蛇床子素通過PINK1/Parkin通路誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬

劉國翔，戴 平，皇甫夢杰，王 娟，陳 旭

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541100)

宮頸癌是在婦科癌癥類型占比排名前三的癌癥，平均每年有約50萬患者被確診，約占所有新診斷癌癥的9%，通常通過子宮切除術(shù)、放療和化療進(jìn)行治療，每年造成約30萬人死亡[1]。在全國第3次因病死亡匯總中顯示，我國宮頸癌死亡率逐年下降，情況較為樂觀[2-3]。發(fā)達(dá)國家已經(jīng)組織了疫苗接種和篩查項(xiàng)目[4]。紫杉醇與順鉑聯(lián)合或紫杉醇、順鉑與貝伐珠單抗聯(lián)合，仍是治療的基石[5]。然而，所有這些宮頸癌的臨床化療都顯示出有限的有效性，最終腫瘤耐藥性會逐漸增強(qiáng)。中藥因其低毒性、多靶點(diǎn)的特性，目前為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[6]。

蛇床子素是天然香豆素類化合物，從蛇床子中提取而來[6]。雖然多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道蛇床子素對大部分腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡及自噬的作用，但是蛇床子素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制研究大多聚焦在凋亡方面[7]。自噬在不同類型、不同狀態(tài)的腫瘤中呈現(xiàn)出的不同的作用機(jī)制，調(diào)控自噬已成為腫瘤治療的重要手段。腫瘤細(xì)胞對自噬的依賴性是一個日益重要的研究領(lǐng)域[8]。目前針對蛇床子素如何誘導(dǎo)自噬的研究較少，而誘導(dǎo)過程中ROS水平上升，線粒體發(fā)生了損傷，也未曾將這一現(xiàn)象與線粒體自噬聯(lián)系。PINK1/Parkin是與線粒體自噬密切相關(guān)的信號通路，且參與ROS的氧化應(yīng)激。本研究擬觀察蛇床子素是否誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬，并判斷其自噬類型是否為線粒體自噬，為臨床治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株為桂林醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2動物 BALB/c裸鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.3藥物 蛇床子素(純度99.93%，成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS000828)。

1.1.4主要試劑 二甲亞砜(DMSO，美國Amresco公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Clark生物科技公司)；3-Methyladenine(3-MA)(美國MedChemExpress公司)；PINK1、Parkin、MFN1、抗體(美國Abcam公司)；DRP1抗體(南京恩晶生物公司)；LC3Ⅰ/Ⅱ抗體(美國CST公司)；β-Actin抗體(北京中杉金橋)；山羊抗兔、小鼠IgG(美國Santa Cruz公司)；MDC試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；DCFH-DA活性氧染料(美國Sigma公司)；JC-1熒光探針(上海碧云天公司)。

1.1.5主要儀器 Galaxy 170S型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)；A2-4S1級2型生物安全柜(新加坡ESCO公司)；超低溫冰箱(日本松下公司)；電泳槽，轉(zhuǎn)膜槽(美國BIO-RAD公司)；流式細(xì)胞儀(美國BIO-RAD公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1藥物的配制 蛇床子素用二甲亞砜配制成320 g·L-1的母液備用，使用前用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶和0.5 mmol·L-1EDTA的混合液消化傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞活力 將處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化后，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)量細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度。調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/孔，接種于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜貼壁后，過夜貼壁后，設(shè)置空白對照組(0，即Control，Ctrl)，不同濃度蛇床子素處理組(10、20、40、80、160、240、320 mg·L-1)，空白對照組加入等體積培養(yǎng)基，每組濃度設(shè)6個復(fù)孔。經(jīng)藥物處理，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6、12和18 h后，每孔加入20 μL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，用槍吹打使結(jié)晶溶解，混勻。在490 nm波長處測吸光度(OD)，用以下公式計(jì)算HeLa細(xì)胞的抑制率：

細(xì)胞抑制率/%=(空白對照組OD值-給藥組OD值)/空白對照組OD值×100%

1.2.4透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 將HeLa細(xì)胞傳代分為正常組與蛇床子素干預(yù)組，干預(yù)24 h后收集細(xì)胞沉淀，使用3%戊二醛溶液固定細(xì)胞，經(jīng)滲透包埋、切片、染色等步驟制備透射電鏡樣品，將兩組細(xì)胞樣品置于透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)差異。

1.2.5MDC熒光染色檢測自噬體形成 將HeLa細(xì)胞傳代至6孔板中，保持一定密度后待其貼壁加入80 mg·L-1蛇床子素處理。干預(yù)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌，將提前配置好的MDC試劑按5×10-5mol·L-1濃度加入六孔板中，室溫避光染色15 min后用PBS洗滌，在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)MDC檢測自噬 將HeLa細(xì)胞傳代至7 cm皿中，用80 mg·L-1濃度的蛇床子素分別干預(yù)0、6、12、18 h。處理完畢后PBS洗滌，用0.25%胰酶消化至15 mL離心管中離心，再各加入1 mL PBS重懸細(xì)胞洗滌，吸去上清液后，細(xì)胞沉淀置于1.5 mL Ep管中。各Ep管中加入0.3 mL PBS，然后均加入濃度為5×10-5mol·L-1MDC染色，室溫避光染色15 min，PBS洗滌重懸，過300目篩上機(jī)檢測。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)JC-1法檢測線粒體膜電位 將HeLa細(xì)胞傳代至7 cm皿中，用80 mg·L-1濃度的蛇床子素分別干預(yù)0 h、6 h、12 h、18 h。處理完畢后PBS洗滌，用0.25%胰酶消化至15 mL離心管中離心，再各加入1 mL PBS重懸細(xì)胞洗滌，吸去上清液后細(xì)胞沉淀置于1.5 mL Ep管中。各Ep管中加入0.3 mL PBS，然后均加入濃度為0.5 μmol·L-1的JC-1熒光探針避光染色20 min，PBS洗滌重懸，過300目篩上機(jī)檢測。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)DCFH-DA檢測ROS 將HeLa細(xì)胞傳代至7 cm皿中，一組用80 mg·L-1濃度的蛇床子素分別干預(yù)0、6、12、18 h；另一組使用3-MA自噬抑制劑預(yù)處理。處理完畢后PBS洗滌，用0.25 %胰酶消化至15 mL離心管中離心，再各加入1 mL PBS重懸細(xì)胞洗滌，吸去上清液后細(xì)胞沉淀置于1.5 mL Ep管中。各Ep管中加入0.3 mL PBS，然后均加入濃度為2×10-6mol·L-1ROS探針DCFH-DA，室溫避光染色25 min，PBS洗滌重懸，過300目篩上機(jī)檢測。

1.2.9建立裸鼠宮頸癌體內(nèi)移植瘤模型 取4周齡的BALB/c 裸鼠20只。將對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，按照4×107個/L 的細(xì)胞量懸浮于PBS中。在裸鼠右上肢皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，待瘤子長成100 mm3后進(jìn)行分組。裸鼠分為宮頸癌模型組、蛇床子素低劑量組(75 mg·kg-1·d-1)、蛇床子素高劑量組(150 mg·kg-1·d-1)、順鉑陽性藥對照組(5 mg·kg-1·d-1)，給藥方式為腹腔注射。定時(shí)記錄體質(zhì)量、瘤組織大小并觀察裸鼠狀態(tài)。給藥21 d后，處死裸鼠，剝離瘤組織稱質(zhì)量。將瘤組織過液氮后放入-80 ℃冰箱保存，以備提取蛋白。

1.2.10Western blot檢測蛋白表達(dá) 將HeLa細(xì)胞傳代至7 cm皿中，用80 mg·L-1濃度的蛇床子素分別干預(yù)0、6、12、18 h。處理完畢后收集細(xì)胞沉淀，加入蛋白裂解液，0～4 ℃裂解30 min，放入高速冷凍離心機(jī)離心，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min。將細(xì)胞樣品與瘤組織樣品通過BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配制凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，再封閉，敷上相應(yīng)一抗過夜，二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光顯色。利用Image Lab軟件分析灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用MTT法檢測不同濃度蛇床子素對HeLa細(xì)胞活力的影響。Fig 1結(jié)果表明，隨藥物濃度與干預(yù)時(shí)間的增加，HeLa細(xì)胞活力逐漸降低，且呈現(xiàn)濃度與時(shí)間依賴性(P<0.01)。根據(jù)MTT結(jié)果以及IC50值78.24 mg·L-1，選取蛇床子素濃度為80 mg·L-1分別處理HeLa細(xì)胞6、12和18 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬通過透射電鏡觀察細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器形態(tài)正常。蛇床子素干預(yù)組則在視野內(nèi)呈暗色，部分線粒體中空，僅外膜殘留；溶酶體異常聚集，呈現(xiàn)多膜樣結(jié)構(gòu)；有大量的自噬小體形成。熒光倒置顯微鏡下觀察經(jīng)MDC染色的兩組細(xì)胞，對照組熒光較弱，細(xì)胞數(shù)量較多；蛇床子素干預(yù)組則細(xì)胞數(shù)量較少，且MDC的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這表明有自噬體形成(Fig 2 A～F)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨蛇床子素干預(yù)時(shí)間增加，MDC的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，各組與空白對照組差異有顯著性(P<0.05)(Fig 2G和H)。結(jié)果說明，蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬體產(chǎn)生并引發(fā)自噬。

Fig 1 Inhibition of osthole on proliferation of **P<0.01 vs Ctrl

2.3 蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞線粒體損傷蛇床子素引起HeLa細(xì)胞自噬可能與誘導(dǎo)線粒體損傷有關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，隨蛇床子素干預(yù)時(shí)間增加，線粒體融合蛋白MFN1表達(dá)下調(diào)，分裂蛋白DRP1表達(dá)上調(diào)，這表明線粒體融合程度減少，分裂程度增加，損傷加重。為了進(jìn)一步說明線粒體損傷情況，我們使用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)來檢測線粒體膜電位變化。JC-1是檢測線粒體膜電位變化的理想熒光探針，膜電位較高時(shí)，JC-1熒光探針聚集在線粒體基質(zhì)中，呈紅色熒光；膜電位較低時(shí)，JC-1以單體存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨蛇床子素干預(yù)時(shí)間增加，紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，說明線粒體膜電位持續(xù)降低，損傷逐步加重。因此，蛇床子素誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞自噬與線粒體損傷有關(guān)(Fig 3)。

Fig 2 Osthole induced autophagy in HeLa cells with increasing intervention time*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl

2.4 蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生ROS蛇床子素促進(jìn)HeLa細(xì)胞自噬的機(jī)制與線粒體損傷有關(guān)，而線粒體損傷往往伴隨ROS水平上升。因此，我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測蛇床子素是否誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生ROS。結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度與干預(yù)時(shí)間成正比，且各組與空白對照組差異有顯著性(P<0.01)；使用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，蛇床子素誘導(dǎo)的ROS水平升高被逆轉(zhuǎn)，且差異有顯著性(P<0.01)。這一結(jié)果表明，蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生ROS，是通過誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬導(dǎo)致線粒體損傷而產(chǎn)生的(Fig 4)。

2.5 蛇床子素對HeLa細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)因子PINK1、Parkin和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響線粒體損傷與線粒體自噬不可分割，因此我們通過檢測蛇床子素對線粒體自噬相關(guān)因子的影響，來進(jìn)一步判定蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生的自噬是否為線粒體自噬。Western blot測定線粒體自噬關(guān)鍵因子PINK1、Parkin和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，PINK1、Parkin的表達(dá)增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值也增加。上述結(jié)果表明，蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬并且與PINK1-Parkin通路有關(guān)(Fig 5)。

2.6 蛇床子素對宮頸癌移植瘤的抑制作用上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛇床子素能夠抑制HeLa細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)了線粒體自噬。為了進(jìn)一步探討蛇床子素對宮頸癌的作用，建立了裸鼠宮頸癌移植瘤模型，并分為正常對照組、蛇床子素低劑量組、蛇床子素高劑量組和順鉑陽性藥組。由腫瘤生長曲線、腫瘤質(zhì)量和裸鼠外觀(Fig 6A-D)可知，對照組與給藥組差異有顯著性(P<0.01)，蛇床子素能明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長。此外，我們檢測了裸鼠移植瘤組織中線粒體自噬相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果表明，蛇床子素給藥組中，線粒體自噬關(guān)鍵因子PINK1和Parkin的表達(dá)升高，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也升高(Fig 6E和F)。上述結(jié)果表明，蛇床子素在裸鼠移植瘤中誘導(dǎo)了線粒體自噬。

Fig 3 Osthole induced mitochondrial damage in HeLa cells**P<0.01 vs Ctrl

Fig 4 Osthole promoted ROS production in HeLa cells **P<0.01 vs Ctrl;##P<0.01 vs Osthole

Fig 5 Effects of osthole on expression of PINK1，Parkin and LC3Ⅰ/Ⅱproteins related to mitochondrial autophagy**P<0.01 vs Ctrl

3 討論

宮頸癌作為最常見的婦科腫瘤，其發(fā)病率與死亡率均威脅女性健康[9]。目前使用常規(guī)化療藥物治療癌癥有許多弊端，例如毒副作用大，易耐藥等。而由于天然藥物低毒性，多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，使天然藥物抗腫瘤活性的研究日漸成為熱點(diǎn)。蛇床子素是一種具有抗炎、抗凋亡、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗過敏、抗骨質(zhì)疏松等功效的香豆素衍生物[10]，因其明顯的抗腫瘤活性引起學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注[11-13]。在本研究中我們探討了蛇床子素對宮頸癌的治療作用，研究蛇床子素對宮頸癌HeLa細(xì)胞的毒性作用。發(fā)現(xiàn)蛇床子素對HeLa細(xì)胞的增殖與活力具有抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間與濃度依賴性。

自噬誘導(dǎo)可以觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡，是一種不依賴胱天蛋白酶的形式，腫瘤細(xì)胞脫離藥物環(huán)境后，會產(chǎn)生受損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)，自噬若超過細(xì)胞可承受的范圍就會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[14]。自噬在不同類型、不同狀態(tài)的腫瘤中呈現(xiàn)出的不同的作用機(jī)制。一方面，腫瘤細(xì)胞處于不利環(huán)境中，輕度自噬可以提高腫瘤細(xì)胞對應(yīng)激的耐受能力；另一方面，自噬可以抑制腫瘤生長或轉(zhuǎn)移，甚至成為某些凋亡缺陷腫瘤細(xì)胞的死亡途徑，是把“雙刃劍”，而藥物引起的自噬多數(shù)是引起死亡。調(diào)控自噬已成為腫瘤治療的重要手段。本研究使用透射電鏡觀察HeLa細(xì)胞空白對照組與蛇床子素給藥組。結(jié)果顯示，蛇床子素能使HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬小體，并使部分細(xì)胞器損傷。利用單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明蛇床子素能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬，使HeLa細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。

Fig 6 Inhibitory effect of osthole on transplanted cervical cancer*P<0.05，**P<0.01 vs Control

自噬具有多種類型，而線粒體自噬是自噬的主要類型。哺乳動物線粒體中有絲分裂素Mfn1和Mfn2在3個不同的分子復(fù)合物中發(fā)揮作用，保持線粒體穩(wěn)態(tài)。如果表達(dá)下調(diào)，線粒體發(fā)生自噬受損會促使細(xì)胞死亡[15]。在癌癥細(xì)胞中，受損線粒體會導(dǎo)致ROS的大量產(chǎn)生[16]。Western blot檢測線粒體相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，蛇床子素使宮頸癌HeLa細(xì)胞的線粒體融合蛋白MFN1表達(dá)下調(diào)，線粒體分裂蛋白DRP1表達(dá)上調(diào)，提示線粒體動力學(xué)發(fā)生變化，即應(yīng)激水平升高，融合程度減少，分裂增多，線粒體發(fā)生損傷。JC-1線粒體膜電位結(jié)果顯示，紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，線粒體膜電位下降。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示隨蛇床子素濃度升高，活性氧ROS水平上升；再使用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后，再加入蛇床子素干預(yù)，結(jié)果顯示蛇床子素誘導(dǎo)的ROS上升被逆轉(zhuǎn)，提示抑制自噬后，ROS水平也隨之下降。表明蛇床子素使環(huán)境內(nèi)ROS水平上升，誘導(dǎo)了線粒體自噬受損。PINK與Parkin能協(xié)同識別損傷的線粒體，此過程中泛素化酶和去泛素化酶對維持Parkin活性及線粒體自噬的效率有重要作用。Parkin泛素化線粒體外膜蛋白會引發(fā)線粒體自噬，利用自噬清除目標(biāo)器官[17]，腫瘤細(xì)胞隨之發(fā)生死亡。PINK1/Parkin通路是研究最廣泛的線粒體自噬途徑[18]。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨加藥時(shí)間增加，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值上升，而LC3Ⅰ到LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化是自噬激活的證明；線粒體自噬相關(guān)因子PINK1和Parkin的表達(dá)也增加。裸鼠體內(nèi)宮頸癌移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有抑制腫瘤生長的作用，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值上升，線粒體自噬相關(guān)因子PINK1和Parkin的表達(dá)增加。以上結(jié)果表明，蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞線粒體損傷后自噬發(fā)生，且其誘導(dǎo)的線粒體自噬與PINK1/Parkin信號通路活化有關(guān)。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明，蛇床子素對HeLa細(xì)胞的增殖有抑制作用，并能夠促使細(xì)胞死亡，在此誘導(dǎo)過程中使線粒體受損，線粒體自噬發(fā)生，其機(jī)制與線粒體PINK1 /Parkin信號通路中PINK1和Parkin的活化有關(guān)。蛇床子素誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，或作為輔助藥物與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用增強(qiáng)療效，降低耐藥性，為治療宮頸癌提供新思路。但本研究未探明蛇床子素干預(yù)HeLa細(xì)胞的過程中是否存在其它的死亡形式，仍需進(jìn)一步探究。