胡蘆巴堿對H2O2誘導L02肝細胞氧化損傷的保護作用及機制

王瑞楠，馬宏婷，鐵芳芳，胡 娜，王洪倫，何彥峰

(1.青海民族大學藥學院，青海 西寧 810007；2.中國科學院西北高原生物研究所藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810001)

肝臟作為體內(nèi)代謝的中心站，涉及很多氧化還原過程，其旺盛的代謝活動必然會伴隨肝細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量生成[1]。ROS過量積累，在體內(nèi)形成氧化應激(oxidative stress，OS)，進而影響肝細胞中酶類及其受體的功能，干擾肝臟的氧化-還原穩(wěn)態(tài)，造成肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能破壞，肝細胞發(fā)生凋亡或壞死[2]。氧化應激被認為是導致衰老和多種疾病的重要因素[3]，因此，人們一直致力于從藥用植物及其次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)某些能通過改變氧化應激從而發(fā)揮保肝護肝的活性物質(zhì)。胡蘆巴堿(trigonelline,TRG)為傳統(tǒng)中藥胡蘆巴的主要活性成分之一，具有抗氧化[4]、保肝[5]等藥用價值。

Ilavenil等發(fā)現(xiàn)TRG可通過改善H2O2誘導的H9C2細胞的抗氧化活性，調(diào)節(jié)細胞凋亡和抗凋亡途徑，從而保護H9C2細胞免受H2O2誘導的細胞壞死和凋亡的影響。TRG還可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡(Caspase-3和Caspase-9)和抗凋亡(Bcl-2和Bcl-XL)途徑來抑制細胞凋亡。另外，還將槲皮素作為陽性對照藥，發(fā)現(xiàn)TRG抗氧化作用效果與槲皮素相當。槲皮素是自然界的一種黃酮類化合物，具有很強的生物活性，可通過減少氧化應激發(fā)揮抗氧化藥理作用。表明TRG通過激活抗凋亡途徑，對氧化應激介導的細胞凋亡有明顯的保護作用[6]。Zhang等[7]在非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠模型試驗研究中發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論。然而，國內(nèi)幾乎未見對TRG抗氧化活性的研究，國外的研究也甚少，目前還缺乏對TRG抗氧化作用機制的系統(tǒng)研究。因此本研究以TRG標準品為受試物，化學結(jié)構(gòu)如Fig 1所示。外源性H2O2處理可以增加細胞內(nèi)ROS的水平，引起細胞氧化損傷，是一種常見的氧化損傷模型的誘導劑。本研究以L02肝細胞為研究對象，探討TRG的抗氧化活性及其對H2O2誘導的L02肝細胞氧化損傷的保護作用，并探討其分子機制，旨在為TRG的抗氧化藥理作用研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料TRG標準品(批號：MUST-19083003，純度≥99.94%)購自成都曼斯特生物科技有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：2044181)購自Biological Industries公司；胎牛血清(批號：21100701)購自浙江天杭生物技術(shù)股份有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，批號：20210630)、MTT(批號：715F0525)購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，20211202)、谷胱甘肽(glutathione，GSH，20211202)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH，批號：20210622)等檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malondialdehyde，MDA，073120201016)和過氧化氫酶(catalase，CAT，081420200918)檢測試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒(批號：072721210907)等購自碧云天生物技術(shù)有限公司；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、B淋巴細胞瘤基因-2相關(guān)X蛋白(BCL2-associated X，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)等抗體(Cell Signaling Technology公司)；兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；30% H2O2(批號：20190302)購自國藥集團化學試劑有限公司。

Fig 1 The chemical structures of trigonelline

1.2 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Memmert ICP500，德國)；酶標儀(BioTek Synergy Epoch 2，美國)；倒置顯微鏡(Leica DMi1，德國)；高速冷凍離心機(Eppendorf 5430R，德國)；Tanon 5200化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；電泳儀(Tetra Cell，美國伯樂公司)；PL303電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；冷凍干燥機(LGJ-10，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司)；Eppendorf minispan離心機(Eppendorf，德國)。

1.3 L02細胞株及細胞培養(yǎng)L02人正常肝細胞購自中國科學院上海細胞所，在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)L02細胞24 h。

1.4 TRG對L02細胞毒副作用的檢測取對數(shù)生長期L02細胞，密度控制為5×107L-1，接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。用含0～200 μmol·L-1TRG替換原有培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，MTT法[13]檢測490 nm波長處的吸光值(A)。并計算細胞存活率。

細胞存活率/%= A處理組/A空白組×100%

1.5 H2O2誘導細胞氧化損傷模型的建立將L02細胞接種于96孔培養(yǎng)板。用無血清培養(yǎng)基將H2O2配成0～1 000 μmol·L-1等10個不同濃度，作用12 h后，同“1.3.2”MTT檢測方法并計算細胞存活率，確定H2O2的最佳造模濃度。

1.6 胡蘆巴堿對H2O2損傷后L02細胞存活率的影響將L02細胞接種于96孔培養(yǎng)板。實驗分為對照組(Con)、H2O2組和H2O2+TRG組。處理12 h后，同“1.3.2”MTT檢測方法并計算細胞存活率。

1.7 細胞內(nèi)LDH、MDA、GSH、SOD和CAT的測定取對數(shù)期L02細胞，密度控制為5×107L-1，接種于6孔板，24 h后細胞完全貼壁。按“1.3.4”分組處理12 h后，分別按照各個說明書進行操作，檢測細胞內(nèi)LDH泄漏量，SOD和CAT的活性以及GSH和MDA的含量。

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達同“1.3.5”的方法培養(yǎng)細胞。L02細胞加不同濃度的TRG處理與H2O2共同孵育12 h，抽提蛋白后定量并做變性處理，SDS-PAGE檢測β-actin、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase 3、Caspase 3、Nrf2和HO-1等抗體的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 TRG對L02細胞活力的影響TRG以不同濃度作用L02細胞12 h后，在3.125～200 μmol·L-1時對L02細胞無毒副作用，在濃度大于25 μmol·L-1時L02細胞活力開始稍有下降(Fig 2A)。因此，后續(xù)實驗選取濃度為25 μmol·L-1。

2.2 L02細胞氧化損傷模型的建立選取幾個不同濃度的H2O2對L02細胞進行12 h誘導。L02細胞的存活率隨著H2O2濃度的增加而顯著下降，見Fig 2B。以半數(shù)致死量(IC50)為原則，本研究選擇H2O2的造模濃度為650 μmol·L-1。

2.3 TRG對H2O2損傷L02細胞活力的影響MTT結(jié)果如Fig 2C所示，H2O2組細胞存活率與對照組相比具有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，3.125～25 μmol·L-1濃度下TRG能明顯提高H2O2損傷后L02細胞的活力(P<0.01)。

2.4 TRG對H2O2損傷L02細胞LDH、SOD、GSH、MDA和CAT的影響如圖Fig 3A,B所示，與空白組相比，H2O2組的LDH和MDA水平明顯升高(P<0.01)。經(jīng)TRG處理后，與H2O2組相比，LDH水平隨TRG濃度的增大逐漸降低，當TRG濃度>12.5 μmol·L-1時，LDH水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)；而低濃度的TRG(6.25 μmol·L-1)就能顯著降低MDA(P<0.01)。如Fig 3C-E，H2O2組的SOD、GSH和CAT水平較空白組相比明顯降低(P<0.01)。TRG處理后，SOD、GSH和CAT活性水平均得到改善。隨著TRG濃度的增加，其效果越好。上述結(jié)果表明，TRG能夠改善H2O2對L02細胞的氧化損傷。

2.5 TRG對H2O2損傷L02細胞相關(guān)蛋白表達的影響Western blot檢測經(jīng)H2O2刺激的L02細胞內(nèi)Nrf2、HO-1、Bcl2、Bax、cleaved Caspase 3、Caspase 3、JNK、ERK1/2等蛋白的表達水平及其磷酸化表達水平。與對照組相比，H2O2刺激后的L02細胞中Nrf2和HO-1表達受到顯著抑制，TRG作用后，隨著其濃度的增加，其在不同程度上能促進二者的表達水平，但是在檢測濃度范圍內(nèi)，TRG對Nrf2的影響未達到顯著水平(Fig 4A,B)。H2O2損傷的L02細胞中cleaved Caspase 3和Bax的表達升高，Caspase 3和Bcl-2被抑制。TRG作用后Caspase 3/cleaved Caspase 3和Bcl-2/Bax比值均有明顯上升(Fig 4C，D)，與對照組相比有顯著性差異(P<0.01)。此外，H2O2刺激后L02細胞中p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2比值提升，高濃度的TRG能明顯降低p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2和cleaved Caspase 3/Caspase 3的比值(P<0.01)，且隨著TRG濃度逐漸增加，作用越顯著(Fig 4E，F(xiàn))。

3 討論

肝細胞具有豐富的線粒體，容易產(chǎn)生氧化損傷的ROS，在各種肝損傷的發(fā)病機制中起著重要作用[8]。多種外源性刺激因子如酒精、藥物、環(huán)境污染物和輻射等均可引起肝細胞氧化應激。H2O2是一種強氧化劑，可通過細胞膜，直接改變細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，擾亂信號轉(zhuǎn)導，引起細胞損傷和細胞凋亡。經(jīng)過H2O2處理的肝細胞可能發(fā)生凋亡樣延遲性死亡或壞死[9]，因此，H2O2被廣泛用作肝細胞凋亡的外源性氧化應激介導實驗模型[1]，可誘導細胞線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，通過構(gòu)建H2O2誘導L02細胞體外氧化損傷模型，TRG干預后，能顯著提高H2O2損傷后L02細胞的存活率，改善在H2O2的刺激下L02細胞中SOD、CAT、GSH等抗氧化物的活性，同時抑制了細胞LDH泄漏和MDA含量的升高，從而發(fā)揮保護L02細胞的作用。

Fig 2 Effect of TRG and H2O2 on cell viability of L02 cells n=6)A:L02 cells were treated with TRG (0,3.125,6.25,12.5,25,50,100 and 200 μmol·L-1) for 12 h,and cell viability was determined by MTT assay;B:L02 cells were treated with H2O2 (0,50,100,300,400,500,600,700,800 and 1 000 μmol·L-1) for 12 h,and cell viability was determined by MTT assay;C:The effect of TRG on the survival rate of L02 cells injured by H2O2.*P<0.05,**P<0.01 vs Con;##P<0.01 vs H2O2

Fig 3 Effects of TRG on antioxidant index in L02 cells induced by H2O2 n=3)A:LDH level;B:MDA level ;C:SOD level;D:GSH level;E:CAT.**P<0.01 vs Con,#P<0.05,##P<0.01 vs H2O2.

Fig 4 Effects of TRG on expression of proteins in L02 cells induced by H2O2 n=3)A:Effects of TRG on expression of Nrf2 in L02 cells induced by H2O2;B:Effects of TRG on expression of HO-1 in L02 cells induced by H2O2;C:Effects of TRG on expression of Caspase 3/cleaved Caspase 3 in L02 cells induced by H2O2;D:Effects of TRG on expression of Bcl-2/Bax in L02 cells induced by H2O2;E:Effects of TRG on expression of p-JNK/JNK in L02 cells induced by H2O2;F:Effects of TRG on expression of p-ERK1/2/ERK1/2 in L02 cells induced by H2O2;#P<0.05,##P<0.01 vs H2O2;*P<0.05,**P<0.01 vs Con.

細胞凋亡是一種程序性生物過程，伴隨著形態(tài)學和生化改變，包括細胞收縮、凋亡體形成和Caspase激活等[10]。氧化應激和凋亡過程中的各種事件與ROS的產(chǎn)生、Bcl2家族蛋白的改變以及下游 Caspase家族蛋白的激活有重要聯(lián)系。Bcl-2和Bax蛋白是細胞存活和凋亡的常用指標，前者具抗凋亡活性，而后者具促凋亡活性。當Bax過度表達時，凋亡細胞對死亡信號的反應加??；另一方面，當Bcl-2過度表達時，與Bax一起抑制細胞凋亡。在本研究中，與H2O2模型組相比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)TRG干預H2O2損傷的L02細胞Bax水平有所下調(diào)，而Bcl-2水平則顯著上調(diào)，Bax表達的大量增加可能會激活細胞的凋亡信號，導致細胞死亡，TRG則可以通過與Bax表達相反的方式保護細胞免受氧化應激的損傷。Bax的凋亡還可以通過細胞色素C依賴性復合物激活Caspase 3[11]。Caspase 3是Caspase家族研究最廣泛的成員，在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，可被H2O2激活[12-13]。當細胞凋亡發(fā)生時，Caspase 3被活化成cleaved Caspase 3，發(fā)揮促凋亡的作用。本研究還證明了TRG作用后可以通過上調(diào)Caspase 3并下調(diào)cleaved Caspase 3的表達來保護L02細胞免受H2O2的傷害。

Nrf2是機體內(nèi)保持氧化還原平衡的重要因素，在氧化條件下，Nrf2激活了一組抗氧化基因和細胞保護基因，這些基因具有一個共同的抗氧化反應元件(ARE)，其中包括HO-1[14]。ROS的大量產(chǎn)生可刺激Nrf2表達，Nrf2的激活會導致抗氧化劑的表達和恢復氧化還原穩(wěn)態(tài)[15]，進而激活HO-1的表達。據(jù)發(fā)現(xiàn)，Nrf2缺陷小鼠更容易受到氧化應激和炎癥性疾病的影響[16]，因此Nrf2/HO-1通路被認為是氧化應激相關(guān)的重要機制之一，并且調(diào)控該通路可改善多種因素引起的肝臟損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，TRG干預后，隨著其濃度的增加，能使Nrf2和HO-1活性逐漸增強。上述研究結(jié)果表明，TRG可通過提高機體清除氧自由基和抗氧化能力進而有效保護了由H2O2導致的肝細胞損傷。

MAPK通路是一組中樞信號通路，對一系列細胞外刺激做出反應，并參與細胞凋亡、氧化應激、增殖和應激反應等多種細胞過程的重要信號通路[9]，并通過連續(xù)磷酸化和激活絲氨酸激酶來傳遞信號，是大多數(shù)細胞刺激過程的中樞調(diào)節(jié)器，當調(diào)節(jié)失調(diào)時會誘發(fā)許多疾病[18]。其家族成員ERK和JNK也廣泛參與氧化應激所致的肝細胞損傷與凋亡，在受到許多細胞外刺激而激活。本研究顯示，在H2O2誘導的L02細胞中，ERK1/2和JNK的磷酸化水平顯著增強，而TRG明顯抑制了ERK1/2和JNK的磷酸化水平，但沒有改變總ERK1/2和JNK蛋白質(zhì)的激活。這些結(jié)果說明，在L02細胞中，JNK和ERK1/2參與此過程，H2O2可能通過激活JNK和ERK1/2的表達而誘導細胞發(fā)生凋亡，而TRG具有抑制氧化應激狀態(tài)下MAPK通路活化的作用。

綜上所述，TRG可以提高機體清除氧自由基和抗氧化能力，從而逆轉(zhuǎn)H2O2刺激的肝細胞損傷。同時發(fā)現(xiàn)這一作用激活了Nrf2/HO-1信號通路，抑制了MAPK途徑，此外TRG還可通過降低L02細胞的cleaved Caspase 3和Bax活性，促進Bcl-2和Caspase 3表達來抑制細胞凋亡，從而起到抗氧化作用，本實驗結(jié)果為TRG后續(xù)的抗氧化藥理作用及臨床研究提供幫助。本研究僅局限于體外細胞實驗，因此，下一步我們將通過動物體內(nèi)實驗驗證TRG對機體氧化損傷的保護作用。