沒(méi)藥中2 個(gè)新倍半萜類(lèi)化合物

梁乃允，黃惠銘，王超超，裴鈺潔，王勃開(kāi)，杜 夢(mèng)，霍會(huì)霞，宋月林，鄭 姣，趙云芳*，李 軍,*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)藥研究院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029

沒(méi)藥為橄欖科（Burseraceae）沒(méi)藥屬CommiphoraJacq.植物地丁樹(shù)Commiphora myrrhaEngl.或哈地丁樹(shù)C.molmolEngl.的干燥樹(shù)脂，分為天然沒(méi)藥和膠質(zhì)沒(méi)藥，其味辛、苦，性平，具有散瘀定痛、消腫生肌等功效，用于胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經(jīng)經(jīng)閉等病癥[1]。沒(méi)藥在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)藥用歷史悠久，常與乳香相須入伍使用，常見(jiàn)復(fù)方應(yīng)用有七厘散、西黃丸、天和追風(fēng)膏、活血壯筋丸等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沒(méi)藥的化學(xué)成分和藥理活性進(jìn)行大量的研究工作，其化學(xué)成分主要包括萜類(lèi)、甾體類(lèi)、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)[2]等，藥理活性包括細(xì)胞毒[3]、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化抗菌[4]、保肝[5]等。本課題組前期從沒(méi)藥的正己烷提取部位中分離鑒定了倍半萜及其二聚體[3,6]，為了進(jìn)一步闡明沒(méi)藥的化學(xué)成分，本研究繼續(xù)對(duì)其正己烷提取部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，分離鑒定了8 個(gè)倍半萜類(lèi)化合物，分別為(4R,5S)-呋喃杜松-6(1),7(8),9(10)-三烯-5-醇乙酸酯[(4R,5S)-furanocadina-6-(1),7(8),9(10)-triene-5-ol acetate，1]、(1E,3S,4R,8S)-吉瑪-3-甲氧基-8-羥基-1,10(15),7(11)-三烯-6-羰基-8,12-內(nèi)酯 [(1E,3S,4R,8S)-germacra-3-methyoxy-8-hydroyl-1,10(15),7(11)-trien-6-oxo-8,12-olide，2]、gajutsulactone A（3）、1-hydroxyeudesma-3,7(11)-dien-8-one（4）、1-hydroxyeudesma-4(14),7(11)-dien-8-one（5）、5β-10α-hydroxy-2α-methoxy-6-oxoguaia-7(11),8-dien-8,12-olide（6）、(2R,4R,5S)-2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉瑪-1(10)E-烯-6-酮 [(2R,4R,5S)-2-methyoxy-5-acetoxy-furanogermacr-1(10)E-en-6-one，7]、1(10)Z,4Z-蓬莪術(shù)二烯-6-酮 [1(10)Z,4Z-furanodiene-6-one，8]。其中化合物1 和2 為新化合物，化合物3～5 為首次從沒(méi)藥屬植物中分離得到?；衔? 對(duì)人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為（4.43±1.39）μmol/L。

1 儀器與材料

UH5300 型分光光度計(jì)；Nexus-470 FTIR 傅里葉變換紅外光譜儀；Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Varian Inova-500型核磁共振儀（美國(guó)Varian 公司），AVANCE NEO 400 型核磁共振儀（德國(guó) Bruker 公司）；島津LC-20AT 半制備型高效液相（日本島津公司）；Shimadzu LC-20AT 型半制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ZF-1 型三用紫外分析儀（江蘇海門(mén)市其林貝耳儀器制造有限公司）；CAPCELL-pak-C18半制備HPLC 色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；柱色譜用硅膠（200～300 目）及薄層色譜用GF254硅膠預(yù)制板均為青島海洋化工廠生產(chǎn)，ODS（40～63 μm，德國(guó)Merck公司），SephadexTMLH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司）；提取分離所用石油醚、正己烷、二氯甲烷、醋酸乙酯、無(wú)水乙醇、甲醇等試劑為西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)，均為分析純。高效液相所用溶劑（甲醇、乙腈）為色譜純，水為超純水。

沒(méi)藥于2018 年12 月購(gòu)自北京市華邈藥業(yè)有限公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心屠鵬飛教授鑒定為地丁樹(shù)C.myrrhaEngl.的干燥樹(shù)脂，樣品標(biāo)本（DD4271）存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心。

2 方法

2.1 提取與分離

沒(méi)藥（3.0 kg）粉碎后，依次用正己烷、二氯甲烷、95%乙醇回流提?。?×10 L，每次2 h），分別合并提取液，減壓回收溶劑得到正己烷提取物651.0 g、二氯甲烷提取物511.0 g、95%乙醇提取物90.0 g。

正己烷提取物525.0 g 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（1∶0～0∶1）梯度洗脫得到21 個(gè)流分（Fr.A～U）。Fr.D（7.0 g）采用硅膠柱色譜分離，正己烷-二氯甲烷（2∶1～0∶1）梯度洗脫，得到5個(gè)流分（Fr.D1～D5）。Fr.D1 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-二氯甲烷（5∶1～0∶1）梯度洗脫，得到5個(gè)流分（Fr.D1a～D1e）。Fr.D1g 經(jīng) Sephadex LH-20柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到6個(gè)流分（Fr.D1g1～D1g6），F(xiàn)r.D1g3 用半制備液相（乙腈-水55∶45）純化得到化合物2（tR=27.0 min，3.9 mg）。Fr.E（5.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（80∶1～0∶1）梯度洗脫得到14 個(gè)流分（Fr.E1～E14）。Fr.E2 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（80∶1）等度洗脫得到化合物6（5.2 mg）。Fr.E9 經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（60∶1）等度洗脫得到化合物3（4.6 mg）。Fr.E14 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（80∶1～0∶1）梯度洗脫得到11 個(gè)流分（Fr.E14a～E14k）。Fr.E14k經(jīng)半制備液相（乙腈-水40∶60）純化得到化合物5（tR=27.0 min，8.2 mg）和4（tR=29.5 min，5.4 mg）。Fr.G（16.0 g）經(jīng)ODS 柱色譜，甲醇-水（70∶30～100∶0）梯度洗脫得到17 個(gè)流分（Fr.G1～G17）。Fr.G9 有不溶物析出，甲醇洗滌后得化合物7（10.2 mg）。Fr.G6 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（20∶1～0∶1）梯度洗脫得到10 個(gè)流分（Fr.G6a～G6j）。Fr.G6j 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（30∶1）等度洗脫得到化合物8（5.6 mg）。Fr.L（15.0 g）經(jīng)ODS 柱色譜，甲醇-水（70∶30～100∶0）梯度洗脫得到17 個(gè)流分（Fr.L1～L17）。Fr.L2 經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-醋酸乙酯（10∶1～0∶1）梯度洗脫得到11 個(gè)流分（Fr.L2a～L2k）。Fr.L2f經(jīng)半制備液相（乙腈-水45∶55）純化得到化合物1（tR=44.0 min，2.0 mg）。

2.2 化合物1 和2 的化學(xué)計(jì)算

對(duì)化合物1 和2 的計(jì)算ECD 實(shí)驗(yàn)包括構(gòu)象分析、圖譜計(jì)算和圖譜擬合3 個(gè)步驟。首先利用Chemdraw 3D對(duì)化合物1和2進(jìn)行能量最小化操作，得到初始構(gòu)象；接著采用Sybyl 2.0 軟件進(jìn)行優(yōu)勢(shì)構(gòu)象搜索，選擇能量≤最小能量+6 的構(gòu)象。利用Gaussian 軟件，根據(jù)密度泛函理論DFT，采用密度函數(shù)B3LYP 和6-31G 基組，CPCM 模型對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，再結(jié)合較大基組（6-31G，d）計(jì)算每個(gè)構(gòu)象的ECD 圖譜。最后分析數(shù)據(jù)，擬合圖譜。用SpecDis 軟件打開(kāi)化合物1 和2 每個(gè)構(gòu)象的ECD圖譜，根據(jù)每個(gè)構(gòu)象的玻爾茲曼權(quán)重因子，將所有能量分部率符合的構(gòu)象按照玻爾茲曼能量分布進(jìn)行擬合、生成圖譜并與化合物1 和2 的實(shí)驗(yàn)圖譜比較，確定化合物1 和2 的絕對(duì)構(gòu)型[7]。計(jì)算NMR 時(shí)，采用GIAO 方法，計(jì)算時(shí)采用的泛函與基組為B3LYP/6-31G（d，p），并搭配CPCM 甲醇的溶劑模型，對(duì)化合物的核磁共振碳原子的屏蔽常數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，將計(jì)算結(jié)果利用DP4+可能性分析方法分析其與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的可能性百分比，從而確定化合物結(jié)構(gòu)[8]。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵的HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 相關(guān)Fig.1 Structure and key HMBC,1H-1H COSY and NOESY correlations of compound 1

圖2 化合物1 的實(shí)驗(yàn)ECD 和計(jì)算ECD 圖譜Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

表1 化合物1 和2 的核磁共振氫譜 (500/400 MHz) 和碳譜 (125/100 MHz) 數(shù)據(jù) (CDCl3)Table 1 1H-NMR (500/400 MHz) and 13C-NMR (125/100 MHz) data of compounds 1 and 2 in CDCl3

圖3 化合物2 的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵的HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 相關(guān)Fig.3 Structure and key HMBC,1H-1H COSY and NOESY correlations of compound 2

圖4 化合物2 的實(shí)驗(yàn)ECD 和計(jì)算ECD 圖譜Fig.4 Experimental and calculated ECD spectra of compound 2

化合物3：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z: 235.18 [M+H]+，分子式為C15H22O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.76 (1H,m,H-9a),4.75 (1H,m,H-9b),2.47 (1H,d,J=13.0 Hz,H-6a),2.26 (1H,ddd,J=8.0,8.0,8.0 Hz,H-1),2.20 (3H,m,H-13),2.14 (1H,d,J=13.0 Hz,H-6b),2.05 (1H,m,H-5),1.94 (1H,m,H-3a),1.93 (1H,m,H-2a),1.86 (1H,m,H-3b),1.84 (3H,s,H-12),1.72 (3H,brs,H-14),1.68 (1H,m,H-2b),1.23(3H,s,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 167.5(C-8),152.4 (C-11),145.9 (C-10),119.8 (C-7),110.6(C-9),85.4 (C-4),47.6 (C-1),45.7 (C-5),36.8 (C-3),27.0 (C-6),26.8 (C-2),23.8 (C-13),23.5 (C-12),19.6(C-14),19.6 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物3 為gajutsulactone A。

化合物4：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z: 235.16[M+H]+，分子式為C15H22O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.37 (1H,m,H-3),3.61 (1H,dd,J=10.0,6.0 Hz,H-1),2.79 (1H,dd,J=15.2,4.8 Hz,H-2a),2.17 (1H,m,H-2b),2.61 (1H,dd,J=16.0 Hz,H-9a),2.21 (1H,dd,J=16.0 Hz,H-9b),2.01 (3H,s,H-13),1.85 (3H,s,H-12),1.68 (3H,s,H-14),0.83 (3H,s,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 202.6 (C-8),147.3 (C-11),134.3 (C-4),130.3 (C-7),120.7 (C-3),75.0 (C-1),52.1 (C-9),44.0 (C-5),38.6 (C-10),31.9(C-2),29.0 (C-6),23.9 (C-13),23.3 (C-12),20.7 (C-14),11.2 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15-16]，故鑒定化合物4 為1-hydroxyeudesma-3,7(11)-dien-8-one。

化合物5：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z: 235.16 [M+H]+，分子式為C15H22O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.90 (1H,brs,H-14a),4.63 (1H,brs,H-14b),3.54(1H,dd,J=11.8,4.6 Hz,H-1),2.71 (1H,dd,J=14.8 Hz,H-9a),2.21 (1H,dd,J=14.8 Hz,H-9b),2.00 (3H,s,H-13),1.82 (3H,s,H-12),0.75 (3H,s,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 203.1 (C-8),147.2(C-4),143.3 (C-11),130.9 (C-7),108.5 (C-14),78.2(C-1),53.8 (C-9),45.0 (C-5),42.6 (C-10),34.3 (C-3),31.5 (C-2),28.8 (C-6),23.4 (C-13),22.4 (C-12),11.1(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15-16]，故鑒定化合物5 為1-hydroxyeudesma-4(14),7(11)-dien-8-one。

化合物6：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z: 231.12 [MH]-，分子式為C16H20O5。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.94 (1H,s,H-9),3.97 (1H,m,H-2),3.28 (3H,s,2-OCH3),2.85～2.79 (1H,m,H-4),2.36～2.32 (1H,m,H-1),2.36～2.32 (1H,m,H-5),2.30 (3H,s,H-13),2.02～1.97 (1H,m,H-3a),1.42～1.35 (1H,m,H-3b),1.40 (3H,s,H-14),1.07 (3H,d,J=7.2 Hz,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 193.7 (C-6),169.1(C-12),144.9 (C-7),139.3 (C-8),137.9 (C-11),121.5(C-9),82.3 (C-2),72.6 (C-10),60.4 (C-5),57.3 (C-1),56.5 (2-OCH3),39.2 (C-3),31.6 (C-4),22.7 (C-14),19.7 (C-15),11.1 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物6 為5β-10α-hydroxy-2αmethoxy-6-oxoguaia-7(11),8-dien-8,12-olide。

化合物7：白色粉末，ESI-MSm/z: 321.16 [M+H]+，分子式為C18H24O5。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 7.02 (1H,s,H-12),5.51 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.21 (1H,d,J=9.6 Hz,H-1),4.12 (1H,m,H-2),3.63(1H,d,J=16.8 Hz,H-9a),3.30 (1H,d,J=16.8 Hz,H-9b),3.24 (3H,s,2-OCH3),2.36 (1H,m,H-4),2.02(3H,s,5-OCOCH3),1.94 (3H,s,H-15),1.91 (3H,s,H-13),1.89 (1H,m,H-3a),1.87 (1H,m,H-3b),1.07(3H,d,J=7.2 Hz,H-14)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 195.7 (C-6),170.5 (5-OCOCH3),154.5(C-8),137.8 (C-12),135.2 (C-10),132.8 (C-1),123.3(C-7),121.3 (C-11),79.2 (C-5),73.8 (C-2),56.0(2-OCH3),38.2 (C-9),37.9 (C-3),30.8 (C-4),20.8(5-OCOCH3),19.0 (C-15),17.4 (C-14),8.8 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物7 為(2R,4R,5S)-2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉瑪-1(10)E-烯-6-酮。

化合物8：白色粉末，ESI-MSm/z: 231.14 [M+H]+，分子式為C15H18O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 7.05 (1H,brs,H-12),5.84 (1H,brs,H-5),5.25 (1H,t,J=8.0 Hz,H-1),3.57 (1H,d,J=16.0 Hz,H-9a),3.03 (1H,d,J=16.0 Hz,H-9b),2.25 (2H,m,H-2),2.16 (3H,brs,H-13),1.79 (2H,m,H-3),1.73 (3H,brs,H-14),1.63 (3H,brs,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 193.6 (C-6),161.6 (C-8),141.0 (C-4),138.6(C-12),134.2 (C-10),129.2 (C-1),124.0 (C-5),123.0(C-7),121.5 (C-11),36.4 (C-2),32.9 (C-9),26.2(C-3),22.7 (C-14),19.3 (C-15),9.6 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，故鑒定化合物8 為1(10)Z,4Z-蓬莪術(shù)二烯-6-酮。

4 生物活性測(cè)定

用MTT 法[20]測(cè)試化合物1～8 對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，化合物5 對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，在40 μmol/L 濃度下對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（89.50±1.29）%，其IC50為（4.43±1.39）μmol/L [陽(yáng)性對(duì)照藥5-FU的IC50為（27.4±1.90）μmol/L]，化合物7 和8 具有一定的細(xì)胞增殖抑制活性，其在40 μmol/L 濃度下對(duì) HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為（55.16±2.50）%、（51.00±6.90）%?；衔?～4 和6 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖無(wú)明顯的抑制作用。

5 討論

沒(méi)藥中含有豐富的萜類(lèi)化合物，其中倍半萜類(lèi)是主要成分，其結(jié)構(gòu)類(lèi)型豐富，主要包括吉馬烷型、杜松烷型、桉葉烷型等。本研究利用多種色譜技術(shù)從沒(méi)藥中分離鑒定了8 個(gè)倍半萜類(lèi)化合物，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中1和2 為新化合物。本研究中分離得到的化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣，化合物1 為杜松烷型，化合物2、7 和8為吉馬烷型，3 為欖烷型，4 和5 為桉葉烷型，6 為愈創(chuàng)木烷型，進(jìn)一步豐富了沒(méi)藥的化學(xué)成分。利用MTT 法測(cè)試了所有單體化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2 增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物5 具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制活性，而與其結(jié)構(gòu)相似的化合物4 未顯示出明顯的活性，比較二者結(jié)構(gòu)，不同之處在于化合物5 具有末端雙鍵，提示末端雙鍵可能是其腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的關(guān)鍵基團(tuán)。綜上，本研究結(jié)果為闡釋沒(méi)藥藥效物質(zhì)及其開(kāi)發(fā)利用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突