含蜂毒肽的前列腺癌外泌體制備及體外評價

呂立國，吳巧玲，黃 娟，白遵光，陳志強，付江波，古熾明，陳艷芬

(廣東省中醫(yī)院 1.泌尿外科、2.腫瘤科，廣東 廣州 510120；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

前列腺癌是全世界發(fā)病率排名第二的男性惡性腫瘤，在美國發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第一位。既往臨床研究顯示，以蜂毒為主要作用成分的蜂針療法在控制前列腺癌進展方面有一定臨床療效[1]。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，實驗研究[2]顯示蜂毒肽對前列腺癌細胞具有增殖抑制和凋亡誘導作用，可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲[3]。但由于蜂毒肽對腫瘤細胞的增殖抑制和凋亡誘導沒有靶向性，臨床應用有溶血性等不良反應，明顯限制了其臨床應用。外泌體是目前腫瘤微環(huán)境研究的熱點，具有免疫原性低、遞送效率高、可跨過多種生物屏障和靶向性等特點[4],可以作為藥物的載體，通過內吞形式攝入靶細胞內，直接作用于腫瘤細胞。研究顯示，將藥物融合入前列腺癌細胞來源的外泌體[5]，并將其靶向作用于前列腺癌細胞，外泌體介導的藥物體現(xiàn)出更強的細胞毒性，說明外泌體可以成為前列腺癌靶向治療藥物的運載體。本研究擬在既往研究基礎上，探索構建含蜂毒肽的前列腺癌細胞外泌體的方法，并體外評價前列腺癌細胞對其吞噬攝納作用，為蜂毒肽在腫瘤疾病的應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1細胞株和培養(yǎng) 細胞株：人前列腺癌PC-3細胞株、DU145細胞株、LNCaP細胞株由廣東省中醫(yī)藥科學院惠贈。PC-3細胞、DU145細胞、LNCaP細胞用含5%FBS的DMEM，37 ℃，5% CO2，飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2主要儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技，156081-504)；倒置顯微鏡(Olympbus，CKX41)；熒光倒置顯微鏡(Olympus，CKX53)；電子透射顯微鏡(日本電子株式會社，JEM-1400/JEM-1400 PLUS)；高速離心機(德國Sigma公司，3-30K)；全自動酶標儀(BioTek Instruments，ELX800)；恒溫水浴鍋(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，S21-6新高)；超低溫冷凍儲存箱(中科美菱低溫科技有限公司，DW-hL218)；分析天平(ShIMADZU，AUY120)；CCD(美國gatan，830)；納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)(英國/Malvern，Nanosight NS300)；Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統(tǒng)(美國ProteinSimple，S/N:WS-2494)；高效液相色譜儀(ShIMADZU，RESERVOR TRAY)；高效液相色譜柱(GL Science Inc，1A7150534)；電轉儀(美國Bio-Rad，MicroPulser)；電擊杯(美國Bio-Rad，Gene Pulser?/MicroPulserTM)；馬爾文激光粒度儀(Malvern Instruments，Zetasize NanoZS90)。

1.1.3主要試劑 蜂毒肽(上海阿拉丁，1902001)，分子式為：C131H229N39O31；氨基酸序列為:Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2)；DMEM培養(yǎng)基(美國hyclon，8119078)；青霉素-鏈霉素雙抗(美國Solarbio，20170413)；胎牛血清(Gibco，42Q1782K)；0.25%Tripisin-EDTA(1×)胰酶(Invitrogen，2048080)；DMSO(廣州瑞舒，批號：67-68-5)；MTT(廣州瑞舒，20171012)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術，062118180930)；RIPA 裂解液(Thermo Scientific，USA，89901)；蛋白酶抑制劑混合物(beyotime P1006)；色譜甲醇(天津市科密歐，20181010)；色譜乙醇(天津市科密歐，20180725)；色譜乙腈(上海阿拉丁，K1623001)；三氟乙酸(上海阿拉丁，J1626023)；PKh67試劑盒(上海貝博，BB-441112)；DAPI溶液(北京博奧森，AI10087467)；牛血清白蛋白(BSA,大連美侖生物，F(xiàn)0109A)。

1.2 實驗方法

1.2.1篩選不同時間饑餓處理的細胞 分別設置0、12、24、36、48 h為觀察點對饑餓處理后的PC-3細胞形態(tài)以及生長狀況進行觀察并拍照。

1.2.2超速離心法提取PC-3細胞外泌體 PC-3細胞常規(guī)培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)較好且細胞密度達80%左右時，將其用無胎牛血清的基礎培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液，將上清液于-80 ℃儲存，擇期采用超速離心法提取PC-3細胞外泌體。

1.2.3外泌體的鑒定

1.2.3.1 外泌體的形態(tài)學鑒定 將外泌體提取液滴在封口膜潔凈面，將銅網膜面放在外泌體液滴上，懸浮吸附10 min，用濾紙緩慢吸干。轉移銅網至1%醋酸雙氧鈾染液液滴上染色10 min，濾紙吸干；轉移銅網到雙蒸水液滴上，3次，每次2 min，濾紙吸干；自然晾干，透射電子顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3.2 Nanosight(NTA)檢測外泌體粒徑 采用動態(tài)光散射方法檢測，對外泌體粒徑分布進行研究，將收集的外泌體稀釋成顆粒濃度為1010L-1的密度，0.22 μm微孔濾膜過濾后，將其注入Nanosight納米顆粒跟蹤分析儀進行分析。

1.2.3.3 Western blot檢測外泌體特異標志蛋白 外泌體的BCA蛋白定量用酶標儀測其在562 nm波長處的吸光度值，根據標準曲線計算蛋白濃度。Western blot檢測外泌體標志物蛋白Alix、CD63的含量。

1.2.4蜂毒肽外泌體體系的制備 精密稱取5.00 mg蜂毒肽，用PBS緩沖液配成濃度為1 g·L-1的溶液。將外泌體溶液與蜂毒肽溶液以1 ∶4的比例混合均勻，分別采用以下3種方法制備：室溫孵育法：蜂毒肽外泌體溶液渦旋10 min后，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h。標記為“F”。反復凍融法：蜂毒肽外泌體溶液渦旋5 min后，將其置于37 ℃中孵育30 min，然后在-80 ℃快速冷凍，并在溫室下解凍。重復3次。標記為“D”。電穿孔法：將蜂毒肽外泌體加入電擊杯中，打開電轉儀，將其以“0.55 kV，0.6 ms”的條件電擊5次，每次間隔1 min，將其置于冰上。電擊結束后將液體轉移至EP管中，37 ℃孵育30 min，轉置于4 ℃中。標記為“K”。

1.2.5超速離心法測其包封率 分別取一定量的“F、D、K”于超速離心管中，以100 000×g，4 ℃的條件離心70 min。離心后分別取上清液于EP管內，將沉淀收集于另一EP管中待用。分別取一定量的“F、D、K”，與等量的甲醇混合，將其超聲30 min進行破乳，0.22 μm的微孔濾膜過濾。分別取等量的“F、D、K”離心過的上清，加等量的甲醇超聲破乳30 min后，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，用高效液相按照“1.2.7.3”的色譜條件進樣分析，利用峰面積計算出包封率，計算公式如下：

注：W總為總體系的峰面積，W游為游離上清的峰面積。

1.2.6蜂毒肽外泌體的粒徑檢測 電穿孔制備蜂毒肽外泌體。取30 μL外泌體和蜂毒肽外泌體溶液，將其稀釋40倍，輕輕渦旋后用0.22 μm的微孔濾膜進行過濾，用馬爾文激光粒度儀測其粒徑大小。

1.2.7蜂毒肽外泌體含量測定方法的建立

1.2.7.1 對照品溶液的制備 精密稱取蜂毒肽對照品5.0 mg，用色譜甲醇超聲溶解，定容成濃度為1 g·L-1的標準溶液，過0.22 μm的微孔濾膜，取濾液待測。

1.2.7.2 供試品溶液的制備 超速離心法提取外泌體，PBS緩沖液進行重懸。取空白外泌體0.2 mL，取等量色譜甲醇，超聲破乳30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液即得空白外泌體供試品。電穿孔制備蜂毒肽外泌體，取蜂毒肽外泌體0.2 mL，取等量的色譜甲醇，超聲破乳30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液即得蜂毒肽外泌體供試品。

1.2.7.3 色譜條件色譜柱 C18柱；流動相：乙腈、水(0.1%三氟乙酸)；檢測波長：220 nm；流速：1 mL· min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL。程序：A：乙腈 B：水(0.1%三氟乙酸)。0 min：A:39%，B:61%;20 min:A:64% B:36%;25 min:A:100%，B:0%;25.01 min:stop.

1.2.7.4 專屬性試驗 取上述的空白外泌體，蜂毒肽外泌體供試品溶液，以及蜂毒肽對照品溶液，以“1.2.7.3”的色譜條件進樣分析。

1.2.7.5 線性關系的考察 精密量取1 g·L-1的蜂毒肽，用甲醇定容配得蜂毒肽濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1的對照品溶液。以上述色譜條件進行分析，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制相關的標準曲線。

1.2.7.6 精密度試驗 精密稱取蜂毒肽對照品，用甲醇定容成0.3 g·L-1的溶液，以上述色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次，記錄每次進樣峰面積，計算峰面積的RSD值。

1.2.7.7 重復性試驗 取蜂毒肽外泌體，按照上述步驟平行制備供試品溶液5份，按照以上的色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按照以上的線性曲線得到對應的蜂毒肽濃度，計算蜂毒肽濃度的RSD值。

1.2.7.8 穩(wěn)定性試驗 取蜂毒肽外泌體溶液按照上述步驟制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄峰面積。

1.2.7.9 回收率試驗 精密取50 μL空白外泌體9份，分成3組，每組3份，分別加1 g·L-1的蜂毒肽40、60、100 μL，用甲醇定容至200 μL，超聲30 min，每組蜂毒肽外泌體混懸液所含有的蜂毒肽濃度為0.2、0.3、0.5 g·L-1，過0.22 μm濾膜后取濾液進樣分析。

1.2.8前列腺癌細胞對蜂毒肽外泌體的攝取 PC-3細胞、DU145細胞以及LNCaP細胞種96孔板24 h。EXO-MEL用PKh67試劑盒染色后將其避光與培養(yǎng)基均勻混合，避光加入96孔板中，每孔200 μL，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育。于6、12、24 h以及48 h時取出96孔板，將上清吸棄，加入100 μL的4%多聚甲醛溶液固定細胞，37 ℃中孵育10 min。取出，吸棄多聚甲醛溶液。在避光條件下，加入50 μL的10 mg·L-1DAPI染色液，37 ℃中孵育5 min。取出吸棄染色液，PBS洗滌。最后加入100 μL的PBS緩沖液在熒光倒置顯微鏡下進行觀察，拍照并記錄不同時間點各細胞攝取EXO-MEL的狀況。圖像應用ImageJ圖像分析軟件分析，得出平均光密度值。

2 結果

2.1 篩選不同時間饑餓處理的細胞用于提取外泌體由Fig 1可以得出，PC-3細胞在饑餓處理前，細胞狀態(tài)較好，細胞壁清晰且貼壁較牢。當細胞饑餓12、24 h時，細胞狀態(tài)仍然較好，死亡細胞稍許有增加，但基本控制在5%左右。當饑餓處理36、48 h時，可見死亡細胞有明顯增多，且在48 h時，細胞狀態(tài)明顯變差，部分細胞的細胞壁模糊。故以饑餓處理24 h為最佳時間點。

2.2 外泌體的鑒定由Fig 2～4的結果可知，外泌體外形呈圓形或橢圓形，具有明顯的膜性結構，大小不一，直徑在100 nm左右?？蓡蝹€分布，也可聚集成團。NTA結果是所提的外泌體用PBS緩沖液稀釋了40倍上機所檢測顆粒的濃度(1010L-1)，圖片顯示單峰且曲線流暢，無多余雜峰，粒徑峰值為134 nm?？傮w來說粒徑為0～200 nm的占比>80%，平均粒徑為(163.3±51) nm。有些許粒徑較大的顆?？赡芘c顆粒之間的黏附有關。稀釋4倍外泌體測得的OD值為0.126，根據蛋白標準品與OD值的線性方程(Y=1.059X-0.127，R2=0.999 6)，計算可得外泌體的蛋白濃度為0.222 g·L-1。Western blot檢測外泌體的標志蛋白結果顯示Alix、CD63為陽性表達。從形態(tài)、粒徑以及標志蛋白3種實驗得出的結果與理論上外泌體的參數(shù)基本相符合，說明利用饑餓培養(yǎng)所得到的PC-3細胞上清液，再通過超速離心法提取可得到實驗所需的外泌體。

Tab 1 Interval ratios of particle size for NTA detection

2.3 超速離心法測其包封率由Tab 2可知，電穿孔法的包封率>反復凍融法>室溫孵育法，且電穿孔法與反復凍融法、室溫孵育法相比較，P<0.05，有明顯差異。故選擇電穿孔法作為制備蜂毒肽外泌體的方式。

Fig 1 Morphological observation of PC-3 cells treated with starvation for different time points (×100)

Fig 2 Analysis of NTA detection in exosomes

Fig 3 Morphology of exosomes by TEM(×100 000)

Fig 4 Expression of exosome marker proteins determined by WB

Tab 2 Encapsulation efficiency of melittin exosomes prepared by different methods

2.4 蜂毒肽外泌體的粒徑檢測結果如Fig 5所示，外泌體與蜂毒肽外泌體的峰形均為單峰，無駝峰出現(xiàn)，曲線流暢，說明其粒徑較為均勻。外泌體組數(shù)據結果顯示峰值為161.9 nm，均值為147.7±53.68 nm。蜂毒肽外泌體組顯示峰值為246.7 nm，均值為241.9±58.54 nm?？梢娸d入蜂毒肽的外泌體溶液的粒徑比未載藥的外泌體粒徑大。

2.5 蜂毒肽外泌體含量測定方法的建立

2.5.1專屬性試驗 結果表明，在實驗所設定的液相條件下，空白外泌體與蜂毒肽對照品的特征峰無干擾，其分離效果較好，專屬性較好，符合測定的相關標準。

2.5.2線性關系的考察 由Tab 3所示，以蜂毒肽的液相峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：Y=2E+06X-13 066，R2=0.999 9，表明蜂毒肽在0.1～0.6 g·L-1濃度內與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

Tab 3 Data sheet for melittin standard curve

Fig 5 Particle size distribution of exosomes (top) and melittin exosomes (bottom)

2.5.3精密度試驗 以上述色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次，記錄每次進樣的峰面積，計算峰面積的RSD值，結果顯示RSD值為0.74%，表明其精密度較好,見Tab 4。

Tab 4 Results of precision testing

2.5.4重復性試驗 根據峰面積，按照以上的線性標準曲線計算得到對應的蜂毒肽濃度，計算蜂毒肽濃度的RSD值。RSD值為1.08%，表明此方法有較好的重復性，符合分析要求,見Tab 5。

Tab 5 Reproducibility test results

2.5.5穩(wěn)定性試驗 取蜂毒肽外泌體溶液制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄峰面積。計算得蜂毒肽峰面積的RSD值為0.46%，表明其在24 h內穩(wěn)定性較好,見Tab 6。

Tab 6 Stability test results

2.5.6回收率試驗 進樣分析后得相對應的峰面積，依據線性曲線的回歸方程計算得到相對應的濃度，計算其回收率。結果見其回收率在95%～105%，且每組的RSD<5%，說明其回收率較好,見Tab 7，F(xiàn)ig 6～8。

Tab 7 Results of recovery test

Fig 6 HPLC chromatogram of blank exosome solution

Fig 7 HPLC chromatograms of melittin control solution

Fig 8 HPLC chromatogram of melittin exosome solution

2.6 前列腺癌細胞對蜂毒肽外泌體的攝取結果如Fig 9，10所示，綠色熒光為PKh67染色后的外泌體，藍色熒光為DAPI染色的細胞核。對于PC-3細胞，在6 h時EXO-MEL較少且大多在細胞之外，可能是因為時間太短，細胞還未開始攝取EXO-MEL。在12 h時，結合熒光以及明場圖片，發(fā)現(xiàn)有部分EXO-MEL進入細胞質中。24 h以及48 h時，在PC-3細胞的核膜周圍明顯分布有綠色熒光，說明細胞攝取增多。綜合看來，PC-3細胞可以有效攝取EXO-MEL，且其攝取程度有一定的時間依賴性。同理從Fig 11，12可以看出，隨著時間的推移，DU145以及LNCaP兩種前列腺癌細胞也能攝取EXO-MEL。ImageJ圖像分析軟件對攝取圖進行定量分析熒光值，隨著時間的推移，3種細胞的攝取逐漸增多，平均光密度值逐漸增大。

3 討論

前列腺癌在國內是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，嚴重威脅著我國中老年男性的健康[6]。前列腺癌確診時多數(shù)為晚期，內分泌治療初始有效，但經過中位時間18～24個月，幾乎所有患者都進展為去勢抵抗性前列腺癌，生活質量下降，生存期短[7]。如何延緩前列腺癌的進展，延長前列腺癌患者的生存期，是臨床治療的難點及醫(yī)學研究的熱點。以蜂毒肽等為主要作用成分的蜂針療法在控制前列腺癌進展方面有一定的臨床療效[1]，提示蜂毒肽可能具有獨特的抗腫瘤優(yōu)勢，但由于某些缺點阻礙了其在抗腫瘤方面的廣泛應用[8]。外泌體是各種活細胞產生的天然細胞外囊泡，在前列腺癌患者的血液、尿液以及前列腺液中均可以分離得到[9-10]，前列腺癌來源的外泌體中的蛋白和核酸等物質為前列腺腫瘤早期診斷及預后判斷提供了重要依據[5]。此外，外泌體與前列腺癌的化療耐藥、免疫抑制、增殖、凋亡和血管形成有關，表明前列腺源性外泌體可能是潛在的前列腺癌治療靶點[11]，利用外泌體作為藥物或抗原載體進行靶向給藥及免疫治療具有一定的研究意義。因此，本研究從外泌體的結構特性和載藥優(yōu)勢出發(fā)，探討合適的方法制備蜂毒肽外泌體體系，為外泌體的載藥研究和蜂毒肽的研發(fā)利用提供實驗依據。

Fig 9 Fluorescence of EXO-MEL uptake by PC-3 cells at various time points

提取細胞外泌體，生長狀況是影響其質量的關鍵因素。

Fig 10 Mean optical density values of EXO-MEL uptake by cells at various time points*P<0.05 vs 6 h group

Fig 11 Fluorescence of EXO-MEL uptake by D-U145 cells at various time points(×100)A,B,C and D represent EXO-MEL incubation time of 6,12,24 and 48 h respectively

Fig 12 Fluorescence of EXO-MEL uptake by LNCaP cells at various time points(×100)A,B,C and D represent EXO-MEL incubation time of 6,12,24 and 48 h respectively

一些細胞如腫瘤細胞具有較強的嗜血性,其生長條件中需要加入血清成分，但大部分的血清中通常會含有一定量的外泌體，這會直接影響到外泌體的純度。在這種情況下通常有3種方法：使用無外泌體的胎牛血清；利用超速離心法將普通的胎牛血清連續(xù)過夜超速離心去除其中的外泌體[12]；或使用饑餓處理的方法提取外泌體。無外泌體的胎牛血清價格昂貴且產品質量參差不齊，可能直接影響細胞的貼壁能力以及細胞分泌外泌體的質量；而連續(xù)過夜超速離心胎牛血清可能會損失血清中的營養(yǎng)成分從而使得血清質量下降。細胞饑餓處理的前提是細胞生長狀況良好且密度合適，饑餓處的時間一般不超過48 h，細胞死亡率控制在10%以內。本研究通過設計不同的時間點觀察饑餓處理的細胞狀態(tài)，篩選合適的收集細胞上清液的時間，實驗結果表明饑餓處理24 h的細胞狀態(tài)最佳。目前大多數(shù)文獻均采用傳統(tǒng)的超速離心法提取外泌體，或在傳統(tǒng)方法上進行改良提取[13]。但已知的提取手段均很難獲得純度高的外泌體樣品，且沒有任何一個單一的實驗可以確定外泌體的存在。因此，從形態(tài)、粒徑和標志物蛋白三個方面對提取的外泌體進行鑒定：透射電鏡觀察提取的外泌體外形呈圓形或橢圓形，具有明顯標志性的膜性結構；Western blot檢測外泌體的標志物蛋白Alix、CD63顯示陽性；NTA對所提顆粒進行粒徑分析顯示呈單峰且曲線流暢，顆粒較為集中，無多余雜峰，粒徑峰值為134 nm，且總體粒徑為0～200 nm的占比大于80%。上述結果說明，利用饑餓培養(yǎng)24 h的PC-3細胞結合超速離心法可成功制備外泌體。

研究報道外泌體的載藥方式多種多樣，如電穿孔、輔助超聲、共孵育以及化學轉染等[14]。在嵌段共聚物納米粒的質量評價方面，包封率的測定方法是一個十分重要的評價因素。常用的包封率測定方法包括離心法、微型柱離心法、透析法和葡聚糖凝膠柱層析法等[15]。本研究結合蜂毒肽的分子量大小和性質，分別利用反復凍融法、室溫孵育法以及電穿孔法進行外泌體載藥，并選擇超速離心法測其不同載藥方式的包封率大小，從而篩選出最優(yōu)載藥方式。實驗結果表明，使用電穿孔方法測得的包封率為17.51%，顯著大于反復凍融法和室溫孵育法測得的包封率。故最終選擇電穿孔法作為外泌體的載藥方式進行后續(xù)實驗，粒徑測量結果表明，蜂毒肽外泌體為單峰，峰形流暢，說明其分散度較好，可作為下一步的研究。本研究還建立了蜂毒肽外泌體中蜂毒肽含量測定的高效液相法，并進行了方法學考察，實驗數(shù)據顯示，該方法在0.1～0.6 g·L-1的濃度范圍內具有良好的線性關系；此外還進行了專屬性實驗、精密度實驗、重現(xiàn)性實驗、穩(wěn)定性以及回收率實驗。

外泌體是由活細胞分泌小囊泡，具有典型的脂質雙分子層結構[16]。對分離的外泌體進行體外標記或活體示蹤，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究[17]。目前，對于外泌體的標記方法有很多種，包括親脂性的染料和膜滲透型的化合物等。PKh67是常用的外泌體體標記物，可以穩(wěn)定地與細胞膜脂質區(qū)結合并發(fā)出熒光，且對細胞毒性較小，脂溶性高，通過與膜結構的脂質分子結合而標記細胞，有著強而穩(wěn)定的綠色熒光，特別適用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究以及體內外的細胞失蹤研究[18]，DAPI則是一種常用的DNA特異性染料。本實驗通過不同時間點觀察了PC-3細胞攝取蜂毒肽外泌體的情況，結果表明PC-3細胞可以有效攝取EXO-MEL，且攝取程度有一定的時間依賴性。這一結果說明PC-3細胞可成為自身來源外泌體的靶細胞，通過攝取將自身外泌體作為載體的載藥體系，進而改變自身基因表型并影響生物學功能。此外，本實驗還證實蜂毒肽外泌體也能被另外兩種人前列腺癌細胞即去勢抵抗性DU145細胞和內分泌敏感性LNCaP細胞的攝取，提示蜂毒肽外泌體可能對不同分期的前列腺癌有潛在的治療作用。

綜上所述，本實驗成功制備了前列腺癌蜂毒肽外泌體體系，并通過熒光顯微鏡觀察蜂毒肽外泌體可以被前列腺癌細胞攝取，進一步還可對該蜂毒肽外泌體體系對前列腺癌細胞的作用機制進行深入探究，為前列腺癌的臨床治療提供新的研究思路。