穇子多酚的分離純化及其抗氧化能力研究

黃月 ，向海芹，王雙輝，龔意輝，陳致印*

1. 湖南人文科技學院農業(yè)與生物技術學院（婁底 417000）；2. 海南大學食品科學與工程學院（?？?570228）

穇子為一年生禾本科穇屬草本植物，又名龍爪稷、雞爪谷、龍爪粟等，廣泛分布于熱帶地區(qū)，我國長江以南及西藏、安徽、河南、湖南、廣西等地均有種植[1-2]*。穇子的種子為球形，表面具有一層難以去除的種皮，其棕色穇子皮含有較高的多酚類物質（其中苯甲酸衍生物約占85%），使穇子具有抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤等諸多功能[3-7]*。多酚是具有苯環(huán)并結合多個羥基化學結構的化合物總稱，常以酚酸類、黃酮類、單寧類和花色苷類化合物形式存在，具有很強的抗氧化作用，是一類值得開發(fā)的天然抗氧化劑[8-9]。

穇子多酚作為穇子的重要功能成分，許多研究表明[10-13]*，穇子多酚具有較強的體外抗氧化能力和抗菌活性，可有效延緩花生油的氧化作用和龍眼的采后生理活動，對金黃色葡萄球菌等食源性微生物具有抗菌作用。穇子多酚的提取是其應用的前提，王雙輝等[10]*采用超聲波輔助雙水相法提取穇子多酚，得率是3.191 5 mg/g。王樂等[14]*發(fā)現穇子多酚共有11種酚類物質且不同溶劑提取的組分不盡相同。然而，關于穇子多酚純化方面的研究鮮有報道。大孔樹脂作為一種天然的聚合物吸附劑，具有較高的孔隙率、良好的穩(wěn)定性、較好的選擇性等特點，常被用于天然活性成分的分離純化。

試驗以穇子為原料，采用乙醇輔助生物酶法提取穇子多酚，并用A-21型大孔樹脂對粗提液進行純化，以抗壞血酸為陽性對照，測定穇子多酚粗提液、穇子多酚純化組分抗氧化能力大小，為進一步探究穇子多酚的生物活性提供基礎。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料與試劑

穇子（湖南省新化縣湖南隆慶農業(yè)開發(fā)有限公司）；抗壞血酸標準品（HPLC＞98%）、沒食子酸標準品（HPLC＞98%）：北京索萊寶科技有限公司；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（50 U/mg）、乙醇（分析純）、大孔樹脂（A-21）、無水三氯化鐵（AR）、石油醚（60～90 ℃，分析純）、無水碳酸鈉（AR）、二水合磷酸二氫鈉（AR）、無水磷酸氫二鈉（AR）、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵（AR）、三氯乙酸（AR）：上海麥克林生化科技有限公司；福林-酚試劑（SL9010）、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚：北京酷來博科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：奧默生物技術（上海）有限公司；氯化氫、過氧化氫、硫酸（均為分析純，湖南匯虹試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器與設備

電子天平（FA2004型，上海良平儀器儀表有限公司）；紫外分光光度計（754型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ5200DB型，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（101型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050型，鞏義市予華儀器有限責任公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-8型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；旋轉蒸發(fā)器（RE-52C型，鞏義市予華儀器有限責任公司）；循環(huán)水式真空泵（SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限責任公司）；離心機（TD5Z型，湖南凱達科學儀器有限公司）；萬能高速粉碎機（DE-500 g，浙江紅景天工貿有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 穇子多酚的粗提

新鮮穇子粉碎過0.425 mm孔徑（40目）篩后脫脂，取脫脂穇子粉末于錐形瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入酶液（酶濃度1%，W纖維素酶∶W果膠酶=7∶3），在60 ℃恒溫水浴酶解2 h，后用4 000 r/min離心15 min，得第1份上清液，用適量的70%乙醇溶液洗滌濾渣，在同樣條件下離心得第2份上清液，將2次上清液合并后于45 ℃旋蒸，去除有機溶劑后得粗提液[15]*。

1.3.2 穇子多酚的純化

大孔樹脂預處理：將大孔樹脂置于燒杯中，加入無水乙醇蓋過大孔樹脂，攪拌排出氣泡，靜置24 h后用蒸餾水潤洗至無乙醇味即可，剩余大孔樹脂浸泡在無水乙醇中，在4～9 ℃冰箱中保存，備用[16]*。

參照曹雪文[17]*的方法，稍作修改。稱取20.0 g預處理好的大孔樹脂濕法裝柱，連續(xù)加入去離子水，使大孔樹脂在柱內均勻充分緊實，將25 mL穇子多酚粗提液緩慢加入層析柱中，控制流速1 滴/s，收集流出液并測定其多酚濃度，用50 mL去離子水、乙醇（質量分數20%～95%）進行梯度洗脫，同樣控制流速在1 滴/s，用試管定量收集洗脫液，每管5 mL，共收集50管，待測，繪制洗脫曲線。

1.3.3 多酚含量的測定

參照王樂等[14]*的方法，稍加修改。分別取1 mL水和沒食子酸標準液（10，20，30，40和50 μg/mL）于具塞試管，加入1 mL福林酚試劑，搖勻靜置5 min，加入4 mL質量分數10%的碳酸鈉溶液，于25 ℃水浴加熱反應1 h后，在波長760 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，繪制沒食子酸標準曲線圖。

取1 mL待測樣品液于具塞試管中，加入1 mL福林酚試劑，后續(xù)同上。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

在楊立鳳等[18]*的方法上進行一定調整。精密稱取10 mg DPPH，用乙醇溶液溶解，定容到50 mL，制成質量濃度0.2 mg/mL的工作液，于4 ℃避光保存。分別吸取2 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于具塞試管中，加入2 mL DPPH溶液，渦旋振蕩搖勻，避光反應30 min后，在517 nm處測定吸光度，所有試驗重復3次，下同。清除率計算如式（1）所示。

式中：A1為樣品測定的吸光度；A2為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.3.5 羥基自由基（·OH）清除能力的測定

在閆旭宇等[19]*的方法上稍作修改。分別精確移取2 mL穇子多酚粗提溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于試管中，加入濃度同樣為6 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸和過氧化氫溶液，各2 mL，于37 ℃水浴加熱反應20 min后，在波長510 nm處測定吸光度A1。根據式（2）計算清除率。

式中：A1為樣品測定的吸光度；A2為蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度；A3為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.6 超氧根（O2-*）清除能力的測定

參照Chen等[20]*的方法，稍加修改。分別取0.2 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于試管中，加入5.7 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.20）和0.1 mL鄰苯三酚溶液（6 mmol/L），混勻后在室溫反應6 min，加入0.1 mol/L的HCl溶液終止反應，在320 nm處測定吸光度A1。清除率計算同式（1）。

1.3.7 Fe3+*還原能力的測定

參照胡棟寶等[21]*的方法并稍加完善。分別取0.5 mL穇子多酚粗提液、穇子多酚純化組分、VC溶液于具塞試管中，分別加入2.0 mL pH 6.6磷酸緩沖溶液和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃水浴中加熱20 min，加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，避光靜置6 min后，在700 nm處測定吸光度。

1.3.8 ABTS+*自由基清除能力

參照Shen等[22]*的方法，加以修改。取7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，各100 mL，混勻，避光反應12～16 h得ABTS母液。取ABTS母液，用蒸餾水稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02，生成ABTS工作液。分別取1 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于試管中，加入4 mL ABTS工作液，避光反應6 min，于734 nm測定其吸光度A1。清除率計算同式（2）。

1.3.9 數據處理與分析

試驗數據均采用Excel整理，使用GraphPad prism 6進行繪圖和方差分析，進行Multiple comparisons和t檢驗，分析差異的統(tǒng)計顯著性，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

根據1.3的方法，繪制沒食子酸標準曲線，見圖1。沒食子酸的回歸方程為y=0.011 62x-0.018 6，R2*=0.997 2，表明其能夠較好地擬合穇子多酚含量的計算。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 柱層析分析

穇子多酚粗提液洗脫曲線如圖2所示。穇子多酚粗提液經去離子水、乙醇（質量分數20%～95%）梯度洗脫后得到3個組分FMP-1、FMP-2和FMP-3（圖中按出峰順序依次命名），其中：FMP-2的出峰時間雖然較晚，但峰面積大，說明該組分多酚含量較高，純化效果較好；FMP-1和FMP-3這2個組分的出峰所需時間較長，且峰面積小，說明多酚含量低，因此后續(xù)不對其進行分析。同時，經過圖1回歸方程得出，粗提液穇子多酚濃度為113.22 μg/mL，經過柱層析后，純化組分為220.30 μg/mL。

圖2 穇子多酚柱層析洗脫曲線

2.3 DPPH自由基清除能力

穇子多酚粗提液、穇子多酚純化液FMP-2及VC溶液的DPPH自由基清除能力如圖3所示。在20～100 μg/mL濃度范圍內，三者的清除效果均在70%～72%之間，并與濃度呈正相關。VC溶液的DPPH自由基清除效果優(yōu)于穇子多酚純化液FMP-2及粗提液，且隨著濃度的增加，穇子多酚FMP-2的清除率逐漸上升，并接近于VC溶液，不存在顯著性差異，但與粗提液之間在各濃度都存在顯著差異（P＜0.05）。這與胡會剛等[23]*研究發(fā)現菠蘿皮渣多酚經純化后的DPPH抗氧化活性明顯提高相一致，這可能是由于較高純度的FMP-2結構比粗提物更容易與DPPH自由基匹配。

圖3 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對DPPH自由基的清除效果

2.4 羥基自由基（·OH）清除能力

穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對·OH自由基清除能力如圖4所示。濃度在20～100 mg/mL時，隨著濃度的上升，穇子多酚純化液FMP-2和粗提液清除·OH自由基的效率明顯上升，且兩者之間存在顯著差異（P＜0.05），穇子多酚純化組分FMP-2與VC溶液的清除效果相當，都明顯高于粗提液，該結果與穇子多酚抗氧化活性的研究[10-11]*結論基本一致。這可能是由于FMP-2和VC轉移氫給自由基的效率相差不大，而粗提液含有較多雜質成分，導致其清除效果不如FMP-2和VC。

圖4 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對·OH自由基清除能力

2.5 超氧根（O2-*）清除能力

超氧根清除率如圖5所示。穇子多酚純化液FMP-2隨著濃度的上升，其清除超氧根（O2-*）的效率相差不大，基本恒定在80%左右，與VC效果相當，而粗提液隨著濃度的上升，清除效率大幅上升，濃度由20 mg/mL上升到100 mg/mL時，清除率從20%多陡增至60%以上。這可能是由于粗提液中含有其他成分，對超氧根清除率存在影響。

圖5 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對超氧根（O2-*）的清除效果

2.6 Fe3+*還原能力

FRAP鐵離子還原法常用于測定物質的總抗氧化活性，其原理是測定物質將Fe3+*還原成Fe2+*的能力，以此來反映物質的抗氧化活性[24]*。由圖6可知，穇子多酚粗提液、穇子多酚純化液FMP-2及VC溶液對Fe3+*還原能力都與濃度呈正相關。溶液濃度從20 μg/mL上升至100 μg/mL時，穇子多酚純化液FMP-2的吸光度增大最多，從0.400增大到1.017，而粗提液的吸光度增長不大，VC也呈現階段性增長，且三者之間兩兩都具有顯著性差異（P＜0.05），可能的原因是穇子多酚經純化后去除了大部分雜質，對鐵離子的清除作用明顯增強，而粗提液中雜質太多，對Fe3+*還原存在一定影響，導致還原能力并無大幅變化。

圖6 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對Fe3+*的還原能力

2.7 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基的苯并噻唑結構具有兩親性，故ABTS自由基的消除可通過轉移氫或轉移電子實現[25]*。穇子多酚粗提液、穇子多酚純化液FMP-2及VC溶液對ABTS自由基的清除能力如圖7所示。濃度在80%以下時，VC對ABTS自由基的清除率不足4%，遠低于穇子多酚的清除率。穇子多酚粗提液在不同濃度下對ABTS自由基的清除率都在80%以上，且變化不大，但與穇子多酚純化液FMP-2之間存在顯著差異（P＜0.05）。穇子多酚純化液FMP-2隨著濃度的上升，其清除率也成倍增加，從6%增加到50%以上。穇子多酚粗提液遠高于穇子多酚純化液，可能是粗提液中還有其他成分，更容易與ABTS自由基結合[25]*。特別注意的是，VC濃度80 μg/mL時，其清除率不到2%，濃度100 μg/mL時，清除率升至99.88%，這可能是由于低濃度的VC溶液對ABTS自由基的清除效果極其微弱，而到一定濃度時就會表現出較強的清除效果[26]*。

圖7 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對ABTS自由基的效果

3 結論

以乙醇輔助生物酶法提取穇子多酚，采用A-21型大孔樹脂對多酚粗提液進行純化，純化后穇子多酚含量由113.22 μg/mL提升至220.30 μg/mL，王雙輝等[10]*采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取穇子多酚，得率為3.191 5 mg/g。王樂等[14]*采用酸性乙醇浸提法提取穇子多酚，得率為118.91 mg/mL。試驗多酚得率比這2個結果都低，這可能是由于提取方法不同所導致。

經過純化后的穇子多酚純化液，對DPPH自由基清除能力、羥基自由基（·OH）清除能力、超氧根（O2-*）清除能力、Fe3+*還原能力較粗提液有明顯的提升。這可能是由于粗提液經純化后，去除大部分雜質所導致。對于穇子多酚純化液的純度、組分、結構及性質，需通過進一步研究分析，才能闡述其作用機理。