X)=ucrel(X)×X，計算得到鐵元素uc(X)=7.174 4 mg/kg，鋅元素uc(X)=1.278 7 mg/kg。

2.5 擴展不確定度

依據(jù)CNAS GL006：2019推薦，取95%的置信水平，包含因子k=2，則擴展不確定度U=kuc(X)，計算得到鐵元素U=14 mg/kg，鋅元素U=2.6 mg/kg。

2.6 各不確定度分量的相對貢獻

從各分量的相對標準不確定度可知，影響海帶中鐵、鋅含量檢測結果不確定度的最大因素是樣品溶液質量濃度，其次為方法回收率、測量重復性。相關研究在食用植物油微量元素的不確定度評定中也得到相似結果[14]*。與彭珍華等[10]*的研究結果相似，試驗在樣品溶液質量濃度測定過程中，又以標準溶液配制和校準曲線擬合產生的不確定度分量較大。

通過對比移液器在移取標準溶液時引入的不確定度發(fā)現(xiàn)，移液器在移取低體積溶液時，其產生的不確定相對更大些，這與所用移液器的體積誤差有關，因此在配制標準工作溶液時，要特別加強各種規(guī)格移液器的計量檢定，盡量移取較大體積的溶液，以減少此過程引入的不確定度。對于校準曲線的質量控制，可通過選擇適當濃度梯度的工作曲線，盡可能使待測元素濃度靠近曲線的中間位置，從而減少由此引入的不確定度。此外，通過使用精密度更高的器具配制標準溶液、增加工作曲線各濃度點的測量次數(shù)也可在一定程度上降低不確定度的引入[15]*。為降低方法回收率帶來的不確定度，在測量過程中須充分了解樣品的特性，優(yōu)化樣品的前處理方法，消解液轉移定容時少量多次清洗消解罐，盡可能徹底消解樣品并減少待測元素的損失。測量重復性帶來的不確定度主要受樣品前處理和測量儀器的影響[16]*，在實際工作中可通過增加樣品重復測定次數(shù)、定期對儀器進行維護保養(yǎng)和期間核查，提升儀器性能穩(wěn)定性等進行控制。

3 結論

采用FAAS法測定海帶中鐵、鋅的含量，并從樣品質量、樣品消解液定容體積、樣品溶液質量濃度、方法回收率、測量重復性、消化液稀釋因子等影響因素對測量結果的不確定度進行評定。結果表明：海帶樣品中鐵含量252 mg/kg時，其擴展不確定度為14 mg/kg（k=2）；鋅含量15.9 mg/kg時，其擴展不確定度為2.6 mg/kg（k=2）。在各不確定度分量中，由樣品溶液質量濃度引入的不確定度對測量結果影響最大，其次是方法回收率和測量重復性，而樣品消解液定容體積引入的不確定度影響最小。在樣品溶液質量濃度測定過程中，又以標準溶液配制和校準曲線擬合帶來的不確定度貢獻較大。因此，在海帶微量元素檢測過程中，要加強標準溶液配制的規(guī)范性和校準曲線的質量控制。