芍藥內(nèi)酯苷對人卵巢癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

韓 立，郭曉娟，杜瑞娟，陳 怡，費(fèi)慶林，郭克磊，卞 華

(1.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，2.南陽理工學(xué)院，河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004)

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，以上皮性卵巢癌居多[1]。外科手術(shù)結(jié)合基于鉑類的化療或者不宜手術(shù)的患者直接進(jìn)行化療是目前卵巢癌的治療方式。然而，化療導(dǎo)致的腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)始終是臨床腫瘤治療難以逾越的障礙。

MYC(也稱為c-myc)是編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因或原癌基因家族第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的基因，該基因家族還包括l-myc(MYCL)和n-myc(MYCN)。MYC高表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移，并與CDK4/6抑制劑單藥治療復(fù)發(fā)性卵巢癌的臨床療效差密切相關(guān)[2]。此外，MYC可通過直接與程序性死亡蛋白-1(programmed death 1，PD-1)啟動(dòng)子結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)，MYC激活可促進(jìn)PD-1表達(dá)，抑制MYC則抑制PD-1表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤對抗PD1免疫治療的敏感性，表明MYC本身可作為抗腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[3]。WW結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶1(WW domain-containing ubiquitin E3 ligase 1，WWP1)高表達(dá)與卵巢癌預(yù)后差密切相關(guān)[4]。有研究表明，MYC通過直接靶向WWP1，促進(jìn)腫瘤MDR[5]。因此，靶向MYC和WWP1開發(fā)逆轉(zhuǎn)MDR藥物對于臨床腫瘤的治療具有重要意義。

芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin，AL)是芍藥、牡丹皮等中藥的活性成分之一，具有治療認(rèn)知功能障礙和鎮(zhèn)痛等作用[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，AL對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和侵襲有抑制作用[8]。此外，AL可抑制藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型細(xì)胞MDCK-MDR1中ATP結(jié)合盒亞家族B成員1(ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1)編碼的泵藥蛋白P-糖蛋白( P-glycoprotein，P-gp)表達(dá)[9]，具有潛在的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)作用。因此，本研究旨在探討AL對卵巢癌的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其對MYC、WWP1的影響，為AL開發(fā)作為腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物注射用順鉑(20mg，8L012A88)，齊魯制藥有限公司；MYC抑制劑MYCi975(純度98.95%，S8906)，美國Selleck Chemicals公司；芍藥內(nèi)酯苷(純度≥98.0%，HY-N0037)，美國MCE公司。

1.2 主要試劑與儀器SPARKeasy 總RNA快速提取試劑盒(AC0205，山東思科捷生物技術(shù)有限公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(K1662，美國Thermo Fisher)，QuantiNova SYBR Green PCR 試劑盒(208054，美國QIAGEN)，MinuteTM總蛋白提取試劑盒(SN001，美國Invent Biotechnologies公司)，HRP直標(biāo)GAPDH鼠單抗(HRP-60004，PROTEINTECH)，Pierce Rapid Gold BCA蛋白濃度檢測試劑盒(A53225，美國Thermo Fisher)，Kemix速溶快速封閉顆粒(KSF0101)、ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(KE0102-100，密碼子(中國)生物科技公司)，優(yōu)級(jí)胎牛血清(CTCC-002-001)、RPMI1640培養(yǎng)基(CTCC-002-006，浙江美森細(xì)胞科技有限公司)，羅丹明123(R8004，Sigma公司)，CCK-8試劑盒(BS350B，蘭杰柯科技有限公司)，MYC兔單抗(ab32072)、WWP1兔多抗(ab43791)、P-gp兔單抗(EPR10364-57，Abcam公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(5220-0336，美國KPL)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI ViiA7，賽默飛世爾公司)，流式細(xì)胞儀(FACSCelesta，BD公司)，凝膠化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon-5200，上海天能公司)，全功能酶標(biāo)儀(Synergy H1，美國BioTek公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和MYC敲低細(xì)胞株構(gòu)建293T細(xì)胞、人卵巢癌順鉑敏感SKOV3細(xì)胞及其耐順鉑SKOV3/DDP細(xì)胞購自浙江美森細(xì)胞科技有限公司，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)在含10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 kU·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)基中。SKOV3/DDP細(xì)胞在培養(yǎng)過程中加入2 μmol·L-1的順鉑維持耐藥性。細(xì)胞每3 ～4 d胰蛋白酶消化傳代1次。

設(shè)計(jì)合成靶向MYC的ShRNA序列(如Tab 1所示)克隆入pLKO.1載體，挑選陽性克隆測序驗(yàn)證后，感染293T細(xì)胞，用puromycin篩選基因組穩(wěn)定整合靶向MYC-shRNA序列的細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)293T細(xì)胞48 h，收集含有慢病毒顆粒的上清液。采用收集的上清液轉(zhuǎn)染至SKOV3/DDP細(xì)胞，繼續(xù)用puromycin篩選，構(gòu)建MYC穩(wěn)定敲低的shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞株。收取部分細(xì)胞提取總RNA和蛋白，驗(yàn)證MYC敲低效果。

1.4 細(xì)胞毒性檢測取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP和SKOV3細(xì)胞，以及shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞，分別接種96孔板，每孔100 μL，含5 000個(gè)細(xì)胞。對于AL單用的細(xì)胞毒性檢測，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度AL，溶劑加入含細(xì)胞孔作為陰性對照，無細(xì)胞培養(yǎng)基作為背景對照。AL的耐藥逆轉(zhuǎn)作用檢測分組為：各孔加入不同濃度的順鉑，或者AL聯(lián)用順鉑。同時(shí)增加MYC抑制劑MYCi975單用或聯(lián)用順鉑組。各組細(xì)胞48 h后加入10 μL CCK-8，繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測450nm處每孔吸光度值(A)，各孔吸光度值減去背景值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率/%=(A實(shí)驗(yàn)-A背景)/(A對照-A背景)×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算順鉑或者AL聯(lián)用順鉑的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration，IC50)。

1.5 P-gp功能檢測取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細(xì)胞，分為AL 25、50、100 μmol·L-1組，并設(shè)空白對照和陽性對照MYCi975組。另取shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞，比較其與SKOV3/DDP細(xì)胞P-gp功能的差異。細(xì)胞處理48 h后，胰酶消化并加入終濃度為0.5 mg·L-1的羅丹明123(rhodamine 123，Rho123)。在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)孵育60 min，冰PBS洗滌3次后，重懸于0.5 mL冰 PBS中，立即采用流式細(xì)胞儀檢測。FACS Diva軟件分析羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.6 芍藥內(nèi)酯苷對SKOV3/DDP耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細(xì)胞，接種于12孔板，藥物分組和培養(yǎng)條件同1.5。加藥孵育48 h后，按照總RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用熒光定量PCR擴(kuò)增各目的基因，引物序列如Tab 1所示。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算各藥物處理組MYC、WWP1和MDR1 mRNA相對于對照組表達(dá)量的變化，其中ΔΔCt=(Ct目標(biāo)基因- Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目標(biāo)基因- Ct內(nèi)參基因)對照組。

Tab 1 shRNA sequence for MYC and primers for MYC，WWP1，MDR1 and GAPDH

1.7 芍藥內(nèi)酯苷對SKOV3/DDP耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響SKOV3/DDP細(xì)胞處理和分組同“1.5”，孵育48 h后，棄去培養(yǎng)基，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。Kemix快速封閉液封閉，加入MYC、WWP1、P-gp蛋白一抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入對應(yīng)HRP標(biāo)記兔二抗室溫孵育2 h，在凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。HRP直標(biāo)GAPDH鼠單抗直接孵育2 h，化學(xué)發(fā)光檢測GAPDH條帶。ImageJ軟件分析成像蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值計(jì)算各條帶相對比值，以各藥物處理組相對比值除以空白對照組相對比值計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 芍藥內(nèi)酯苷對SKOV3和SKOV3/DDP 細(xì)胞存活率的影響Fig 1結(jié)果顯示，25、50和100 μmol·L-1AL作用于SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞48 h，對兩種細(xì)胞的毒性均較低。25 μmol·L-1AL處理后，兩種細(xì)胞的存活率均在90%以上。因此，該濃度作為后續(xù)耐藥逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)的聯(lián)合用藥濃度。

Fig 1 Effect of albiflorin on survival rate of SKOV3 and

2.2 芍藥內(nèi)酯苷對 SKOV3/DDP 細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用Tab 2結(jié)果顯示，shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50為(5.74±0.26) mg·L-1，與SKOV3/DDP細(xì)胞相比明顯下降，提示敲低MYC可以逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥性。8 μmol·L-1MYCi975聯(lián)用順鉑后，順鉑對SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50均明顯下降，提示其可能兼具抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用。SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)25 μmol·L-1AL聯(lián)用順鉑處理后，對順鉑的IC50從(14.46±0.44) mg·L-1降為(4.92±0.19) mg·L-1，表明其具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

Tab 2 Effects of albiflorin on SKOV3/DDP cell

2.3 芍藥內(nèi)酯苷對P-gp功能的抑制作用Fig 2 A和C結(jié)果顯示，與正常SKOV3/DDP細(xì)胞相比，shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞峰右移，MFI增加，表明敲低MYC可抑制P-gp功能。Fig 2 B和D結(jié)果顯示，SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)AL處理后，隨著AL濃度增加，峰逐漸右移，MFI逐漸增加，提示AL對P-gp功能的抑制具有濃度依賴性(P<0.01)。MYCi975抑制P-gp功能作用強(qiáng)于AL 50 μmol·L-1組，弱于AL 100 μmol·L-1組。

Fig 2 P-gp function changes after SKOV3/DDP cells knocked-down MYC or treated with different A：Histogram Overlay of SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells treated with Rho123;B：Histogram Overlay of SKOV3/DDP cells treated with albiflorin and Rho123;C：Comparison of Rho123 MFI in SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells;D：Comparison of Rho123 MFI in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin.##P<0.01 vs SKOV3/DDP group，**P<0.01 vs control group，ΔΔP<0.01 vs AL 100 μmol·L-1 group.

2.4 芍藥內(nèi)酯苷對ABCB1、MYC和WWP1基因表達(dá)的影響Fig 3結(jié)果顯示，與正常SKOV3/DDP細(xì)胞相比，MYC敲低后，shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞中MYC、WWP1和ABCB1 mRNA均明顯下調(diào)(P<0.01)，提示敲低shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性增加可能與抑制MYC、WWP1和ABCB1 mRNA表達(dá)有關(guān)。SKOV3/DDP細(xì)胞中MYC、WWP1和ABCB1 mRNA表達(dá)隨AL濃度增加而下降(P<0.05，P<0.01)，100 μmol·L-1AL組對ABCB1和WWP1 mRNA的抑制作用與MYCi975相當(dāng)(P>0.05)。

2.5 芍藥內(nèi)酯苷對P-gp、MYC和WWP1蛋白表達(dá)的影響Fig 4 結(jié)果顯示，與正常SKOV3/DDP細(xì)胞相比，MYC敲低后，shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞中MYC、WWP1和P-gp蛋白表達(dá)幾乎完全被抑制，提示敲低MYC后，shMYC-SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性增加可能與抑制MYC、WWP1、和P-gp蛋白表達(dá)有關(guān)。SKOV3/DDP細(xì)胞中，隨著AL濃度增高，對MYC、WWP1和P-gp蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。100 μmol·L-1AL組對ABCB1、WWP1 和MYC蛋白的抑制作用與MYCi975相當(dāng)。

3 討論

鉑類藥物用于卵巢癌化療已有40多年歷史，至今仍是卵巢癌的一線治療藥物之一，顯示了鉑類藥物抗腫瘤的臨床有效性，但MDR的產(chǎn)生限制了其療效。腫瘤對鉑類耐藥的機(jī)制較多，例如泵藥蛋白增加導(dǎo)致瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降、瘤細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力增強(qiáng)等，不同的耐藥機(jī)制又彼此影響，增加了MDR的復(fù)雜性。其中，P-gp是重要的泵藥蛋白之一，其高表達(dá)亦是卵巢癌對鉑類藥物耐藥的重要原因[10]。自從上個(gè)世紀(jì)七十年代發(fā)現(xiàn)P-gp以來，研究人員一直沒有停止以P-gp為靶點(diǎn)開發(fā)逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的藥物，但至今仍無一種P-gp抑制劑批準(zhǔn)用于臨床，這些藥物大多因人體毒性或臨床療效不理想而止步于臨床試驗(yàn)階段[11]。因此，探尋P-gp表達(dá)增高，導(dǎo)致MDR的深層機(jī)制和/或開發(fā)高效、低毒的抑制劑一直是科研人員努力的方向。

從包括中藥在內(nèi)的天然產(chǎn)物中篩選低毒性、多靶點(diǎn)和具有良好耐受性的MDR逆轉(zhuǎn)劑逐漸成為研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。作為一種來源于中藥的天然成分，AL以超過臨床3 000倍的劑量給予比格犬，未引起任何明顯的毒性反應(yīng)，證明其具有極高的安全性[12]。AL治療認(rèn)知功能障礙、鎮(zhèn)痛、抗癌等作用與其調(diào)控p38 MAPK、AKT、NF-kB 等信號(hào)通路有關(guān)，表明其藥理作用具有多通路、多靶點(diǎn)調(diào)控特點(diǎn)[6-8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，方中包括芍藥的桂枝茯苓丸可通過抑制PI3K/AKT通路、異黏蛋白(metadherin，MTDH)和誘導(dǎo)PTEN表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR[13-14]，本課題研究AL逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR的作用機(jī)制，旨在為桂枝茯苓丸逆轉(zhuǎn)MDR進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Fig 3 Effect of albiflorin on ABCB1，MYC and WWP1 mRNA expression The relative mRNA level for ABCB1，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells;B，C and D.The relative mRNA levels of ABCB1，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin.##P<0.01 vs SKOV3/DDP group;*P<0.05，**P<0.01 vs control group，ΔΔP<0.01 vs AL 100 μmol·L-1 group.

Fig 4 Effect of albiflorin on P-gp，MYC and WWP1 protein expression A：Western blot results for P-gp，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells;B：Western blot results for P-gp，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin;C，D and E：The relative protein expressions levels of P-gp，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin.*P<0.05，**P<0.01 vs control group.

MYC是調(diào)控P-gp表達(dá)的一個(gè)上游靶點(diǎn)，可能通過多種途徑調(diào)控P-gp表達(dá)。E3 泛素連接酶在泛素化級(jí)聯(lián)的最后一步發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過特異性結(jié)合底物蛋白來確定哪種蛋白質(zhì)被泛素化。WWP1是一種是HECT(homologous to E6AP C-terminus)類E3泛素連接酶，是一個(gè)重要的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)[15]。MYC高表達(dá)直接上調(diào)其靶基因WWP1表達(dá)，促進(jìn)磷酸酶和張力蛋白類似物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)多聚泛素化，從而抑制PTEN的二聚化、膜募集和腫瘤抑制功能，進(jìn)一步激活PI3K/AKT通路，調(diào)控P-gp，促進(jìn)腫瘤MDR[5]。另有研究表明，核內(nèi)小RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12)亦是MYC的靶基因，MYC抑制SNHG12表達(dá)，進(jìn)而抑制P-gp表達(dá)，增強(qiáng)鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性[16]。

MYCi975是特異性MYC抑制劑，8 μmol·L-1即可明顯抑制MYC的表達(dá)[17]，因此本研究中選擇此濃度作為MYC抑制的陽性對照濃度。Rho123是經(jīng)典P-gp底物，用于P-gp功能評估，在本研究中作為P-gp功能指示劑[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，AL聯(lián)用順鉑可明顯降低SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥性，減弱P-gp的泵藥作用。同時(shí)，采用shRNA敲低MYC表達(dá)后，SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥性下降，P-gp泵藥作用同時(shí)減弱。經(jīng)比較，AL的耐藥逆轉(zhuǎn)和對P-gp功能的抑制作用與MYCi975抑制和MYC敲低效果均類似。為進(jìn)一步探討AL逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制，考察了AL對ABCB1/P-gp、MYC和WWP1基因和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AL可明顯抑制ABCB1/P-gp、MYC和WWP1基因和蛋白表達(dá)。AL對這些基因的抑制作用同樣與MYCi975抑制和MYC敲低效果類似。這些結(jié)果表明，AL對SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用與減弱P-gp功能，抑制ABCB1/P-gp、MYC和WWP1基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。值得注意的是，中晚期腫瘤患者多受癌痛折磨，AL本身具有鎮(zhèn)痛作用[6]，其作為化療輔助用藥在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性，降低化療藥物劑量的同時(shí)，預(yù)期可以減輕患者的痛苦。

本研究為AL作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑用于卵巢癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)對于腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)提供了一種潛在的新策略，對臨床腫瘤的治療具有重要意義。然而，25 μmol·L-1AL聯(lián)用順鉑的逆轉(zhuǎn)耐藥作用雖然與8 μmol·L-1MYCi975聯(lián)用順鉑的作用相近，但前者對ABCB1/P-gp、MYC和WWP1以及P-gp功能的抑制作用明顯弱于后者，提示AL可能還有其他潛在的逆轉(zhuǎn)耐藥調(diào)控機(jī)制，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。