基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的山豆根調(diào)控白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路改善急性咽炎的作用機(jī)制

黨兆巖，劉 暢，何倩倩，俸婷婷，權(quán) 偉，董 秀，周 英,3

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/藥食兩用資源應(yīng)用與開發(fā)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州三力制藥股份有限公司，貴州 安順 561100；3.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

山豆根(SophoratonkinensisGagnep)是槐屬豆科植物山豆根的干燥根與根莖的統(tǒng)稱，目前廣泛用于治療咽嚨腫痛、牙齦腫脹和病毒性肝炎等[1]。其主要成分為三萜類化合物、黃酮和喹啉利啶生物堿。藥理研究表明，山豆根具有多種藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、抑制胃酸分泌，等等[2]。山豆根常用于治療炎癥性疾病，包括咽炎、扁桃體炎等。最近的研究表明，從山豆根中分離得到的黃酮類化合物苦參素B和6，8-二戊烯基-7，4′-二羥基黃烷酮具有抗炎作用[3]。越來(lái)越多的證據(jù)支持山豆根治療炎癥性疾病，以及作為一種天然藥物來(lái)衍生治療炎癥藥物制劑[4]。

急性咽炎是咽部黏膜和周圍淋巴組織的炎癥，往往是由各種病毒或細(xì)菌感染所引起的。急性咽炎是一種非常常見的疾病，通常是良性的[5]。急性咽炎相關(guān)的咽痛、發(fā)燒和咽部異物感會(huì)令人感到不適[6]。導(dǎo)致喉嚨痛的非傳染性因素非常多，包括物理化學(xué)因素(如吸煙、打鼾、喊叫、吸毒)和環(huán)境因素(如污染、溫度、濕度)[7]。急性咽炎的模型通常是使用氨水、辣椒素等刺激物建立的，這些刺激物被用來(lái)模擬環(huán)境污染或不健康的人類生活方式。目前急性咽炎的臨床治療主要圍繞糖皮質(zhì)激素、抗生素和非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的使用。然而，長(zhǎng)期使用阿司匹林或地塞米松等藥物治療可能會(huì)導(dǎo)致胃黏膜、肝臟或腎臟損傷，以及其他不可預(yù)見的副作用。研究表明，許多中藥對(duì)急性咽炎有有益的作用，有可能減緩過(guò)度的炎癥進(jìn)展，恢復(fù)咽喉組織部位的穩(wěn)態(tài)[8-9]。

本研究首先通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測(cè)山豆根改善急性咽炎的潛在成分、作用靶點(diǎn)和分子通路，接著利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，闡明山豆根改善急性咽炎的潛在機(jī)制，以期為山豆根改善急性咽炎的作用機(jī)制提供方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥材與試劑SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20) g，購(gòu)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SYXK(川)2018-17。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)要求，且實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)指導(dǎo)原則和規(guī)定進(jìn)行。

山豆根，貴州三力制藥股份有限公司提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為豆科越南槐(SophoratonkinensisGagnep)的干燥根及根莖。稱取山豆根1 000 g，置2 000 mL圓底燒瓶中，以10倍量、8倍量、8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并3次濾液，濃縮得浸膏，低溫保存?zhèn)溆谩０准?xì)胞介素6(IL-6，ZC36404-2106A28)、白細(xì)胞介素10(IL-10，ZC36379-2106A19)、前列腺素E2(PEG2，ZC37100-2106A21)檢測(cè)試劑盒，上海茁彩生物科技有限公司，總RNA提取試劑盒(W9908)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(W9813)，熒光定量試劑盒(W9611)，天根生化科技(北京)有限公司，水合氯醛(0616A20)，北京市雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器、數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件Multlskan Mk3酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)，數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán))，N60系列超微量分光光度計(jì)(德國(guó)IMPLEN)，CFX Connect三通道梯度熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https：// www.uniprot.org /)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.omim.org/)；Venny2.1.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.sib.swiss/)；the Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.genome.jp/kegg/)；bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.bioinformatics.com.cn/)；Cytoscape3.8.2軟件；GraphPad Prism 6.0軟件。

1.3 山豆根改善急性咽炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.3.1獲取山豆根有效活性成分和候選作用靶點(diǎn) 利用TCMSP獲取山豆根的活性成分。以“山豆根”為檢索詞，依據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選收集。將所得活性成分在Swiss Target Prediction中篩選得到山豆根相關(guān)靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)校正靶點(diǎn)基因名，限定物種為“Homosapiens”，獲取山豆根有效活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.3.2構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(相關(guān)性評(píng)分≥1.0)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，以“acute pharyngitis”檢索急性咽炎潛在靶點(diǎn)，合并去除重復(fù)后，收集急性咽炎相關(guān)靶點(diǎn)。利用韋恩圖獲取山豆根和急性咽炎的共同靶點(diǎn)，并通過(guò)Venny軟件繪制韋恩圖顯示。通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.3.3構(gòu)建蛋白相互作網(wǎng)絡(luò) 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶標(biāo)蛋白相互作用(protein-proteininteraction，PPI)。將“1.3.2”獲取的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種“Homosapiens”，并以置信度≥0.9，獲取靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將其導(dǎo)入Cytoscape軟件中優(yōu)化PPI。利用bioinformatics顯示PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前20的核心蛋白靶點(diǎn)。

1.3.4通路和功能富集的分析 為進(jìn)一步研究山豆根改善急性咽炎機(jī)制，利用Metascape對(duì)獲得的靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。然后把山豆根活性成分、靶點(diǎn)以及排名前20的KEGG通路等數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 山豆根改善急性咽炎的作用機(jī)制

1.4.1建立大鼠急性咽炎模型 60只SPF級(jí)SD大鼠，♀♂各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，每組10只，空白組(KB，蒸餾水)，模型組(MX)，阿莫西林陽(yáng)性藥組(YX，0.20 g·kg-1)，山豆根低劑量組(DJ，2.16 g·kg-1)，山豆根中劑量組(ZJ，8.64 g·kg-1)，山豆根高劑量組(GJ，34.65 g·kg-1)。除空白組外，用喉頭噴霧器將10%氨水向各組大鼠咽部噴霧(散布面積150 mm2)，上、下午各1次，每次3下，連續(xù)3 d，使咽部黏膜因急性刺激而充血腫脹，形成急性炎癥，建立大鼠急性咽炎模型[10]。造模3 d后，各組灌胃給予相應(yīng)劑量藥液，每天1次，連續(xù)7 d。各組禁食不禁水12 h，處死前記錄體質(zhì)量，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，取血清、咽部組織測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.2咽部病理組織學(xué)變化及血清指標(biāo)檢測(cè) 咽部組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察咽部組織病理形態(tài)變化。腹腔主動(dòng)脈取血，血液于4 ℃靜置1 h，析出血清，4 ℃，3 500 r·min-1離心15 min，按照試劑盒方法檢測(cè)血清中IL-6、IL-10、PEG2的含量。

1.4.3熒光定量PCR法檢測(cè)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá) 提取大鼠咽部組織總RNA，使用cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。采用SYBRGreenMaster(Rox)(Roche)在伯樂(lè)熒光定量PCR儀器上完成操作，每組實(shí)驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)3次。利用Primer 3在線軟件(https；//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)整合素亞基β1(integrin subunit β1，ITGB1)，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PRKCα)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基δ(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-Kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2(protein tyrosine Kinase 2，PTK2)，整合素亞基β2(integrin subunit beta 2，ITGB2)，蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PRKCB)，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶非受體11型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11)，整合素亞基α4(integrin subunit α4，ITGA4)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit α，PIK3CA)，GAPDH引物(Tab 1)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)利用公式2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算。

Tab 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 獲取山豆根有效活性成分和候選作用靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得79個(gè)山豆根有效成分。根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18共篩選21種潛在的有效成分，編號(hào)為S1-S21(Tab 2)。在Swiss Target Prediction中篩選后，用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)校正共得到509個(gè)作用靶點(diǎn)。

Tab 2 The 21 active ingredients of Sophora tonkinensis Gagnep and number of corresponding targets

2.2 急性咽炎潛在靶點(diǎn)的收集通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(相關(guān)性評(píng)分≥1.0)和OMIM獲取急性咽炎相關(guān)的靶點(diǎn)，合并剔除重復(fù)值后共獲得2 167個(gè)急性咽炎潛在靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將收集的509個(gè)山豆根潛在靶點(diǎn)與急性咽炎的2 167個(gè)潛在靶點(diǎn)相匹配，運(yùn)用韋恩圖得到山豆根急性咽炎共同靶點(diǎn)數(shù)目194個(gè)，同時(shí)利用Venny2.1軟件繪制韋恩圖(Fig 1)。

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(Fig 2)。此網(wǎng)絡(luò)有206個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括山豆根(橙色的三角形)、急性咽炎(黃色的圓形)、山豆根21個(gè)活性成分(藍(lán)色的V形)、194個(gè)山豆根和急性咽炎的共同靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)(綠色的菱形)和1 071條邊。其中異鼠李素(S2)、醉茄素(S6)、大豆皂苷E(S9)、山奈酚(S20)、槲皮素(S21)是山豆根改善急性咽炎的關(guān)鍵活性成分，與100個(gè)靶點(diǎn)直接相關(guān)(Tab 2)。

Fig 1 Venn diagram of common target of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將194個(gè)共同靶標(biāo)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種“Homosapiens”，并以置信度≥0.9進(jìn)行過(guò)濾。將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建優(yōu)化PPI網(wǎng)絡(luò)有145個(gè)節(jié)點(diǎn)(隱藏離散節(jié)點(diǎn))代表所有預(yù)測(cè)靶標(biāo)(Fig 3)，邊線508條，代表靶標(biāo)之間的相互聯(lián)系。其中綜合數(shù)值評(píng)分>0.95的相互作用蛋白有AKT1-HSP90AA1、AKT1-MTOR、CCNB1-CDK2、CCNB1-CDK1、CCND1-CDK2等280個(gè)，這些蛋白間的相互作用在PPI中占有重要地位。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)連接度、介度與緊密度確定網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，利用bioinformatics可視化PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前20的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，繪制核心靶點(diǎn)水平條形圖(Fig 4)。

2.5 通路和功能富集的分析為深入研究山豆根改善急性咽炎的作用機(jī)制，本研究利用Metascape平臺(tái)對(duì)山豆根和急性咽炎194個(gè)共同靶標(biāo)進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析。共得到2 394個(gè)GO富集條目，包括2 058個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目，208個(gè)分子功能和128個(gè)細(xì)胞成分條目。在生物學(xué)過(guò)程方面，山豆根改善急性咽炎主要涉及cellular response to nitrogen compound信號(hào)通路(GO：1901699)、：response to drug(GO：0042493)、positive regulation of protein phosphorylation(GO：0001934)等。在細(xì)胞成分中主要涉及postsynapse(GO：0098794)、membraneraft(GO：0045121)等。分子功能富集主要涉及protein kinase activity(GO：0004672)、neurotransmitter receptor activity(GO：0030594)、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity(GO：0004714)等。根據(jù)P<0.05，篩選出排名前10個(gè)GO富集條目，并利用bioinformatics進(jìn)行可視化(Fig 5)。

通過(guò)KEGG通路分析，共富集到344條信號(hào)通路。山豆根改善急性咽炎主要涉及白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等。根據(jù)P<0.05，篩選出排名前20的通路，并利用bioinformatics進(jìn)行可視化(Fig 6)。

2.6 構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)最后將山豆根的有效成分、山豆根和急性咽炎的共同靶標(biāo)和排名前20的KEGG信號(hào)通路等數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(Fig 7)。該網(wǎng)絡(luò)有226個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中包括山豆根(紅色六邊形)，急性咽炎(橙色正方形)，山豆根21個(gè)活性成分(紫色V形)，194個(gè)山豆根與急性咽炎的共同靶標(biāo)(綠色菱形)，排名前20信號(hào)通路(桃紅色三角形)和1 041條邊。該網(wǎng)絡(luò)圖直觀地體現(xiàn)山豆根通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路改善急性咽炎的作用機(jī)制。

Fig 2 “Sophora tonkinensis Gagnep-acute pharyngitis-effective components-target”network

Fig 3 Sophora tonkinensis Gagnep to improve potential target interaction network of acute pharyngitis

Fig 4 Horizontal bar chart of core targets

Fig 5 The biological process of GO enrichment histogram in top 10 intersecting targets of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

Fig 6 Analysis of top 20 KEGG pathways in intersection target of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

2.7 白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路信號(hào)通路基因篩選在篩選的排名前20的通路進(jìn)行篩選與急性咽炎相關(guān)的通路，主要有IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、NF-kappa B 信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路(leukocyte transendothelial migration)等。山豆根中主要活性成分異鼠李素、醉茄素、大豆皂苷E、山奈酚、槲皮素等作用于白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路11個(gè)靶點(diǎn)ITGB1，PRKCA，PIK3CD，PTK2，ITGB2，PRKCB，PTPN11，ITGA4，PIK3CA等。

2.8 山豆根對(duì)急性咽炎大鼠體質(zhì)量及血清IL-6、IL-10、PEG2水平的影響向大鼠咽部噴霧10%的氨水造模觀察，模型組大鼠相較空白組活動(dòng)量減低，毛色無(wú)光、行動(dòng)低迷、精神不振、飲食量減少，說(shuō)明造模成功；各給藥組大鼠的癥狀均輕于模型組大鼠。與空白組相比，造模后，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，血清 IL-6、PEG2水平明顯升高(P<0.01)，IL-10水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，山豆根低劑量組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05)，山豆根高、中、低劑量組大鼠血清 IL-6水平均明顯降低(P<0.01)，山豆根低、中、高劑量組大鼠血清IL-10含量均明顯升高(P<0.01)，山豆根低、高劑量組大鼠血清PEG2含量均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，相較模型組，山豆根低劑量組大鼠血清IL-6、PEG2含量最低，IL-10含量最高(Tab 3)，效果最優(yōu)。

2.9 大鼠咽部組織病理組織學(xué)觀察與空白組相比，模型組固有層和黏膜層病理變化明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，固有層有明顯的水腫現(xiàn)象，陽(yáng)性藥組固有層和黏膜層無(wú)明顯病理變化，山豆根低劑量組固有層和黏膜層病理有輕微變化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，固有層水腫現(xiàn)象較輕，山豆根中高劑量組相較模型組固有層和黏膜層病理變化較輕，但相較于山豆根低劑量組病理變化較為嚴(yán)重，山豆根低劑量組咽部組織細(xì)胞著色較為均勻，細(xì)胞形態(tài)基本正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯減輕(Fig 8)。

Fig 7 “Sophora tonkinensis Gagnep-acute pharyngitis-effective components-target-pathway”network

Tab 3 Comparison of levels of IL-6,IL-10,PEG2 in pharyngeal tissues of

Fig 8 Pathological morphology of pharyngeal tissues of rats(HE staining,×200)KB:blank group；MX:model group；YX:positive drug group；DJ:Sophora tonkinensis Gagnep low-dose group；ZJ:Sophora tonkinensis Gagnep middle-dose group；GJ:Sophora tonkinensis Gagnep high-dose group.

2.10 咽部組織ITGA4、ITGB1、ITGB2、PIK3CA、PIK3CD、PRKCA、PRKCB、PTK2、PTPN11 mRNA的表達(dá)水平與模型組相比，山豆根低劑量組可明顯下調(diào)ITGB1、ITGB2、PIK3CA、PIK3CD、PRKCA、PRKCB、PTPN11 mRNA 的表達(dá)量(P<0.05或P<0.01)，山豆根低劑量組對(duì)ITGA4、PTK2 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響，與模型組相比，山豆根空白組對(duì)ITGB1、PRKCA、PRKCB mRNA 的表達(dá)無(wú)明顯影響(Fig 9)。綜上，山豆根可能通過(guò)下調(diào)ITGB2、PIK3CA、PIK3CD和PTPN11基因表達(dá)，從而減輕急性咽炎大鼠的咽部組織的炎癥反應(yīng)。

Fig 9 Expression of leukocyte transendothelial migration genes in pharyngeal 1:blank group；2:model group；3:Sophora tonkinensis Gagnep low-dose group.*P<0.05，**P<0.01 vs blank group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group

3 討論

本研究通過(guò)氨水誘導(dǎo)的大鼠急性咽炎模型評(píng)價(jià)山豆根對(duì)咽炎的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，山豆根低中高劑量組都可以緩解急性咽炎相關(guān)癥狀，其中山豆根低劑量組效果最佳，模型組癥狀如減少飲食，減少活動(dòng)量，口腔抓撓，咳嗽，唾液分泌，咽部腫脹[11]，山豆根低劑量組則癥狀較輕，還可以減輕黏膜增生，細(xì)胞浸潤(rùn)和血管擴(kuò)張等(Fig 8-DJ)。提示山豆根能有效改善氨水導(dǎo)致的急性咽炎大鼠模型。減少腺體肥大和粘膜增厚的發(fā)生，減輕氨性咽部相關(guān)癥狀。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，氨水噴灑可逆轉(zhuǎn)組織損傷所誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-6的上調(diào)。山豆根降低COX-2和5-LOX的表達(dá)，進(jìn)一步減少炎性細(xì)胞因子PGE2的產(chǎn)生。作為促炎和炎癥細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-6)產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)因子，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路的激活是宿主細(xì)胞對(duì)氨誘導(dǎo)的組織損傷反應(yīng)的標(biāo)志。目前研究表明，山豆根可通過(guò)激活白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路，減輕組織損傷所致的咽炎大鼠炎癥反應(yīng)[11]。

炎癥是身體組織對(duì)有害刺激(如病原體)的復(fù)雜生物反應(yīng)的一部分。它是一種保護(hù)性反應(yīng)，涉及白細(xì)胞、血管和分子介質(zhì)，目的是消除細(xì)胞損傷的最初原因，并啟動(dòng)組織修復(fù)。炎癥受到身體的嚴(yán)格調(diào)控，與白細(xì)胞短暫穿過(guò)血管壁有關(guān)，這一過(guò)程被稱為跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移(TEM)。白細(xì)胞的外滲是(病理)生理過(guò)程所必需的，包括T淋巴細(xì)胞的遷移以進(jìn)行免疫監(jiān)視，急、慢性炎癥反應(yīng)中活化的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞的募集，以及造血祖細(xì)胞的歸巢和動(dòng)員[12]。

編碼β-2整合素家族的ITGB2基因介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和向炎癥部位的遷移，此外，它還參與了中性粒細(xì)胞的細(xì)菌識(shí)別和由外向內(nèi)的信號(hào)傳遞[13]，受影響患者的突出臨床特征是反復(fù)的細(xì)菌感染，主要局限于皮膚和黏膜表面，就好像急性咽炎中咽部的紅腫熱痛等。細(xì)胞的增殖、存活、分化、遷移和凋亡等過(guò)程都受酪氨酸磷酸化的調(diào)控，酪氨酸磷酸化又受蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)的調(diào)控，調(diào)節(jié)著多種細(xì)胞過(guò)程。PTKs的表達(dá)改變和突變與多種形式的癌癥和炎癥有關(guān)[14]。從以往來(lái)看，PTP被視為負(fù)面調(diào)節(jié)因子，因?yàn)樗鼈冇心芰δ孓D(zhuǎn)PTK的影響，PTK通常啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。炎癥是蛋氨酸的表型特征之一，幾個(gè)基因變異在表型上表現(xiàn)出多效性的遺傳關(guān)聯(lián)，而其中PTPN11是幾個(gè)變異基因中的一個(gè)。PI3K是一類脂質(zhì)激酶，在控制細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞入侵等信號(hào)通路中起重要作用。PIK3CA或PIK3CD的基因擴(kuò)增可誘導(dǎo)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路的下游激活。活躍的白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路的作用被認(rèn)為與炎性微環(huán)境有關(guān)[15]。白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)激活與微環(huán)境中炎癥細(xì)胞(如CD8中T淋巴細(xì)胞)的聚集有關(guān)，而環(huán)氧合酶2(通常也存在于該途徑的激活)可以調(diào)節(jié)PEG2的合成，導(dǎo)致某些T細(xì)胞通過(guò)其PEG2受體聚集[16]。山豆根明顯降低ITGB2、PIK3CA、PIK3CD和PTPN11基因的表達(dá)水平，涉及白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等途徑的關(guān)鍵基因，抑制炎癥的發(fā)生,對(duì)氨性急性咽炎起到保護(hù)的作用。

山豆根還可能通過(guò)與靶點(diǎn)結(jié)合抑制人白細(xì)胞分化抗原的表達(dá)，抑制Toll樣受體4信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路和有絲分裂素激活蛋白激酶信號(hào)通路，抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路介導(dǎo)了NF-kappa B通路的激活[17]，NF-kappa B信號(hào)通路是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通路，作為炎癥發(fā)生的一條重要途徑，是炎癥和抗炎的核心，是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要通路之一[18]。山豆根中ATF3不僅阻止NF-kappa B與促炎癥細(xì)胞因子的基因啟動(dòng)子的結(jié)合，而且還可以通過(guò)與NF-kappa B的p65亞單位的直接物理結(jié)合來(lái)阻止NF-kappa B的轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。因此，山豆根可能調(diào)控NF-kappa B信號(hào)通路從而產(chǎn)生抗急性炎作用，包括在氨性刺激后觀察到的抗急性咽炎作用。因此，山豆根可能抑制了NF-kappa B的轉(zhuǎn)位，并在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了致炎細(xì)胞因子的表達(dá)[4]。

綜上所述，山豆根低劑量組具有明顯的抗炎作用，保護(hù)黏膜組織完整性，改善咽炎癥狀。山豆根能夠降低炎癥因子的含量，減少氨性損傷大鼠的促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。山豆根可抑制白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路關(guān)鍵基因表達(dá)，減輕急性咽炎造成的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。山豆根作為一種治療咽炎等上呼吸道炎癥的藥物可能具有很大的臨床潛力。