FAAS法測(cè)定海帶中微量元素的不確定度評(píng)定

劉蘭英，呂新，李瑩，羅土炎，上官亮，李玥仁*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所（福州 350003）；

2. 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州 350003）

海帶中含有豐富的膳食纖維、多糖、多酚等功能性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒及提高免疫力等多種藥理活性[1-2]*，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的海藻養(yǎng)殖品種。同時(shí)海帶還含有極豐富的微量元素，微量元素在維持生命及人體正常新陳代謝中發(fā)揮重要作用，其含量與海帶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)[3-4]*。因此，開展海帶中微量元素的檢測(cè)分析對(duì)于評(píng)估其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)[5]*，將測(cè)量不確定度引入海帶微量元素的檢測(cè)過程中，對(duì)于測(cè)量結(jié)果可信程度的評(píng)價(jià)很有必要。

現(xiàn)有方法主要是利用火焰原子吸收光譜法（FAAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測(cè)定食品中微量元素的含量。其中，關(guān)于FAAS法測(cè)定食品中微量元素的不確定度評(píng)定主要集中在飲用水[6-7]*、糧食[8-9]*、酒類[10-11]*、奶粉[12-13]*等方面。如：趙立群等[9]*對(duì)小麥粉中鋅的不確定度評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)量不確定度主要來源于方法回收率，其次是校準(zhǔn)曲線擬合和測(cè)量重復(fù)性；彭珍華等[10]*對(duì)葡萄酒中鐵的不確定度評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合；鐘加成等[13]*對(duì)嬰兒配方乳粉中鋅的不確定度評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)量不確定度主要來源于樣品溶液中鋅濃度的測(cè)定和測(cè)量重復(fù)性。然而在眾多研究中，關(guān)于海帶中微量元素測(cè)量不確定度的報(bào)道還比較欠缺。

試驗(yàn)以GB 5009.90—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鐵的測(cè)定》和GB 5009.14—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測(cè)定》為檢測(cè)依據(jù)，采用FAAS法對(duì)海帶中鐵、鋅2個(gè)微量元素進(jìn)行測(cè)定，參照J(rèn)JF1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》的要求和規(guī)定，對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行相應(yīng)分析，以期為海帶中微量元素含量檢測(cè)的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

海帶樣品（取自福州市連江縣某海帶養(yǎng)殖區(qū)）。

硝酸（優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL：國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AA-6880原子吸收光譜儀（日本島津公司）；G-400智能控溫電加熱器、TOPEX微波消解儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；AL204電子天平（梅特勒公司）。

1.3 樣品前處理

將海帶樣品烘干、粉碎混合均勻后，稱取0.3 g左右（精確至0.000 1 g）于微波消解內(nèi)罐中。加入5.0 mL硝酸溶液，置于微波消解儀中進(jìn)行消解，消解升溫程序：120 ℃保持5 min，160 ℃保持10 min，190℃保持20 min。消解結(jié)束后冷卻至室溫，取出消解內(nèi)罐，置于配套電加熱器中趕酸至1.0 mL左右，冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取適量鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL），用1%硝酸溶液稀釋配成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液；吸取適量此標(biāo)準(zhǔn)中間液，配成鐵的質(zhì)量濃度分別為0.0，0.05，0.1，0.2，0.4和0.6 μg/mL以及鋅的質(zhì)量濃度分別為0.0，0.1，0.2，0.4，0.8和1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.5 樣品測(cè)定

儀器預(yù)熱至穩(wěn)定后，將鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按質(zhì)量濃度由低到高的順序分別注入火焰原子化器，測(cè)定其吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再分別測(cè)定空白樣液和樣品溶液的吸光度，通過校準(zhǔn)曲線得到消解液中鐵、鋅的質(zhì)量濃度。

1.6 數(shù)學(xué)模型

海帶樣品中待測(cè)元素的數(shù)學(xué)模型見式（1）。

式中：X為試樣中待測(cè)元素含量，mg/kg；ρ為試樣溶液中待測(cè)元素的質(zhì)量濃度減去空白溶液中待測(cè)元素的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為試樣消化液定容體積，mL；f為試樣稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量結(jié)果

對(duì)海帶樣品進(jìn)行12次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 海帶樣品中鐵、鋅的測(cè)定結(jié)果

2.2 測(cè)量不確定度來源識(shí)別

根據(jù)檢測(cè)過程和數(shù)學(xué)模型，采用基本因果圖分析測(cè)量不確定度的來源（圖1）。海帶中鐵、鋅的測(cè)量不確定度分量主要來源有樣品質(zhì)量（m）、樣品消解液定容體積（V）、樣品溶液質(zhì)量濃度（ρ）、消化液稀釋因子（f）、樣品測(cè)量重復(fù)性（Rep）和方法回收率（Rec）。其中，測(cè)量重復(fù)性（Rep）包括樣品測(cè)定過程中稱量、定容等操作的重復(fù)性，為總試驗(yàn)的一個(gè)合成重復(fù)性分量。

圖1 海帶中鐵、鋅測(cè)量不確定度評(píng)定因果關(guān)系圖

2.3 測(cè)量不確定度分量的量化

2.3.1 樣品質(zhì)量（m）引入的不確定度

樣品稱量過程產(chǎn)生的不確定度主要由天平校準(zhǔn)和重復(fù)性2個(gè)分量組成，由于引入已確定的合成重復(fù)性，因此沒有必要考慮稱量的重復(fù)性。

試驗(yàn)樣品稱量所使用的天平為特種準(zhǔn)確度等級(jí)，從校準(zhǔn)證書上獲得，測(cè)量范圍在0～50 g時(shí)，天平的最大允許誤差為±0.5 mg，該不確定度分量需計(jì)算2次（皮重1次、毛重1次）。假設(shè)服從均勻分布，取包含因子3，則樣品稱量過程產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度試驗(yàn)海帶平均質(zhì)量為m=0.304 5 g，即304.5 mg，則樣品質(zhì)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)=0.408 2/304.5=0.001 34。

2.3.2 樣品消解液定容體積（V）引入的不確定度

樣品消解液定容過程產(chǎn)生的不確定度主要由容量瓶校準(zhǔn)、溫度效應(yīng)和體積重復(fù)性3個(gè)分量組成，同樣這里不考慮體積重復(fù)性。

2.3.2.1 容量瓶校準(zhǔn)所產(chǎn)生的不確定度

試驗(yàn)海帶樣品消解后使用25 mL容量瓶定容，所用容量瓶經(jīng)計(jì)量校準(zhǔn)均為合格，依據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，25 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.03 mL。按照CNAS GL006：2019推薦，玻璃器皿假定為三角分布，取包含因子6，得到由容量瓶校準(zhǔn)所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(V25)=

2.3.2.2 溫度效應(yīng)所產(chǎn)生的不確定度

試驗(yàn)使用的容量瓶校準(zhǔn)溫度為22.7 ℃，樣品消解液定容時(shí)環(huán)境溫度為25 ℃，液體的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4*℃-1*，則溫度波動(dòng)（2.3 ℃）產(chǎn)生的液體體積變化區(qū)間為±（25 mL×2.3 ℃×2.1×10-4*℃-1*）=±0.012 08 mL。假設(shè)服從均勻分布，得到由溫度效應(yīng)所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述2個(gè)分量合成，得到樣品消解液定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V25)=u12*(V25)+u22*(V25)=其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.3 樣品溶液質(zhì)量濃度（ρ）引入的不確定度

樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過程產(chǎn)生的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、校準(zhǔn)曲線擬合、檢測(cè)儀器校準(zhǔn)3個(gè)分量組成。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制所產(chǎn)生的不確定度urel(ρ1)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查得，鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備液的相對(duì)擴(kuò)展不確定度均為0.7%（包含因子k=2），換算成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρstock)=0.7%/2=0.003 5。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中，鐵、鋅元素使用到1 mL，5 mL移液器和50 mL容量瓶，分別進(jìn)行不確定度分析。

依據(jù)JJG196—2006規(guī)定，50 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.05 mL，同2.3.2的計(jì)算，得出由50 mL容量瓶定容所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V50)=0.000 494。從校準(zhǔn)證書上獲得，標(biāo)稱容量1 mL的移液器，在移取0.1，0.5和1.0 mL體積時(shí)的容量允差分別為±2.0%，±1.0%和±1.0%，因未給出移取0.25 mL體積的容量允差，故移取0.25 mL體積的容量允差取最大值±2.0%。標(biāo)稱容量5 mL的移液器，在移取0.5，2.5和5.0 mL體積時(shí)的容量允差分別為±1.0%，±0.5%和±0.6%，因未給出移取2.0，3.0和4.0 mL體積的容量允差，故移取2.0，3.0和4.0 mL體積的容量允差取最大值±1.0%。假設(shè)服從均勻分布，則各移液體積對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用50 mL容量瓶6次，1 mL移液器分別移取0.25 mL體積1次、0.5 mL體積2次、1.0 mL體積1次，5 mL移液器分別移取2.0 mL、3.0 mL體積各1次，故鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel2*(ρ1)=urel2*(ρstock)+6×urel2*(V50)+urel2*(0.25)+2×urel2*(0.5)+urel2*(1.0)+urel2*(2.0)+urel2*(3.0)=0.017 712*。鋅元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用50 mL容量瓶6次，1 mL移液器分別移取0.5 mL體積2次、1.0 mL體積1次，5 mL移液器分別移取2.0、4.0、5.0 mL體積各1次，故鋅元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uZn,rel2*(ρ1)=urel2*(ρstock)+6×urel2*(V50)+2×urel2*(0.5)+urel2*(1.0)+urel2*(2.0)+urel2*(4.0)+urel2*(5.0)=0.013 862*。

2.3.3.2 校準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度urel(ρ2)

采用FAAS法測(cè)定海帶中的鐵、鋅含量，分別對(duì)配制的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行3次測(cè)定，得到相應(yīng)吸光度，結(jié)果如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液測(cè)定結(jié)果

對(duì)海帶樣品消解液進(jìn)行12次測(cè)量后，由吸光度求得樣品中鐵、鋅的平均質(zhì)量濃度：ρFe=0.307 μg/mL；ρZn=0.194 μg/mL（表1），則此過程帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：SR為曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Yj為第i個(gè)校準(zhǔn)溶液的第j次吸光度；Xi為擬合曲線第i個(gè)校準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；B1為曲線斜率；B0為曲線截距；n為測(cè)量校準(zhǔn)溶液的次數(shù)，n=18；P為測(cè)量樣品溶液的次數(shù)，P=12；為擬合曲線各校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的平均值（n次）。mL；鋅元素SR=0.02046，?=0.417 μg/mL。

計(jì)算得到：鐵元素SR=0.00131，=0.225 μg/

將各值代入u(ρ2)的計(jì)算中，得出由校準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，分別為uFe(ρ2)=0.004 23 μg/mL，uZn(ρ2)=0.014 64 μg/mL。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel(ρ2)=0.013 78，uZn,rel(ρ2)=0.075 46。

2.3.3.3 儀器校準(zhǔn)所產(chǎn)生的不確定度urel(ρ3)

根據(jù)火焰原子吸收光譜儀檢定證書，其擴(kuò)展不確定度為0.004 μg/mL（包含因子k=2），換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ3)=0.004/2=0.002 μg/mL，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為uFe,rel(ρ3)=0.006 51，uZn,rel(ρ3)=0.010 31。

合并3個(gè)分量，則樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(ρ)=計(jì)算得到uFe,rel(ρ)=0.023 36，uZn,rel(ρ3)=0.077 41。

2.3.4 方法回收率（Rec）引入的不確定度

對(duì)海帶中鐵、鋅進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為75 μg和4.5 μg，6次回收試驗(yàn)的加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。根據(jù)貝塞爾公式，回收率試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為計(jì)算得到sFe(Rec)=3.00%、sZn(Rec)=5.39%。則方法回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為計(jì)算得到uFe(Rec)=1.23%，uZn(Rec)=2.20%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel(Rec)=0.011 39，uZn,rel(Rec)=0.020 19。

表3 海帶樣品加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果

2.3.5 測(cè)量重復(fù)性（Rep）引入的不確定度

在相同條件下，對(duì)同一海帶樣品進(jìn)行12次獨(dú)立的重復(fù)測(cè)定（表1），同2.3.4的計(jì)算，得出重復(fù)性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為sFe(Rep)=8.623 5 mg/kg，sZn(Rep)=0.409 0 mg/kg。則樣品重復(fù)性測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe(Rep)=2.489 4 mg/kg，uZn(Rep)=0.118 1 mg/kg，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel(Rep)=0.009 88，uZn,rel(Rep)=0.007 43。

2.3.6 消化液稀釋因子（f）引入的不確定度

試驗(yàn)海帶測(cè)定過程中，因樣品消化液中鐵含量超出校準(zhǔn)曲線的線性范圍，故對(duì)消化液進(jìn)行10倍稀釋，用1 mL移液器移取1 mL測(cè)試液到10 mL容量瓶中，定容至刻度，則稀釋因子帶來的不確定度主要由稀釋過程中容量瓶定容和使用移液器引起的不確定度分量組成。其中，移液器移取體積所產(chǎn)生的不確定度同2.3.3的計(jì)算，可知urel(1.0)=0.005 77。依據(jù)JJG196—2006規(guī)定，10 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.02 mL，同2.3.2的計(jì)算，得出由10 mL容量瓶定容所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V10)=0.000 862，故鐵元素由消化液稀釋因子引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uFe,rel2*(f)=urel2*(V10)+urel2*(1.0)=0.005 832*。

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合各不確定度分量，試驗(yàn)海帶中鐵、鋅含量測(cè)定的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為計(jì)算得到鐵元素ucrel(X)=0.028 47，鋅元素ucrel(X)= 0.080 42。

海帶經(jīng)重復(fù)測(cè)定12次后，樣品中各元素的平均含量分別為XFe=252 mg/kg，XZn=15.9 mg/kg（表1），其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(X)=ucrel(X)×X，計(jì)算得到鐵元素uc(X)=7.174 4 mg/kg，鋅元素uc(X)=1.278 7 mg/kg。

2.5 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)CNAS GL006：2019推薦，取95%的置信水平，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度U=kuc(X)，計(jì)算得到鐵元素U=14 mg/kg，鋅元素U=2.6 mg/kg。

2.6 各不確定度分量的相對(duì)貢獻(xiàn)

從各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可知，影響海帶中鐵、鋅含量檢測(cè)結(jié)果不確定度的最大因素是樣品溶液質(zhì)量濃度，其次為方法回收率、測(cè)量重復(fù)性。相關(guān)研究在食用植物油微量元素的不確定度評(píng)定中也得到相似結(jié)果[14]*。與彭珍華等[10]*的研究結(jié)果相似，試驗(yàn)在樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過程中，又以標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分量較大。

通過對(duì)比移液器在移取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)引入的不確定度發(fā)現(xiàn)，移液器在移取低體積溶液時(shí)，其產(chǎn)生的不確定相對(duì)更大些，這與所用移液器的體積誤差有關(guān)，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)，要特別加強(qiáng)各種規(guī)格移液器的計(jì)量檢定，盡量移取較大體積的溶液，以減少此過程引入的不確定度。對(duì)于校準(zhǔn)曲線的質(zhì)量控制，可通過選擇適當(dāng)濃度梯度的工作曲線，盡可能使待測(cè)元素濃度靠近曲線的中間位置，從而減少由此引入的不確定度。此外，通過使用精密度更高的器具配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、增加工作曲線各濃度點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)也可在一定程度上降低不確定度的引入[15]*。為降低方法回收率帶來的不確定度，在測(cè)量過程中須充分了解樣品的特性，優(yōu)化樣品的前處理方法，消解液轉(zhuǎn)移定容時(shí)少量多次清洗消解罐，盡可能徹底消解樣品并減少待測(cè)元素的損失。測(cè)量重復(fù)性帶來的不確定度主要受樣品前處理和測(cè)量?jī)x器的影響[16]*，在實(shí)際工作中可通過增加樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)、定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)和期間核查，提升儀器性能穩(wěn)定性等進(jìn)行控制。

3 結(jié)論

采用FAAS法測(cè)定海帶中鐵、鋅的含量，并從樣品質(zhì)量、樣品消解液定容體積、樣品溶液質(zhì)量濃度、方法回收率、測(cè)量重復(fù)性、消化液稀釋因子等影響因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果表明：海帶樣品中鐵含量252 mg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為14 mg/kg（k=2）；鋅含量15.9 mg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為2.6 mg/kg（k=2）。在各不確定度分量中，由樣品溶液質(zhì)量濃度引入的不確定度對(duì)測(cè)量結(jié)果影響最大，其次是方法回收率和測(cè)量重復(fù)性，而樣品消解液定容體積引入的不確定度影響最小。在樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過程中，又以標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合帶來的不確定度貢獻(xiàn)較大。因此，在海帶微量元素檢測(cè)過程中，要加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的規(guī)范性和校準(zhǔn)曲線的質(zhì)量控制。