二氯乙酸鹽協(xié)同維生素C抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及其作用機(jī)制

張曉宇，龍妮婭，劉 健，3，出良釗，

(貴州醫(yī)科大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)院、2.附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，3.貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 貴陽 550004)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科常見的惡性腫瘤之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見以及惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤[1]。外科手術(shù)聯(lián)合放化療是其主要的治療方法，然而神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后較差[2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)侵入到人體顱腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成腦部腫瘤的侵襲及對顱腦的壓迫等一系列問題，給治療帶來了較多困難[3]。二氯乙酸鹽(dichloroacetate，DCA)是一種小分子物質(zhì)，目前作為丙酮酸脫氫酶的抑制劑，應(yīng)用于乳酸中毒的治療[4]。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道DCA能夠影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的代謝，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖[5]。維生素C(vitamin C，VC)，又稱維他命C，是一種多羥基化合物，結(jié)構(gòu)類似葡萄糖，其分子中第2及第3位上兩個(gè)相鄰的烯醇式羥基極易解離而釋出H+，故具有酸的性質(zhì)，又稱L-抗壞血酸[6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，藥物劑量的維生素C具有潛在的抗腫瘤活性，如胰腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌等，且藥物耐受性是在可接受范圍內(nèi)[7]。此外，藥物劑量的VC可以增強(qiáng)腫瘤對藥物的敏感性[8]。如研究者發(fā)現(xiàn)VC可以穩(wěn)定姜黃素在大鼠體內(nèi)藥效的穩(wěn)定性，協(xié)同姜黃素抑制小鼠結(jié)直腸癌腫瘤的生成[9]。然而，VC與DCA是否具有協(xié)同作用以及其作用機(jī)制仍不清楚。

本研究探討了DCA和VC聯(lián)合用藥后對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251增殖、遷移以及侵襲的影響，并分析其可能的作用機(jī)制，以期為臨床的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療提供潛在的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞NHA以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251均購自武漢Procell公司。

1.1.2主要試劑 Dulbecco′s modified eagle medium (DMEM)培養(yǎng)基(貨號：C11995500BT)購自美國Gibco生物公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素三抗(貨號：J180027)購自索萊寶公司；胎牛血清(FBS；貨號：1913444)購自Biological industries公司；DCA(貨號：HY-Y0445A)購自MedChemExpress公司；VC(貨號：A800295)購自美國麥克林公司；放線菌酮(CHX)購自Selleck生物公司；CCK-8試劑(貨號：CK-04)購自日本同仁公司；活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA貨號：CA1410)購自北京北奧萊博科技公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號：40302ES60)購自上海翊圣生物公司；細(xì)胞周期試劑盒(貨號：KGA511)購自南京凱基生物公司；BALB/c雌性裸鼠(5周) 購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司；多克隆抗體BCL2A1(貨號：12789-1-AP)、CDC25A(貨號：55031-1-AP)、細(xì)胞色素C(Cytochrome,貨號：10993-1-AP)、caspase-7(貨號：27155-1-AP)、CDK4(貨號：11026-1-AP)、CDK6(貨號：14052-1-AP)和β-actin(貨號：20536-1-AP)均購自武漢三鷹Proteintech公司；多克隆抗體cleaved-caspase-7(貨號：8438)購自于美國CST生物公司；山羊抗兔二抗(貨號：BS13278)購自博士德有限公司；Immobilon Western HRP曝光液(貨號：WBKLS0500)購自EMD Millipore公司。

1.1.3儀器 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(貨號：2001HY-6003，美國賽默飛公司)；超凈操作工作臺(貨號：SW-CJ2D，蘇州凈化生物有限公司)；Epoch型全波長酶標(biāo)儀(貨號：ELx800，美國Bio-Tek公司)；流式細(xì)胞儀(貨號：6890-5973N，美國安捷倫生物公司)；倒置顯微鏡(DM500，德國徠卡公司)；多功能成像系統(tǒng)(貨號：JP-K300，美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與藥液配置 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NHA、U87和U251培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(高糖DMEM，其中添加10%胎牛血清FBS和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素)中，將其放置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DCA、VC和CHX分別用DMSO配置為100 mmol·L-1的母液，使用前母液均存儲(chǔ)于-20 ℃冰箱。

1.2.2CCK-8法檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性 取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的NHA、U87和U251細(xì)胞，5×103個(gè)/孔均勻接種于無菌的96孔板，每孔100 μL細(xì)胞；分別予以0、1、2、3、4、5、6、7和8 mmol·L-1的VC處理NHA、U87和U251細(xì)胞；在探究DCA與VC的協(xié)同效果時(shí)，分別以0、5、10、15、20和25 mmol·L-1的DCA單獨(dú)或聯(lián)合5 mmol·L-1VC處理U87和U251細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。藥物處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，放置在培養(yǎng)箱中且避光孵育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測其OD值。細(xì)胞增殖率/%=(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。此外，用金氏公式計(jì)算兩個(gè)藥物的協(xié)同作用。公式為：q=E(A+B)/[EA+(1- EA)·EB]，其中E(A+B)為兩藥物聯(lián)合作用細(xì)胞后的抑制率，EA、EB分別為單一藥物分別作用細(xì)胞后的抑制率，q>1.15為協(xié)同作用，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力 取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的U87和U251細(xì)胞(3×103個(gè)/孔)均勻接種于6孔板中，分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。14 d后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞25 min。吸棄4%的多聚甲醛溶液，用PBS清洗3次，每次3 min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液在室溫下染色25 min。吸棄0.1%結(jié)晶紫溶液，用PBS清洗3次，每次3 min，烘箱過夜烘干，拍照，計(jì)數(shù)各組的克隆形成數(shù)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性氧含量 取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的U87和U251細(xì)胞，5×104個(gè)/孔均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞24 h貼壁后，分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞。各組培養(yǎng)24 h后，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞，將提前配置好的1 ∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA加入各管細(xì)胞中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，室溫避光30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞處理方法同“1.2.4”，加入15 μL的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer，Annex V-FITC)、5 μL的碘化丙啶(propidium iodide,PI)和400 μL的Loading buffer室溫避光30 min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期 細(xì)胞處理方法同1.2.4，加入5 μL RNase酶，在37 ℃恒溫?fù)u床孵育15 min后，加入400 μL的碘化丙啶(propidium iodide,PI)室溫避光反應(yīng)30 min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移的能力 細(xì)胞處理方法同1.2.4，待培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90%～100%融合度時(shí)，用200 μL槍頭在6孔板各孔底部做輕柔劃痕，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次3 min。分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，分別于0 h和24 h拍照，使用軟件ImageJ測量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞的遷移率/%=(0 h劃痕的寬度-24 h劃痕的寬度)/0 h劃痕的寬度×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8Transwell實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力 用Matrigel膠均勻鋪于24孔板的小室上室內(nèi)，取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的U87和U251細(xì)胞(2×104個(gè)/孔)在無血清培養(yǎng)基混勻后接種于24孔板中上室。下室每孔加入700 μL的完全培養(yǎng)基。分別以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，待24 h后，吸去上室和下室中的培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞25 min，吸棄4%的多聚甲醛溶液，用PBS清洗3次，再用0.1%結(jié)晶紫溶液在室溫下染色25 min。PBS清洗3次，烘箱過夜烘干。取出置于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野(上、下、左、右和中)拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.9皮下移植瘤動(dòng)物模型的建立 BALB/c雌性裸鼠(飼養(yǎng)于溫度為25 ℃，濕度在50%的環(huán)境下，光照時(shí)間為12 h·d-1，自由進(jìn)食無菌水和無菌飼料，喂養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境后接種細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)，在每只裸鼠左側(cè)腋窩處給予U251細(xì)胞懸液0.1 mL(含2×106個(gè)細(xì)胞)。d 12后，挑選腫瘤體積在50～60 mm3的裸鼠，隨機(jī)分為4組，即DMSO、DCA單藥、VC單藥以及兩藥聯(lián)合處理組。DCA組每天瘤周注射15 mmol·L-1DCA液100 μL，VC組每天瘤周注射5 mmol·L-1VC液100 μL，聯(lián)合組每天瘤周注射含15 mmol·L-1DCA和5 mmol·L-1VC的混合液100 μL，而DMSO組則每天瘤周注射等體積DMSO。每3 d測量1次腫瘤體積，腫瘤體積:V=(長×寬)2/2。d 27對裸鼠進(jìn)行安樂死處理，解剖腫瘤并拍照。

1.2.10DCA和VC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的重要靶點(diǎn)預(yù)測分析 根據(jù)DCA、VC的藥效團(tuán)，利用TargetNet(http://targetnet.scbdd.com/)分析預(yù)測DCA和VC的蛋白靶點(diǎn)，以Cytoscape軟件可視化藥物靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。此外，運(yùn)用在線工具GEPIA軟件(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析靶點(diǎn)的表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。

1.2.11Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的U87和U251細(xì)胞(1×106個(gè)/孔)均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞密度至70%～80%的融合度后，以等體積DMSO(對照組)、15 mmol·L-1DCA單藥、5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞。處理48 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌后分別加入RIPA 細(xì)胞裂解液混合液100 μL，放置于冰上且在搖床上裂解20 min，收集含蛋白的裂解液于1.5 mL離心管中，于4 ℃、12 000 r·min-1離心后取上清液，運(yùn)用BCA法定量相關(guān)蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液5×loading buffer混合，100 ℃，15 min。各加入25 μg蛋白樣品以110 V恒壓電泳，并以300 mA恒定電流將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉封閉，分別加入BCL2A1、CDC25A、cytochrome C、caspase-7、cleaved-caspase-7、CDK4、CDK6和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。回收一抗后，用TBST清洗，加入山羊抗兔/山羊抗鼠二抗，室溫孵育，清洗條帶，曝光，于多功能成像系統(tǒng)曝光顯影。BCL2A1、CDC25A、cytochrome C、CDK4和CDK6以β-actin作為內(nèi)參蛋白，cleaved-caspase-7以caspase-7為內(nèi)參蛋白，根據(jù)其灰度值計(jì)算其相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.12蛋白降解率檢測 用1 μmol·L-1放線菌酮(CHX)抑制U87和U251細(xì)胞的蛋白翻譯，同時(shí)分別給予DMSO、15 mmol·L-1DCA和5 mmol·L-1VC單藥以及兩者聯(lián)合處理0、0.5、1.0和2.0 h。RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白樣本，步驟同“1.2.11”，檢測各組細(xì)胞中BCL2A1和CDC25A的降解水平。

2 結(jié)果

2.1 DCA、VC和兩者聯(lián)合作用對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響CCK-8細(xì)胞結(jié)果(Fig 1A)顯示，VC對U87和U251的IC50為7.6 mmol·L-1和7.1 mmol·L-1。然而，此濃度對NHA有較大的非特異性毒性；5 mmol·L-1VC對NHA毒性較低，被選做用于后續(xù)聯(lián)合的濃度。以不同濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的DCA單獨(dú)處理或聯(lián)合5 mmol·L-1VC處理U87細(xì)胞，聯(lián)合協(xié)同指數(shù)(q值)分別為0.91、1.33、1.75、1.47、1.40，其中，DCA單藥對U87的IC50為24.1 mmol·L-1，而存在5 mmol·L-1VC的情況下IC50為16.8 mmol·L-1。以不同濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的DCA單獨(dú)處理或聯(lián)合5 mmol·L-1VC處理U251細(xì)胞，各組聯(lián)合協(xié)同指數(shù)(q值)分別為0.87、1.30、1.67、1.40、1.38，其中，DCA單藥對U251的IC50為22.8 mmol·L-1，而存在5 mmol·L-1VC的情況下IC50為17.2 mmol·L-1。結(jié)果提示，10、15、20和25 mmol·L-1DCA與5 mmol·L-1VC能夠協(xié)同抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251細(xì)胞的增殖，其中，15 mmol·L-1DCA與5 mmol·L-1VC的聯(lián)合指數(shù)最佳，因此，選擇該聯(lián)合劑量用于后續(xù)研究。

Fig 1 Effects of different concentrations of DCA,VC and their combination on proliferation of neuroglioma U87 and U251 cells in vitro A:Effect of different concentrations of VC on proliferation of neuroglioma U87 and U251 cells;B:Effect of different concentrations of DCA combined with 5 mmol·L-1 VC on proliferation of neuroglioma U87 and U251 cells.**P<0.01 vs control.

2.2 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 2)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯(lián)合用藥組中U87細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為(333±25.24)個(gè)、(241±10.50)個(gè)、(212±11.15)個(gè)、(113±10.21)個(gè)；DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯(lián)合用藥組U251克隆形成數(shù)分別為(83±5.13)個(gè)、(64±3.22)個(gè)、(73±4.36)個(gè)、(31±7.51)個(gè)；與DMSO對照相比，單藥和聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的增殖率均明顯減少(P<0.05)；與單藥處理相比，聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的增殖率均明顯減少(P<0.05)。提示，VC能夠協(xié)同DCA抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成。

Fig 2 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on cell colonies of neuroglioma U87 and U251 *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.

2.3 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生活性氧含量的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(Fig 3)顯示，與DMSO對照相比，單藥處理后U87和U251細(xì)胞的活性氧含量增加不明顯；然而，與對照組和單藥處理組相比，聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的活性氧含量明顯增加。提示，VC能夠協(xié)同DCA促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性氧生成。

Fig 3 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on reactive oxygen content of neuroglioma U87 and U251

Fig 4 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on apoptosis of neuroglioma U87 and U251 *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.

2.4 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(Fig 4)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組中U87細(xì)胞的凋亡率分別為(2.39±0.67)%、(5.49±0.27)%、(7.12±1.05)%、(17.56±0.68)%。DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組中U251細(xì)胞的凋亡率分別為(2.76±0.56 )%、(6.22±0.92)%、(5.98±1.43)%、(16.22±1.02)%；與DMSO對照相比，單藥和聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的凋亡率均明顯增加(P<0.05)；與單藥處理相比，聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的凋亡率均明顯增加(P<0.05)。提示，VC能夠協(xié)同DCA促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

2.5 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(Fig 5)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯(lián)合用藥組中U87細(xì)胞在G1期的百分比分別為(51.39±1.19)%、(57.48±2.05)%、(56.53±1.01)%、(74.72±1.50)%；在S期的百分比分別為(33.23±0.86)%、(28.57±0.79)%、(29.84±2.86)%、(21.60±1.03)%；在G2/M期的百分比分別為(16.41±1.06)%、(13.49±1.09)%、(11.42±0.62)%、(5.46±0.84)%。DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組、聯(lián)合用藥組中U251細(xì)胞在G1期的百分比(24.31±2.32)%、(44.48±2.20)%、(46.92±1.58)%、(62.83±2.21)%；在S期的百分比分別為( 31.72± 1.52)%、(28.91±1.78)%、(28.11±1.55)%、(25.09 ±1.80)%；在G2/M期的百分比分別為(43.84±1.67)%、(22.53±1.47)%、(22.81 ±1.86)%、(8.23 ±1.88)%。與DMSO對照相比，單藥和聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的阻滯在G1期的細(xì)胞百分比均明顯增加(P均<0.05)；與單藥處理相比，聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的阻滯在G1期的細(xì)胞百分比均明顯增加(P<0.05)。提示，VC能夠協(xié)同DCA誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G1期。

2.6 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 6)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組U87細(xì)胞遷移率分別為(100.00±7.00)%、(44.33±4.90)%、(56.00±5.60)%、(26.33±4.50)%；DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組U251細(xì)胞遷移率分別為(100.00±8.50)%、(66.00±10.40)%、(73.33±1.70)%、(37.33±3.50)%。與DMSO對照相比，單藥和聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的遷移率均明顯減少(P<0.05)；與單藥處理相比，聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的遷移率也均明顯減少(P<0.05)。提示，VC能夠協(xié)同DCA抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。

Fig 5 Effect DMSO,DCA,VC and their combination on cell cycle of neuroglioma U87 and U251 *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.

2.7 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 7)顯示，DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組中U87細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(850±36)個(gè)、(440±40)個(gè)、(449±30)個(gè)和(80±17)個(gè)；DMSO對照組、DCA單藥組、VC單藥組和聯(lián)合用藥組中U251細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(868±66)個(gè)、(729±34)個(gè)、(423±20)個(gè)和(76±15)個(gè)。與DMSO對照相比，單藥和聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P均<0.05)；與單藥處理相比，聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)也均明顯減少(P<0.05)。提示，VC能夠協(xié)同DCA抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

2.8 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251體內(nèi)增殖的影響如Fig 8，與DMSO對照組相比，DCA和VC單藥處理后U251形成的腫瘤組織體積減少；與DCA和VC單藥相比，兩者聯(lián)合處理后，腫瘤組織體積明顯減少(P均<0.05)。

2.9 分析DCA與VC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的重要靶點(diǎn)根據(jù)DCA和VC的藥效團(tuán)，利用在線軟件TargetNet預(yù)測發(fā)現(xiàn)，DCA有36個(gè)可能的作用靶點(diǎn)，VC有9個(gè)可能的作用靶點(diǎn)。其中，有7個(gè)蛋白靶點(diǎn)為兩者共同的作用靶點(diǎn)，如CDC25A、S1PR2、PPO2F、DPS、BCL2A1、ALOX15和CES1(Fig 9A-B)。其中，對作用靶點(diǎn)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)蛋白靶點(diǎn)BCL2A1和CDC25A患者較低表達(dá)患者總體生存率明顯減少(Fig 9C-D)。提示，抑制BCL2A1和CDC25A是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一種治療策略，BCL2A1和CDC25A可能是DCA和VC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)。

Fig 6 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on migration of neuroglioma U87 and U251 using wound *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.

Fig 7 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on invasion of neuroglioma U87 and U251 cell using *P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.

2.10 DCA聯(lián)合VC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BCL2A1、CDC25A、CDK4、CDK6、cytochrome C和cleaved- caspase-7的影響Western blot結(jié)果(Fig 10)表明，與DMSO對照組相比，DCA和VC以及兩者聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞中BCL2A1、CDC25A、CDK4和CDK6的表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，cytochrome C和cleaved-caspase-7的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；與DCA和VC單獨(dú)用藥組相比，兩者聯(lián)合處理后U87和U251細(xì)胞中BCL2A1、CDC25A、CDK4和CDK6的表達(dá)量也明顯減少(P<0.05)，cytochrome C和cleaved-caspase-7的表達(dá)量也明顯增加(P<0.05)。

2.11 VC聯(lián)合DCA對BCL2A1和CDC25A蛋白降解率的影響基于BCL2A1和CDC25A可能是DCA聯(lián)合VC的重要靶點(diǎn)，我們以CHX抑制細(xì)胞的蛋白合成后，探究各組細(xì)胞中BCL2A1和CDC25A蛋白的降解率。結(jié)果提示(Fig 11)，與DMSO對照組相比，各處理組BCL2A1和CDC25A蛋白的降解率均明顯增加。與DCA和VC單藥相比，聯(lián)合組中BCL2A1和CDC25A蛋白的降解率明顯增加。提示，VC和DCA兩者聯(lián)合具有促進(jìn)BCL2A1和CDC25A降解的作用。

Fig 9 Prediction of target proteins of BCL2A1 and CDC25 action (A,B) between DCA and VC,the prognosis of patients between BCL2A1 and CDC25A (C,D)

Fig 10 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on expression of BCL2A1,CDC25A,CDK4,CDK6,cytochrome C, caspase-7,cleaved-caspase-7 proteins in neuroglioma U87 and U251 cells detected by Western blot A:Protein expression in U87;B:Protein expression in U251.*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs DCA,δP<0.05 vs VC.

Fig 11 Effect of DMSO,DCA,VC and their combination on expression of BCL2A1, CDC25A U87 and U251cells detected by Western blot A:Protein expression in U87;B:Protein expression in U251.

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病位置比較特殊，正常的腦組織與腫瘤組織之間的邊界較模糊，通過外科手術(shù)徹底清除病灶的難度較大，治療效果較差且容易復(fù)發(fā)，病死率高[10]。因此，開發(fā)新的治療藥物對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療有重要意義。

DCA是一種臨床上用于治療糖尿病的代謝調(diào)節(jié)劑。近年來，研究發(fā)現(xiàn)DCA能夠抑制丙酮酸脫氫酶激酶的活性，繼而減少乳酸的形成，因此可以逆轉(zhuǎn)瓦爾堡效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[11]。DCA能夠通過促進(jìn)YAP通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖[12]。此外，Korsakova等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DCA和二甲雙胍聯(lián)合用藥可以靶向抑制體內(nèi)外神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。因此，DCA與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可能成為提高療效的一種可行方法。有研究發(fā)現(xiàn)高劑量VC對多種惡性腫瘤,例如淋巴瘤等,均有明顯的治療效果,并有臨床試驗(yàn)證實(shí)了靜脈滴注大劑量VC對惡性腫瘤的治療效果甚佳[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，VC是一種良好的增敏劑，與多種傳統(tǒng)的化療藥物有協(xié)同作用[8]。

本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VC與多個(gè)濃度(10、15、20和25 mmol·L-1)的DCA具有協(xié)同作用。其中，5 mmol·L-1的VC與15 mmol·L-1的DCA的協(xié)同效果最佳。進(jìn)一步，以該協(xié)同濃度處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251細(xì)胞。克隆平板、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)以及transwell小室實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，5 mmol·L-1的VC與15 mmol·L-1的DCA能夠協(xié)同減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87的克隆形成、遷移和侵襲能力，并明顯誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧含量的增加，細(xì)胞凋亡和G1期阻滯。此外，皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明，5 mmol·L-1的VC與15 mmol·L-1的DCA能夠明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251體內(nèi)的增殖。這些證據(jù)均表明，DCA和VC聯(lián)合可能是抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性行為的一種有效治療策略。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過生物信息學(xué)手段，預(yù)測及模擬藥物分子與靶蛋白之間的相互作用，為分子的作用提供間接或直接證據(jù)。為探究DCA和VC是如何發(fā)揮協(xié)同機(jī)制的，本研究基于DCA和VC的藥效團(tuán)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DCA有36個(gè)潛在作用靶點(diǎn),VC可能有9個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。兩者取交集得到7個(gè)共同靶點(diǎn)，其中包括BCL2A1、CDC25A和S1PR2等。進(jìn)一步生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)BCL2A1和CDC25A的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者總體生存率較低。BCL2A1是BCL-2家族的一個(gè)抗凋亡成員，半衰期較短，這限制了其固有的促生存活性，這一特征與它的兩個(gè)近親MCL-1和BCL-B相同。有文獻(xiàn)報(bào)道，降解BCL2A1可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C的增加和釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。CDC25A是CDC25磷酸酶家族的一員，可以調(diào)控周期蛋白CDK4/CDK6復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。CDC25A的表達(dá)在多種腫瘤中表達(dá)升高，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，CDC25A能夠通過活化多個(gè)信號通路如FAK和AKT等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。

為探究DCA與VC的協(xié)同機(jī)制是否與抑制BCL2A1和CDC25A相關(guān)，本研究進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCA能夠協(xié)同VC抑制BCL2A1和CDC25A的表達(dá)，并減少CDC25A下游CDK4和CDK6的表達(dá)。CDK4/CDK6是細(xì)胞通過G1期檢查點(diǎn)必要的蛋白，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)G1期阻滯結(jié)果一致。此外，BCL2A1下游的Cytochrome C和cleave-caspase-7在聯(lián)合處理后也明顯增加。已有研究表明，藥物與靶點(diǎn)蛋白直接結(jié)合后，可僅影響蛋白的修飾水平(不影響表達(dá))，也可能會(huì)影響蛋白的構(gòu)象改變，進(jìn)而影響蛋白降解[18]。進(jìn)一步，為證實(shí)VC和DCA是否具有直接影響B(tài)CL2A1和CDC25A的作用，我們以CHX抑制U87和U251細(xì)胞中的蛋白合成，發(fā)現(xiàn)，VC和DCA均能促進(jìn)BCL2A1和CDC25A的降解率，兩者聯(lián)合誘導(dǎo)蛋白降解的效果更加明顯。結(jié)果提示，DCA和VC可能是協(xié)同促進(jìn)BCL2A1和CDC25A的降解，發(fā)揮其作用的。

綜上所述，VC能夠協(xié)同DCA促進(jìn)BCL2A1和CDC25A的降解，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為。VC聯(lián)合DCA可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的一種可行策略。