沙利度胺對Aβ1-42致AD模型小鼠的海馬蛋白質組學影響

吳宿慧，張 晗，張宇航，牛婷媛，李寒冰，高劍峰，李根林

(河南中醫(yī)藥大學，河南省仲景方藥健康衰老產業(yè)工程研究中心，河南 鄭州 450046)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一類存在于人類中樞神經系統(tǒng)的不可逆的退行性疾病。主要癥狀為學習及記憶功能障礙，其典型病理變化是腦組織中β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)大量沉積所產生的老年斑的損傷，細胞體β-淀粉樣蛋白在腦內的過量沉積則會引起線粒體功能障礙、突觸功能障礙、炎癥反應等病理過程，加速氧化應激和神經炎癥級聯反應，誘導能量代謝衰竭和神經元凋亡。最終導致中樞神經系統(tǒng)功能異常[1]。沙利度胺是一種新型的免疫調節(jié)藥物和抗炎藥，引起中樞抑制的藥物可減輕中樞神經系統(tǒng)炎癥，促進腦血供，預防腦梗死的發(fā)生，促進神經系統(tǒng)功能的恢復。目前，臨床資料表明，沙利度胺可抑制單個核細胞和巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α，從而減少淀粉樣蛋白的形成，下調β-淀粉樣蛋白轉化酶1(BACE1)的表達，具有較強的抗炎作用，這可能通過減少AD的中樞神經系統(tǒng)炎癥和淀粉樣蛋白的形成發(fā)揮作用。此外，沙利度胺對AD患者的中樞神經系統(tǒng)毒性較小，但安全性和耐受性仍未得到廣泛認可[2-3]。目前，沙利度胺作為一種潛在的治療腦損傷及相關疾病的藥物，是治療AD疾病的藥物研究熱點，但缺乏預防治療和機制探索，其效果值得進一步研究。蛋白質組學是一種蛋白質鑒定和蛋白質特性研究的先進技術。近年來，蛋白質組學為AD的防治和藥物研發(fā)提供了重要思路[4]。本研究使用Aβ1-42誘導的AD小鼠模型，應用Morris水迷宮實驗評價沙利度胺的認知改善作用，同時觀察海馬蛋白質組的表達差異，從蛋白分子水平探究沙利度胺干預AD的可能機制。

1 材料

1.1 動物雄性ICR小鼠40只，SPF級，體質量(30～35) g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2019-0010。根據動物倫理委員會要求，該動物在河南中醫(yī)藥大學SPF級動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，環(huán)境溫度控制在(22±2) ℃，光周期為12 h明/暗，適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物和試劑Aβ1-42(美國Abcam公司，批號：APN18050-1-1)；沙利度胺(常州制藥廠有限公司，批號：19031332)；BCA試劑盒(批號：20191022)；線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、IV、V試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：BC0515、BC3235、BC0945、BC1445)；十二烷基硫酸鈉(SDS，美國Bio-Rad，批號：161-0302)；尿素(美國Bio-Rad，批號：161-0731)；Tris(美國Sigma，批號：A6141)；二硫蘇糖醇(DTT，美國Bio-Rad，批號：161-0404)；碘乙酰胺(IAA，美國Bio-Rad，批號：163-2109)；甲酸(FA，德國Fluke，批號：06450)；三氟乙酸(TFA，美國Sigma，批號：T6508)；乙腈(ACN，德國Merck，批號：I592230123)。

1.3 主要儀器小鼠腦立體定位儀(實科生物技術有限公司)；空氣恒溫搖床(武漢中科科儀技術發(fā)展有限責任公司)；快速樣品勻漿系統(tǒng)(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)；高速冷凍離心機和全波長酶標儀(Thermo Fisher Scientific)；紫外可見光分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司制造)；AKTA Purifier100純化儀和電泳儀(美國GE Healthcare)；Easy nick色譜系統(tǒng)、Q Ex active質譜儀、SCX色譜柱、上樣柱、分析柱(美國Thermo Scientific)。

2 方法

2.1 動物分組、模型建立及給藥將Aβ1-42溶于0.9%生理鹽水中，稀釋至1 g·L-1，密封后，在37 ℃恒溫搖床中孵育7 d，老化至有毒聚集狀態(tài)，保存在4 ℃冰箱中。采用Morris水迷宮篩選不敏感的小鼠(90 s內未找到平臺)，隨機分為空白組、模型組、沙利度胺高劑量組(35 mg·kg-1)和沙利度胺低劑量組(18 mg·kg-1)。適應性飼養(yǎng)3 d后，各組小鼠分別稱質量，根據體質量，用l0%水合氯醛(3 mg·10 g-1)腹腔麻醉小鼠，俯臥位將小鼠頭部固定在腦立體定位儀上，暴露前囟門，前、后囟門處于一水平面上，根據《小鼠腦立體定位圖譜》，選擇注射區(qū)域為小鼠雙側海馬CA1區(qū)，剪開頭皮，暴露前囟門，沿頭顱中線切開長約2 cm切口，確定方位后，以鹵門為零點，后0.5 mm，側開1.0 mm距離，移動微量進樣器，深度為3.00 mm，每側注入3 μL聚集合的Aβ1-42，3 min內緩慢注入，保持進針5 min，用牙托粉封閉創(chuàng)傷口，縫合頭皮，單籠飼養(yǎng)，注意保暖，建立AD小鼠模型[5]。造模后恢復7 d，每天早上9時按照體質量灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21 d，空白組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 Morris水迷宮實驗測定小鼠空間與學習記憶能力用Morris水迷宮試驗對小鼠的學習記憶和空間識別能力進行了評估。水迷宮直徑為1.2 m，水深25 cm，水溫控制在(21±1) ℃，以黑白圖案作為參照物懸掛于水池周圍，整個實驗在避光、安靜環(huán)境下進行。定位航行實驗：檢測小鼠空間學習記憶的獲取能力。實驗開始后，將直徑為8 cm的平臺放置于第Ⅰ象限水下2 cm，小鼠分別從第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限同一位置入水，潛伏期：記錄小鼠90 s內找到水下平臺并站立于其上的時間；動物行為分析軟件追蹤小鼠的運動軌跡，每只小鼠持續(xù)4 d訓練，每日4次。空間探索實驗：檢測小鼠的空間記憶保持能力。d 5進行空間探索實驗時移除平臺，內壁參照物不變，將小鼠從同一個位置面向池壁放入水中，記錄小鼠在原平臺象限停留時間和90 s內跨越平臺的次數。

2.3 ELISA法檢測沙利度胺對小鼠海馬線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性表達Morris水迷宮實驗結束后，各組小鼠以3 mg·10 g-1劑量的l0%水合氯醛進行腹腔麻醉，冰上剝離海馬組織并稱質量。ELISA法測定小鼠海馬線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性。

2.4 HE染色觀察小鼠海馬CA1、CA2、CA3、DG區(qū)病理學改變行為學實驗結束后，各組小鼠斷頭并處死，腦組織被迅速移除并用4%多聚甲醛固定，取腦組織石蠟切片至水、石蠟包埋、切片3 μm厚、蘇木精-伊紅染色，400倍顯微鏡下觀察。

2.5 尼氏染色觀察小鼠海馬CA3區(qū)病理學改變常規(guī)脫蠟至水，后將切片放入10 g·L-1甲苯胺藍溶液中染色6 min，用蒸餾水浸泡約5 min后消除浮色，1%的冰醋酸分化，終止反應，控制分化程度，水洗，烤干切片，再用二甲苯透明，中性樹膠封片，在400倍鏡下比對海馬組織形態(tài)、神經元損傷程度和尼氏小體豐富程度改變。

2.6 小鼠海馬組織蛋白組學分析

2.6.1LC-MS/MS分析 分別收集空白組、模型組和沙利度胺給藥組各3只小鼠海馬組織，樣本數量為9例。每個樣品的200 μg蛋白質被整合到30 μL SDT緩沖液(4% SDS，100 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.6)，沸水浴5 min，超聲2 min，再沸水浴5 min，4 ℃ 20 000×g離心取上清。BCA法蛋白定量后進行蛋白樣品酶解，C18Cartridge脫鹽，在最大真空度下冷凍并干燥。之后的肽段用40 μL 0.1%甲酸溶液復溶，肽段定量(OD280)，將多肽片段含量計算后進行LC-MS分析。將每組適量的樣本肽段用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC(Easy nLC色譜系統(tǒng))進行分離，肽段分離后用Q-Ex active質譜儀進行質譜分析。

2.6.2數據庫檢索及蛋白鑒定、篩選 采用的質譜數據庫檢索軟件為Maquan(版本號1.5.3.17)，使用Uniport date base。并通過FDR<0.01的標準對數據進行偽陽性篩選，最后依據實驗目的輸出可以得到蛋白質定性或者蛋白定量分析數據表。在label-free quantification中質譜峰面積代表肽的絕對含量，通過對比各個樣品相同肽的質譜峰面積，直接獲得該肽段所代表蛋白質的相對定量信息。

2.6.3生物信息學分析 通過對不同樣本間鑒定到的蛋白質進行比較，采用標準生信分析方式GO注釋及富集分析、KEGG通路注釋及富集分析、蛋白質相互作用網絡分析等，以表達倍數>1.2倍并≤0.83倍值且P值<0.05(T-test或其他)的篩選標準，得到的顯著差異表達蛋白質有效的分開。

3 結果

3.1 藥效學評價

3.1.1沙利度胺對Aβ1-42致AD模型小鼠體質量影響 實驗期間，各組小鼠狀態(tài)良好，各組小鼠體質量均有增加，統(tǒng)計分析結果表明，不同組間小鼠體質量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。沙利度胺對小鼠體質量沒有明顯影響。

Tab 1 Effect of thalidomide on body weight of each group of mice

3.1.2沙利度胺對Aβ1-42致AD模型小鼠空間學習記憶障礙改善作用 定位航行實驗：隨著訓練時間的延長，各組小鼠逃避潛伏期均縮短。在4 d的實驗訓練中，與空白組相比，模型組小鼠在d 3、4潛伏期時長明顯增加(P<0.01)；與模型組相比較，沙利度胺高、低劑量組小鼠在d 3、4潛伏期時長明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)，d 4沙利度胺高、低劑量組平均逃避潛伏期接近空白組，表明沙利度胺能改善AD小鼠學習記憶能力，見Fig 1。空間探索實驗：與空白組相比，模型組穿越平臺的次數明顯縮短(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義，表明造模成功。與模型組相比，沙利度胺高、低劑量組小鼠通過平臺次數明顯增加，與空白對照組接近(P<0.05)，見Fig 2，3。

Fig 1 Influence of thalidomide on escape latency in different periods of AD mice #P<0.05，##P<0.01 vs Control group;**P<0.01 vs Model group

Fig 2 Influence of thalidomide on number of times crossing target platform in AD mice #P<0.05 vs Control group;*P<0.05 vs Model group

Fig 3 The experimental trajectory of thalidomide on water maze space exploration in AD A：Control group;B：Model control;C：High-dose group 35 mg·kg-1;D：Low-dose group 18 mg·kg-1

3.1.3沙利度胺對AD模型小鼠海馬線粒體復合物酶活性表達的影響 與空白組相比，模型組海馬線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ活性明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，沙利度胺高、低劑量組AD模型小鼠海馬組織線粒體復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ活性的表達明顯增加(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 The experimental results of thalidomide on mitochondrial viability in hippocampus of AD model mice

3.1.4各組小鼠海馬區(qū)HE染色結果 空白對照組小鼠海馬CA1-3(CA1/CA2/CA3)區(qū)及齒狀回(DG)的錐體層結構完整，神經元形態(tài)規(guī)則，胞漿透明且染色均勻；與空白對照組相比，模型組海馬神經元水平降低，細胞輪廓模糊，胞質缺失，胞核有缺損，核固縮程度不同，染色深。與模型組相比，沙利度胺高、低劑量組雖有輕度紊亂，但錐體細胞帶的細胞正常，細胞輪廓較清晰，核結構較明顯，胞漿透明，見Fig 4。

3.1.5各組小鼠海馬區(qū)尼氏染色結果 空白對照組海馬神經細胞形態(tài)結構完整，胞體飽滿，顏色較深，可見較多的尼氏小體。模型組小鼠海馬CA3區(qū)神經細胞數量明顯減少，細胞多成空泡狀，神經元核仁固縮或消失，尼氏顆粒不明顯，海馬正常結構毀損。與模型組相比，沙利度胺高劑量組海馬區(qū)恢復較好，神經元細胞數量增多，胞體飽滿，核仁大而圓，可見較多的尼氏體，見Fig 5。

Fig 4 Effect of thalidomide on hippocampal pathological morphology in AD mice A：Control group;B：Model control;C：High-dose group 35 mg·kg-1;D：Low-dose group 18 mg·kg-1；Black arrow：The cell shrank and was vacuolated;red arrow：The cell gap increased.

Fig 5 Effect of thalidomide on hippocampal Nissl body in AD mice A：Control group;B：Model control;C：High-dose group 35 mg·kg-1;D：Low-dose group 18 mg·kg-1；Black arrow：Nissl body;red arrow：Increased intercellular space

3.2 AD小鼠海馬蛋白質組差異表達及生物信息學分析

3.2.1AD小鼠海馬組織差異蛋白表達篩選 基于Label free組學技術，以表達倍數>1.2倍并<0.83倍且Pvalue<0.05(T-test或其他)的篩選標準結果表明，共有580個顯著性差異蛋白質，其中有227個上調蛋白和358個下調蛋白，與空白組相比較，在AD模型小鼠海馬區(qū)共有259個差異表達蛋白，其中上調90個，下調169個，其上調差異性蛋白主要參與細胞調節(jié)，DNA和蛋白質的合成，線粒體運輸及調控和跨膜轉運等生物過程，下調差異表達蛋白參與細胞過程異常調節(jié)，氨基酸代謝異常和蛋白質合成或代謝障礙，神經結構和功能的相關蛋白調節(jié)障礙等生物過程。

3.2.2AD小鼠海馬差異蛋白GO注釋及富集分析 根據GO蛋白數量富集分析發(fā)現，在生物學過程(biological process，BP)中，AD小鼠表達的差異蛋白質主要涉及蛋白質結構與代謝、骨形成調控作用、細胞內pH調節(jié)和內源性凋亡信號等，在細胞組分(cellular component，CC)分類中，差異蛋白質主要富集于內質網信號轉導，核糖體合成與代謝、胞質核糖體與小核糖體亞單位等，在分子功能(molecular function，MF)中，這些差異性蛋白質富集于核糖體結構組成、神經細胞軸突髓鞘結構組成和維生素D合成等,見Fig 6。

3.2.3AD小鼠海馬差異蛋白的KEGG富集分析與通路注釋 比較AD小鼠與空白對照組，KEGG富集分析發(fā)現，差異性蛋白涉及的信號通路主要為核糖體、輸出蛋白、嘧啶代謝、N-聚糖生物合成、糖胺聚糖降解通路發(fā)生明顯的蛋白質變化，見Tab 3。其中差異蛋白質最多的是核糖體通路有16個差異蛋白表達，作用于蛋白質翻譯、產熱通路有14個差異蛋白表達，調節(jié)適應環(huán)境和能量代謝水平氧化磷酸化通路有11個差異蛋白表達，見Fig 7。

Fig 6 GO enrichment analysis of differential proteins between blank group and model group

Fig 7 KEGG analysis of differential proteins in AD model mice

Tab 3 Enrichment analysis of KEGG pathway of differentially expressed proteins in hippocampus of AD model mice

3.3 沙利度胺干預AD小鼠海馬差異表達蛋白及生物信息學分析

3.3.1沙利度胺干預AD小鼠海馬組織差異蛋白表達篩選 經過給藥治療后，與模型組相比，沙利度胺給藥組共有127個蛋白表達差異，其中上調67個，下調60個，其中突觸小泡膜蛋白、小窩相關蛋白1過度表達，在調節(jié)細胞組成、組織、神經結構和功能的可塑性方面有著重要作用，并支持蛋白質合成、代謝和線粒體運輸等生物過程，其細胞定位包括細胞膜、細胞質、線粒體、細胞核等。

3.3.2沙利度胺干預AD小鼠海馬差異蛋白GO注釋及富集分析 與模型組比較，在BP中，沙利度胺給藥組表達差異蛋白質主要涉及到尿嘧啶合成與代謝過程、嘧啶核苷單磷酸合成與代謝過程、終止信號轉導調控和鞘磷脂代謝過程等。CC分類中，差異蛋白質主要富集于BRCA1-A復合物、線粒體呼吸鏈復合物IV、BRISC復合體和分泌性蛋白顆粒膜等。在MF中，差異蛋白質富集于丙氨酸轉氨酶活性、RNA聚合酶活性、DNA結合和氧化還原酶活性等，見Fig 8。

3.3.3沙利度胺干預AD小鼠海馬差異蛋白的KEGG注釋與富集分析 給藥組與模型組相比較，通過KEGG富集分析顯示真核生物中的核糖體生物發(fā)生通路、嘧啶代謝通路、鞘脂代謝通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路等發(fā)生了明顯變化。其中差異蛋白質最多的是產熱通路有11個蛋白表達差異，作用于環(huán)境調節(jié)和內質網中的蛋白質加工通路有6個蛋白表達差異，參與蛋白質折疊、分類和降解，見Fig 9，Tab 4。

Tab 4 The enrichment analysis of KEGG pathway in intervention of thalidomide on differentially expressed proteins in hippocampus of AD model mice

Fig 8 Analysis of GO enrichment of differential proteins between thalidomide group and model group

Fig 9 KEGG analysis of thalidomide intervention of differential proteins in AD model mice

3.3.4沙利度胺干預AD小鼠海馬差異蛋白相互作用網絡(PPI)分析 所有的高劑量給藥組和模型組的差異性蛋白構成了一個蛋白調控拓撲網絡，127個蛋白質有相互作用關系，拓撲網路中包含5個子網絡，橙色網絡團與抗細胞凋亡和調節(jié)自噬有關，下調CAD蛋白(Cad)為關鍵蛋白酶；橘色網絡團與神經遞質的釋放和跨膜轉運相關，下調突觸體相關蛋白23(Snap23)為關鍵蛋白酶；綠色網絡團與細胞信號轉導相關，下調磷脂酰肌醇3-激酶調節(jié)亞基β(Pik3r2)為關鍵蛋白酶；黃色網絡團與線粒體代謝相關，下調組蛋白結合蛋白(Rbbp7)和上調NAD依賴性蛋白脫?；竤irtuin-5(Sirt5)為關鍵蛋白酶；紅色網絡與蛋白質的合成和轉運相關，上調rRNA 2-O-甲基轉移酶原纖維蛋白(FL)，下調蛋白質轉運蛋白Sec61亞基γ(Sec61g)為關鍵節(jié)點蛋白，其關鍵蛋白為沙利度胺干預AD小鼠作用的相關預測蛋白質，見Fig 10。

Fig 10 Thalidomide intervention network diagram of differentially expressed proteins in hippocampus of AD mice

3.3.5AD小鼠與沙利度胺干預AD小鼠海馬的差異表達蛋白和生物信息學分析

3.3.5.1AD小鼠和沙利度胺干預AD小鼠差異表達蛋白 AD小鼠與沙利度胺干預AD治療后的海馬組織的差異性蛋白進行比較，共同表達的差異性蛋白質有36個。其中線粒體泛醌生物合成單加酶COQ6(Coq6)、線粒體UMP-CMP激酶(Cmpk2)、突觸體相關蛋白23(Snap23)、囊泡相關酶蛋白7(Vamp7)和突觸融合蛋白結合蛋白(Stxbp5l)等蛋白在AD模型小鼠中過度表達，經過沙利度胺干預治療后其蛋白均表達下調。另外NADH脫氫酶(Ndufa5)、核糖體蛋白(Rps9)、微管蛋白(Tuba1a)、cAMP依賴性蛋白激酶(Prkar2b)和組蛋白1(H1-1)等蛋白在沙利度胺給藥治療后的表達變化和空白組趨向一致，均表達上調，有回調趨勢，見Tab 5。

Tab 5 Thalidomide interfered with differentially expressed proteins in hippocampus of AD mice

3.3.5.2AD和沙利度胺干預AD小鼠差異表達蛋白KEGG通路 比較空白組、模型組和沙利度胺給藥組，確定受到顯著性影響的代謝和信號轉導途徑的KEGG通路富集分析，共篩選出13個具有差異性的通路，主要有神經變性的途徑-多種疾病(pathways of neurodegeneration-multiple diseases)通路，有34個蛋白表達差異；阿爾茨海默病通路，有29個蛋白表達差異；脘病毒病通路，有25個蛋白表達差異和帕金森綜合征通路，有24個蛋白表達差異，見Tab 6。其中參與阿爾茨海默病通路的蛋白主要有N-甲基-D-天冬氨酸受體鈣蛋白酶催化亞基2，細胞外信號調節(jié)激酶(ERK 1/2)、β-鏈蛋白，α-突觸核蛋白(α-synuclein，SNCA)、鈣蛋白酶(calpain)和20s、19s蛋白酶體(20s、19s Proteasome)等蛋白，其可能主要通過調控Wnt信號通路、氧化磷酸化和鈣信號通路來實現沙利度胺對AD治療作用。

Tab 6 Joint analysis of KEGG pathway of differentially expressed proteins in hippocampus of AD model mice

4 討論

近年來已經有多項研究發(fā)現，沙利度胺是一種應用廣泛的化合物，其分子機制是多方面的，沙利度胺及其衍生物被稱為免疫調節(jié)性酰亞胺類藥物(IMIDs)，是谷氨酸的衍生物，它們具有特異性和廣泛性的抗炎、免疫調節(jié)和抑制血管生成作用，可能會減少中樞神經系統(tǒng)炎癥，是一種新的免疫調節(jié)藥物和抗炎藥物，并且具有血腦屏障通透性和高生物利用度，有可能緩解神經退行性疾病的癥狀，減緩疾病的進展[6-7]。研究證實，沙利度胺對AD模型小鼠的中樞神經系統(tǒng)毒性作用較少，抑制AD β-分泌酶(BACE1)，降低了腦組織BACE1和抑制淀粉樣蛋白沉積的水平，減少神經膠質細胞的活化大量激活的小膠質細胞和星形膠質細胞，減輕其炎癥反應，似乎是一種很有前途的治療方法[3]，因此我們選擇在Aβ動物模型上研究沙利度胺的治療作用。Morris水迷宮實驗結果表明，沙利度胺能提高AD小鼠的學習記憶能力，海馬組織病理形態(tài)明顯改善，同時伴隨著海馬組織蛋白質表達的變化。

蛋白質組學已被證明成為揭示復雜生命活動各個方面的有效工具[8]，基于蛋白組學檢測和生物信息分析，沙利度胺干預AD小鼠海馬組織差異性蛋白質主要參與氧化磷酸化，調節(jié)線粒體的結構和功能。線粒體作為糖類、脂代謝的主要場所，在基質內進行由氧化磷酸化過程而產生的大量ATP，為機體供給熱能，調控Ca2+通道，調節(jié)氧化應激及細胞凋亡[9-10]。線粒體缺陷在AD突觸損傷和氧化損傷過程中產生了關鍵作用，其形式和功能的失常將會引起膽固醇和磷脂代謝紊亂、Ca2+失調和能量代謝缺乏等細胞功能障礙，其活性下降導致AD病理發(fā)生[1，11]。線粒體呼吸鏈酶復合物是位于線粒體內膜上的一種與氧化磷酸化有關的蛋白質，是由NADH脫氫酶復合物(Cx Ⅰ)、琥珀酸脫氫酶復合物(Cx Ⅱ)、細胞色素還原酶復合物(Cx III)、細胞色素氧化酶復合物(Cx Ⅳ)和ATP合成酶(Cx V)組成。在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，線粒體復合物I是最大和最復雜的復合體，與復合物III和復合物IV形成呼吸小體，其缺失將會造成呼吸鏈受損而供能不足，影響ATP合成代謝，增加ROS，誘發(fā)氧化應激，釋放細胞色素C，并直接導致細胞凋亡[12-13]。因此，提高線粒體復合物Ⅰ及相關蛋白的活性有助于改善線粒體呼吸功能，在AD模型小鼠中線粒體復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、V的活性減低，沙利度胺能夠明顯提高其活性，另外從蛋白組學的角度分析沙利度胺治療AD模型小鼠后同樣上調CxⅠ、Ⅱ、Ⅳ、V以及Sirt5蛋白的表達，下調蛋白包括泛醌生物合成單加氧酶COQ6、神經溶素等蛋白的表達，進一步證實了沙利度胺對線粒體功能有保護作用，從而改善線粒體功能及能量代謝障礙。另外線粒體缺陷在AD突觸損傷和突觸傳遞中起到關鍵作用，Aβ誘導的AD小鼠中，大腦組織中突觸相關蛋白也發(fā)生了改變，包括Snap23、Vamp7和Stxbp5l[14]。

此外，藥物同時對細胞骨架錨蛋白1(Ankyrin-1)以及微管相關蛋白(如小窩相關蛋白，微管蛋白α-1A鏈)可明顯增強，篩選出來的組蛋白3.3、核心組蛋白H2A以及組蛋白1.1，其乙酰化可以通過細胞應激誘導APP產生，組蛋白乙?；揎棶惓？赡芘cAD發(fā)生發(fā)展密切相關，沙利度胺干預治療后均有回調，檢測出來的肌苷5-磷酸脫氫酶2(Impdh2)已被證實為抗神經炎癥的一個顯著的靶點[15]，沙利度胺干預治療后其表達量下降，抑制了Impdh2依賴的神經炎性反應，此外相關蛋白，如小窩相關蛋白、cAMP依賴性蛋白激酶Ⅱ-β型調節(jié)亞基(Prkar2b)、磷脂酰肌醇3-激酶調節(jié)亞基β(Pik3r2)等也被發(fā)現與AD或者Aβ有著直接或者間接關系[16]。

綜上，本文基于label-free非標記定量蛋白質組學研究發(fā)現沙利度胺干預AD模型小鼠主要通過改變線粒體跨膜轉運蛋白和能量代謝相關蛋白的表達發(fā)生，有36個蛋白呈回調趨勢，并可能通過調控神經變性的途徑-多種疾病、阿爾茨海默病和帕金森綜合征3條通路實現對AD干預治療，其可能主要調控Wnt信號通路、氧化磷酸化。