LncRNA UNC5B-AS1通過調(diào)控Toll樣受體信號通路對宮頸癌細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

蔡 璟,何 敏,宋 晶,唐永曜,李照東,李海玉,宋方洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.附屬第一醫(yī)院，重慶 400016)

宮頸癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率位列全球女性腫瘤第四位[1]。目前，Ⅲ期、Ⅳ期宮頸癌患者預(yù)后差，開發(fā)潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物至關(guān)重要[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種組織細(xì)胞特異性高、無編碼功能的RNA片段[2]。LncRNA常在腫瘤中表達(dá)失調(diào)，在不同種類癌癥中，lncRNA失調(diào)與腫瘤預(yù)后、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3]。研究表明，lncRNA可以作為腫瘤抑制基因或促腫瘤基因參與宮頸癌細(xì)胞的生長、分化、遷移、侵襲和凋亡，同時(shí)影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和治療[4]。因此，深入研究lncRNA與宮頸癌之間的關(guān)系，對于促進(jìn)宮頸癌的臨床診斷和有效治療具有重要意義。LncRNA UNC5B-AS1位于基因組區(qū)域10q22.1，包含2個(gè)外顯子。2019年，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA UNC5B-AS1在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)水平相對較高，具有致癌活性[5]。2020年，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)UNC5B-AS1在前列腺癌和卵巢癌中的高表達(dá)水平[6]。本研究通過生物信息學(xué)分析及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，相比正常宮頸組織，lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織中表達(dá)明顯升高，擬探索lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌發(fā)生中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本2018～2019年，我們收集重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院19例宮頸癌組織和23例正常宮頸組織，患者術(shù)前均未接受過放療或化療等。所有參與者已簽署書面知情同意書。本研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：2020008)，遵循赫爾辛基宣言的原則。

1.2 主要試劑人源宮頸癌細(xì)胞株HeLa、CaSki、SiHa(ATCC細(xì)胞庫)；LncRNA UNC5B-AS1干擾載體si-UNC5B-AS1及其陰性對照組si-NC和過表達(dá)載體pcDNA3.1-UNC5B-AS1及其空載對照組質(zhì)粒pcDNA3.1[生工生物工程(上海)有限公司]；PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司)；轉(zhuǎn)染試劑siRNA-Mate(上海吉瑪公司)；TRIzol試劑及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；Eastep Super總RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR Premix Ex Taq II(日本TaKaRa公司)；CCK-8試劑、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒BeyoClick EdU-488(上海碧云天公司)；BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；PVDF膜及ECL試劑盒(美國Merck Millipore公司)；抗體E-Cadherin、TICAM2、IL-6、酶標(biāo)親和純山羊抗兔IgG和酶標(biāo)親和純山羊抗小鼠IgG(美國Proteintch公司)；抗體N-Cadherin、Vimentin及β-actin(美國Bimake公司)。

1.3 主要儀器多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；凝膠成像儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(廣州光儀公司)；倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4 從GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選差異表達(dá)lncRNA自GEO數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE63514(GPL570)(檢測平臺Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arry)。應(yīng)用GEO2R在線工具根據(jù)|LogFC|>2和P<0.05的閾值篩選差異表達(dá)基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載對應(yīng)患者宮頸癌RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，收集患者特征，包括性別、腫瘤分級、TNM分期等，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，使用limma包根據(jù)|LogFC|>1和FDR<0.05的閾值篩選差異表達(dá)基因。將GEO和TCGA篩選的差異lncRNA作交集，尋找存在于兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的差異表達(dá)基因。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞，使用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CaSki細(xì)胞。所有細(xì)胞在CO2濃度為5%，溫度 37 ℃ 的孵育箱中生長。取對數(shù)期生長的HeLa、CaSki及SiHa細(xì)胞株接種至6孔板，培養(yǎng)過夜。使用siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑將si-UNC5B-AS1和陰性對照si-NC轉(zhuǎn)染至HeLa及CaSki細(xì)胞中；使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將過表達(dá)質(zhì)粒pcDN3.1+UNC5B-AS1及空載對照組質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至HeLa及SiHa細(xì)胞。48 h后，通過qRT-PCR檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UNC5B-AS1表達(dá)水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。LncRNA UNC5B-AS1的siRNA序列見Tab 1。

Tab 1 Sequence of si-RNA

1.7 提取RNA，進(jìn)行qRT-PCR使用TRIzol 試劑提取組織總RNA，使用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II進(jìn)行qRT-PCR。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。PCR引物序列見Tab 2。

Tab 2 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化、收集細(xì)胞并將細(xì)胞鋪至6孔板，每孔加入約800個(gè)細(xì)胞，4 mL完全培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察呈單細(xì)胞懸液狀態(tài)。放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。每隔24 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，出現(xiàn)克隆即棄去培養(yǎng)基。使用PBS洗滌細(xì)胞3次，使用4%多聚甲醛固定20 min，0.25%結(jié)晶紫染色20 min后即可觀察到克隆。

1.9 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，消化及收集細(xì)胞，置于96孔板中，每孔加入大約1 000個(gè)細(xì)胞及100 μL培養(yǎng)液。然后加入10 μL CCK-8試劑，并在指定時(shí)間點(diǎn)：0、24、48、72、96 h各孵育1 h。最后，通過MultiskanTMFC酶標(biāo)儀測量宮頸癌細(xì)胞在450 nm波長的吸光度值(OD)，匯總每個(gè)時(shí)間段測量的吸光度值并制作線性圖。

1.10 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，消化并收集細(xì)胞，置于96孔板中，每孔加入大約8 000個(gè)細(xì)胞及200 μL培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2孵育24 h后，配制EdU工作液并加入96孔板中，于室溫孵育細(xì)胞2 h。最后加入EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒BeyoClick EdU-488反應(yīng)液，在倒置熒光顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.11 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化細(xì)胞后使用無血清培養(yǎng)基收集細(xì)胞。遷移細(xì)胞密度為2×105/孔，侵襲細(xì)胞密度為2.5×105/孔。將小室置于培養(yǎng)板中，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含20%血清的完全培養(yǎng)基，確保下室培養(yǎng)液和小室間無氣泡。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，使用PBS洗滌并加入4%多聚甲醛固定20 min，再次使用PBS洗滌細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.12 轉(zhuǎn)錄組RNA測序使用RNA TRIzol試劑分別提取si-NC-HeLa和si-UNC5B-AS1-HeLa的RNA，然后由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并分析。所有樣品均符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1.13 Western blotWestern blot采用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE。使用含有1%苯基甲烷磺酰氟的RIPA裂解緩沖液將細(xì)胞充分裂解，使用刮棒刮取細(xì)胞，于4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min得到細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白樣品在100 ℃煮沸10 min，在SDS-PAGE凝膠上分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用脫脂牛奶常溫封膜2 h，使用TBST將一抗稀釋至適當(dāng)濃度并于4 ℃孵育PVDF膜過夜。24 h后，使用TBST稀釋二抗室溫下與PVDF膜共孵育1 h，將膜蛋白面朝下與ECL試劑盒中A、B混合液充分接觸后放入化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)進(jìn)行發(fā)光顯影。使用的一抗為E-Cadherin(1 ∶1 000)、N-Cadherin(1 ∶1 000)、Vimentin(1 ∶1 000)、TICAM2(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶5 000)、β-actin(1 ∶2 000)。山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)和山羊抗小鼠IgG(1 ∶5 000)作為二抗。

在2022年冬奧會申辦之前，我國奧委會就積極響應(yīng)國家相關(guān)政策，大力推廣冰雪項(xiàng)目，例如，冰雪陽光體育、北冰南展西擴(kuò)以及百萬青少年上冰雪等。在2022年冬奧會申辦成功之后，我國奧委會就加快了北冰南展的進(jìn)程，讓國內(nèi)更多的人們體驗(yàn)到冰雪運(yùn)動帶來的快樂，這些舉措都有利于大眾冰雪運(yùn)動在我國的普及。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，人們的思想觀念也在發(fā)生著變化，他們不僅追求物質(zhì)發(fā)展，更注重精神的感受，所以，向人們普及大眾冰雪運(yùn)動很有必要，同時(shí)要不斷引導(dǎo)人們參與到體育活動中來。

1.14 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 從GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫篩選差異表達(dá)lncRNA UNC5B-AS1GEO數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集GSE63514(GPL570)篩選得到599個(gè)差異基因，包括177個(gè)上調(diào)基因和422個(gè)下調(diào)基因(Fig 1A)。

TCGA數(shù)據(jù)庫中宮頸癌RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)提示宮頸癌患者中位年齡為46歲。Ⅰ期患者167例(52.68%)，Ⅱ期患者72例(22.71%)，Ⅲ期患者49例(15.46%)，約2/3患者(n=272)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特征。將GEO和TCGA篩選的差異lncRNA取交集得到15個(gè)共差異表達(dá)lncRNA(Fig 1B)，其中l(wèi)ncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織中相對正常宮頸組織表達(dá)上調(diào)。

2.2 LncRNA UNC5B-AS1在不同組織和細(xì)胞系的表達(dá)水平LncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織(Fig 2A)。與HeLa及SiHa細(xì)胞相比，lncRNA UNC5B-AS1在CaSki細(xì)胞中的表達(dá)量相對較高(Fig 2B)。同時(shí)，GEPIA網(wǎng)站查詢結(jié)果與組織驗(yàn)證結(jié)果一致(Fig 2C)。Kaplan-Meier曲線和對數(shù)秩檢驗(yàn)分析提示，lncRNA UNC5B-AS1基因水平升高明顯影響宮頸癌患者總生存時(shí)間(overall survival，OS)，P<0.05(Fig 2D)。

2.3 檢測敲低及過表達(dá)lncRNA UNC5B-AS1在不同宮頸癌細(xì)胞系的效果在HeLa和CaSki細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染si-UNC5B-AS1后，si-UNC5B-AS1組中l(wèi)ncRNA UNC5B-AS1表達(dá)量明顯降低(Fig 3A)，表明si-UNC5B-AS1轉(zhuǎn)染成功。在lncRNA UNC5B-AS1的過表達(dá)模型中，lncRNA UNC5B-AS1表達(dá)量在SiHa和HeLa中明顯升高(Fig 3B)，表明pcDNA3.1+UNC5B-AS1轉(zhuǎn)染成功。

2.4 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細(xì)胞活力的影響CCK-8檢測結(jié)果提示，lncRNA UNC5B-AS1敲低顯著抑制HeLa細(xì)胞(Fig 4A)和CaSki細(xì)胞(Fig 4B)的活力，同時(shí)lncRNA UNC5B-AS1過表達(dá)明顯增強(qiáng)SiHa細(xì)胞(Fig 4C)和HeLa細(xì)胞(Fig 4D)細(xì)胞活力。

Fig 1 Differentially expressed genes screened from databaseA：Volcano plot indicated the number of different expression genes recognized from GSE63514；B：The intersection of lncRNAs in GSE63514 and TCGA databases.

Fig 2 Relatively higher expression of lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer tissues and cellsA:The expression level of lncRNA UNC5B-AS1 was relatively higher in cervical cancer tissues;B:LncRNA UNC5B-AS1 was expressed in three cervical cancer cells lines;C:GEPIA was used to demonstrated the higher expression level of lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer tissues rather than in normal tissues;D:GEPIA demonstrated lncRNA UNC5B-AS1 affected the overall survival(OS)of cervical cancer patients.*P<0.05 vs normal.

Fig 3 The transfection effect of lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer cellsA：The expression of lncRNA UNC5B-AS1 was obviously down-regulated in HeLa and CaSki cells transfected with si-UNC5B-AS1；B：The expression of lncRNA UNC5B-AS1 was obviously up-regulated in SiHa and HeLa cells transfected with pcDNA3.1+UNC5B-AS1.**P<0.01 vs Control group.

Fig 4 The cell growth ability detected by CCK-8 assayA：Silencing lncRNA UNC5B-AS1 caused the inhibition of HeLa growth；B：Silencing lncRNA UNC5B-AS1 caused the inhibition of CaSki growth；C：Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 caused the increase of SiHa growth；D：Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 caused the increase of HeLa growth.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.

2.5 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細(xì)胞克隆形成能力的影響通過克隆形成實(shí)驗(yàn)及EdU實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，lncRNA UNC5B-AS1敲低后，HeLa、CaSki細(xì)胞集落數(shù)量明顯少于陰性對照組細(xì)胞數(shù)量(Fig 5A)，而lncRNA UNC5B-AS1過表達(dá)的SiHa和HeLa細(xì)胞集落數(shù)量明顯大于陰性對照組(Fig 5B)。EdU實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低lncRNA UNC5B-AS1后細(xì)胞增殖明顯少于陰性對照組(Fig 5C)，而過表達(dá)lncRNA UNC5B-AS1細(xì)胞增殖明顯高于陰性對照組(Fig 5D)。綜上所述，lncRNA UNC5B-AS1能調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖能力。

2.6 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌遷移、侵襲能力的影響遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)表明，與HeLa細(xì)胞和CaSki細(xì)胞陰性對照組相比，下調(diào)lncRNA UNC5B-AS1可顯著抑制HeLa細(xì)胞(Fig 6A)及CaSki細(xì)胞(Fig 6B)遷移、侵襲能力。同時(shí)，過表達(dá)lncRNA UNC5B-AS1能明顯促進(jìn)SiHa細(xì)胞(Fig 6C)和HeLa細(xì)胞(Fig 6D)的遷移、侵襲能力。

2.7 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力相關(guān)。Western blot分析提示，在HeLa和CaSki細(xì)胞中敲除lncRNA UNC5B-AS1后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin的表達(dá)明顯升高，同時(shí)導(dǎo)致兩種間質(zhì)標(biāo)記物N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)下降(Fig 7A)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如Fig 7C所示。過表達(dá)lncRNA UNC5B-AS1使SiHa和HeLa細(xì)胞中E-Cadherin的表達(dá)明顯下降，而N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)升高(Fig 7B)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如Fig 7D所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，lncRNA UNC5B-AS1能調(diào)控宮頸癌細(xì)胞EMT能力。

2.8 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果RNA測序共獲得31個(gè)差異表達(dá)基因，包括17個(gè)上調(diào)基因和14個(gè)下調(diào)基因(Fig 8A)。KEGG分析提示，差異基因主要富集于Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路、Jak-STAT信號通路、TNF信號通路等(Fig 8B)。其中IL-6、TICAM2明顯富集到TLR信號通路(Fig 8C)。

2.9 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細(xì)胞TLR信號通路的影響LncRNA UNC5B-AS1敲低組中IL-6表達(dá)上調(diào)而TICAM2表達(dá)下調(diào)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示IL-6、TICAM2的mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。在HeLa及CaSki細(xì)胞中，敲低lncRNA UNC5B-AS1組IL-6的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，而TICAM2的mRNA表達(dá)水平下調(diào)(Fig 9A)。同時(shí)，lncRNA UNC5B-AS1過表達(dá)組中IL-6的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，TICAM2表達(dá)水平升高(Fig 9B)。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在 HeLa和CaSki細(xì)胞中，lncRNA UNC5B-AS1敲低導(dǎo)致IL-6蛋白表達(dá)水平上調(diào)，TICAM2蛋白表達(dá)水平下調(diào)(Fig 9C)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如Fig 9E所示。在HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中，lncRNA UNC5B-AS1過表達(dá)導(dǎo)致IL-6蛋白表達(dá)水平下調(diào)，TICAM2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(Fig 9D)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如Fig 9F所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果。研究結(jié)果表明，lncRNA UNC5B-AS1能增強(qiáng)TLR信號通路活性。

Fig 5 Cell colony assay and Edu were used to detect the cell proliferation abilityA:Silenced of lncRNA UNC5B-AS1 inhibited ability of colony formation in HeLa and CaSki cells;B：Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 increased the ability of colony formation in HeLa and SiHa cells;C:Silencing of lncRNA UNC5B-AS1 caused the inhibition of proliferation ability in HeLa and CaSki cells;D:Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 caused the increase of the proliferation ability in HeLa and SiHa cells.1:si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pcDNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS1.*P<0.05,**P<0.01 vs Control group.

Fig 6 Ability of cell migration and invasion detected by Transwell assayA:Knock-down lncRNA UNC5B-AS1 led to the inhibition of migration and invasion in HeLa;B:Silencing of lncRNA UNC5B-AS1 led to the inhibition of migration and invasion in CaSki cells;C:Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 promoted SiHa to migrate and invade;D:Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 promoted HeLa to migrate and invade.1:si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pcDNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS1.*P<0.05,**P<0.01 vs Control group.

Fig 7 EMT-related proteins for lncRNA UNC5B-AS1 detected by Western blotA：The expression level of EMT-related proteins for knockdown lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer cells；B：The expression level of EMT-related proteins for overexpressing lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer cells；C-D：The normalized protein level.1：si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pc-DNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS1.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.

Fig 8 Results of RNA transcriptome sequenceA：Heatmap of differently expressed genes between silenced lncRNA UNC5B-AS1 group of HeLa cell and negative control group of HeLa cells revealed 31 differential genes；B：31 differential expression genes enriched KEGG pathway；C：Heatmap of differentially expressed genes enriched in Toll-like receptor signaling pathway.

3 討論

宮頸癌是全球女性發(fā)病率和死亡率排名居前的惡性腫瘤，對女性健康帶來極大威脅。尋找早期診斷標(biāo)志物是診斷宮頸癌的關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA已被證實(shí)能調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并可能是潛在治療靶點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中，我們通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫篩選得到差異基因lncRNA UNC5B-AS1，并確定lncRNA UNC5B-AS1參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)沉默lncRNA UNC5B-AS1明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，過表達(dá)lncRNA UNC5B-AS1則能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

EMT是上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力的生物學(xué)過程，在人類疾病的發(fā)展中至關(guān)重要。研究表明，EMT與腫瘤密切相關(guān)，在腫瘤惡性演進(jìn)的過程中，EMT使腫瘤細(xì)胞得以浸潤和轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位，EMT現(xiàn)象見于腫瘤各病理分期[7]。同時(shí)，膠質(zhì)瘤[8]、食管鱗狀細(xì)胞癌[9]和乳腺癌[10]等的轉(zhuǎn)移均與EMT相關(guān)。本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA UNC5B-AS1能調(diào)控EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin的表達(dá)水平，敲低lncRNA UNC5B-AS1能使E-Cadherin上調(diào)，N-Cadherin及Vimentin下調(diào)，而過表達(dá)能使E-Cadherin表達(dá)水平下調(diào)，N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)果證實(shí)lncRNA UNC5B-AS1能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞相關(guān)的EMT遷移和侵襲能力。

Fig 9 Toll-like receptor pathway-related gene expression level measured by qRT-PCR and Western blotA-B：The expression level of Toll-like receptor pathway-related altered genes was detected by qRT-PCR when(A)：LncRNA UNC5B-AS1 was knockdown and(B)：Overexpressed in cervical cancer cells；C-D：Western blot was applied for the measurement of Toll-like receptor pathway-related proteins expression level when(C)：LncRNA UNC5B-AS1 was silenced and(D)：Overexpressed in cervical cancer cells；E-F：The normalized protein level.1：si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pc-DNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.

TLR在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列，在細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)Toll/IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域，均對配體識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要[11]，在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是抵御微生物病原體入侵、組織損傷或癌癥的第一道防線[12]。TLR在抗腫瘤方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]，能夠直接刺激或通過抗原遞呈細(xì)胞間接刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，并增強(qiáng)其對抗腫瘤中異常表達(dá)抗原的能力[14]。幾項(xiàng)研究表明，TLR在人和小鼠腫瘤中表達(dá)升高，同時(shí)，TLR的激活可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并惡化疾病預(yù)后，特別是TLR2激活已被證明在惡性腫瘤中具有直接的腫瘤刺激作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移能力[15]。同時(shí)TLR2還可以通過激活NF-κB來增強(qiáng)對化療藥物的抵抗力[16]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得31個(gè)差異表達(dá)基因，KEGG結(jié)果提示差異表達(dá)基因主要富集到TLR信號通路、JAK-STAT信號通路、TNF信號通路等。其中富集到TLR信號通路的差異表達(dá)基因是IL-6及TICAM2。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明敲低lncRNA UNC5B-AS1使IL-6表達(dá)水平上調(diào)，TICAM2表達(dá)水平下調(diào)，qRT-PCR及Western blot結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。表明lncRNA UNC5B-AS1能增強(qiáng)TLR信號通路活性，進(jìn)一步促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖及EMT能力，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌中高表達(dá)，并能通過增強(qiáng)TLR信號通路活性調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖及EMT能力。LncRNA UNC5B-AS1有望成為一種新的宮頸癌治療靶點(diǎn)。