瞬時(shí)受體電位錨蛋白亞型1受體在遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷中的作用

宋美先，吳 云，張 野

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，安徽醫(yī)科大學(xué)麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601)

缺血性心臟病已成為全球致死的首要原因，血流再灌注治療是拯救瀕臨梗死心肌的最有效方法，而減少血流恢復(fù)后存活心肌的繼發(fā)性損傷仍然是至今難以攻克的難題[1]。研究表明，腹部淺表手術(shù)切口的傷害性刺激對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，這種心肌保護(hù)策略被稱(chēng)為遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理(RPCT)[2]。RPCT具體的分子機(jī)制尚未明確，可能與皮膚痛覺(jué)信號(hào)的傳遞相關(guān)，因此，有必要研究疼痛信號(hào)相關(guān)的受體TRPA1與RPCT之間的關(guān)聯(lián)。

瞬時(shí)受體電位錨蛋白亞型1(transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)是機(jī)體感受傷害性刺激的主要感受器，針對(duì)外科手術(shù)切皮等傷害性刺激，TRPA1受體抑制劑可以從源頭處阻斷痛覺(jué)信號(hào)的傳遞，有望成為新型鎮(zhèn)痛藥物[3]。然而，除了調(diào)控痛覺(jué)信號(hào)，TRPA1受體同樣在心肌細(xì)胞中表達(dá)[4]。因此，明確TRPA1受體能否介導(dǎo)RPCT的心肌保護(hù)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制，將有利于提高臨床鎮(zhèn)痛過(guò)程中的心血管安全性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，ALDH2是心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵下游酶，ALDH2過(guò)表達(dá)可通過(guò)減少4-HNE的含量改善心肌缺血/再灌注損傷[5]。但RPCT的心肌保護(hù)作用是否與ALDH2的活性和表達(dá)相關(guān)，目前尚不清楚。本研究旨在探討TRPA1能否介導(dǎo)遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理的心肌保護(hù)作用以及其對(duì)心臟組織ALDH2的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物健康♂ SD大鼠購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(250～300) g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為：SYXK(皖)2017-006。大鼠被飼養(yǎng)在清潔級(jí)動(dòng)物房中，飲食水充足，環(huán)境溫度設(shè)置為(22 ± 1) ℃，濕度設(shè)置為(40 ± 15)%，晝夜周期為12/12 h。

1.2 主要試劑和儀器TRPA1抑制劑(TCS，貨號(hào)5861528)購(gòu)自美國(guó)MCE公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)和伊文思藍(lán)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TUNEL染色試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；ALDH2活性試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；組織裂解液、蛋白酶抑制劑和蛋白定量試劑盒等均購(gòu)自碧云天科技研究所；兔抗ALDH2(DF6358)購(gòu)自中國(guó)Affinity Biosciences公司；兔抗4-HNE(ab46545)、兔抗GAPDH(ab9485)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。大鼠呼吸機(jī)購(gòu)自成都泰盟公司；血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)購(gòu)于澳大利亞AD公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司。

2 方法

2.1 心肌缺血/再灌注模型和遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理模型大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，待其充分麻醉后放在保溫墊上。分離頸部肌肉，切開(kāi)氣管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)。根據(jù)大鼠胸廓起伏程度設(shè)置呼吸頻率約為65～70次/min，潮氣量約為20～30 mL·kg-1。右頸總動(dòng)脈和右頸內(nèi)靜脈置管，用于監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)及給藥。在左側(cè)胸部平腋下肋間用撐開(kāi)器撐開(kāi)胸腔，撕開(kāi)心包膜后顯露出心臟。用6-0帶針線(xiàn)在左心耳下緣進(jìn)針，從肺動(dòng)脈圓錐旁出針。隨后將結(jié)扎線(xiàn)的兩端依次穿過(guò)圓形橡膠墊和自制的阻斷器，心肌缺血時(shí)將血管鉗向下推移，使阻斷器和圓形橡膠墊壓向心肌表面并夾緊，即可壓迫冠狀動(dòng)脈致血流中斷，松開(kāi)血管鉗即可解除壓迫恢復(fù)血流。若MI/R模型建立成功，壓迫冠狀動(dòng)脈后則可觀察到心尖組織變?yōu)樯n白或暗紫色，同時(shí)，心電圖ST段明顯抬高，解除壓迫后再灌注的心尖組織變?yōu)榧t潤(rùn)。大鼠遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理模型參照文獻(xiàn)[6]，即在大鼠腹部中線(xiàn)水平，用手術(shù)刀劃開(kāi)皮膚，做一長(zhǎng)度為4 cm的橫行切口。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(IR組)、遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理組(RPCT組)、TRPA1抑制劑+遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理組(TCS+RPCT組)和TRPA1抑制劑組(TCS組)。Sham組：僅穿線(xiàn)，不進(jìn)行缺血/再灌注；IR組：阻斷冠狀動(dòng)脈缺血30 min后再灌注120 min；RPCT組：缺血前15 min于腹部正中切開(kāi)腹壁4 cm，隨后建立缺血/再灌注模型；TCS+RPCT組：遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理前 10 min靜脈注射TCS 1 mg·kg-1，其余處理同RPCT組；TCS組：缺血前25 min靜脈注射TCS 1 mg·kg-1，隨后進(jìn)行缺血/再灌注損傷。

2.3 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)頸總動(dòng)脈插管成功后連接PowerLab系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)，于結(jié)扎線(xiàn)縫好后平衡30 min(基礎(chǔ)值)、缺血15 min和再灌注完成3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)及心率(HR)，并計(jì)算血壓心率乘積(RPP)。

2.4 心肌梗死面積的測(cè)量再灌注完成后，阻斷冠狀動(dòng)脈血流，將3%伊文思藍(lán)約2 mL從頸內(nèi)靜脈快速推入，當(dāng)大鼠四肢皮膚染為藍(lán)色時(shí)，立即摘除心臟，剪去心房和右心室。將左心室結(jié)扎線(xiàn)以下的心肌組織切成5等分的心肌切片，隨后把切片置于1%TTC溶液里，37 ℃孵育20 min后以組織固定液固定。24 h后可觀察到缺血危險(xiǎn)區(qū)中的活組織被染成紅色，梗死組織被染為白色，非缺血區(qū)被染成藍(lán)色。用刀片依次切下紅色、白色和藍(lán)色區(qū)域并稱(chēng)質(zhì)量，得到梗死區(qū)質(zhì)量(IS，白色區(qū))、缺血區(qū)質(zhì)量(AAR，白色區(qū)+紅色區(qū))以及結(jié)扎線(xiàn)下左心室質(zhì)量(LV，白色區(qū)+紅色區(qū)+藍(lán)色區(qū))，并求出IS/AAR及AAR/LV比值。

2.5 TUNEL染色再灌注結(jié)束后取下大鼠心臟，PBS沖洗后進(jìn)行固定、蔗糖梯度脫水、OCT包埋，隨后進(jìn)行冷凍切片。切片在室溫復(fù)溫后，用PBS洗去包埋劑，加入透膜液通透2 min。再次用PBS洗去透膜液，滴加TUNEL反應(yīng)液，置于37 ℃暗濕盒中孵育1 h。切片以PBS清洗后加入DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

2.6 ALDH2活性檢測(cè)再灌注完成后留取心臟組織，采用ALDH2活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定ALDH2活性。按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，加入的蛋白質(zhì)樣品濃度為0.1 g·L-1。最后避光孵育30 min，測(cè)量450 nm處的吸光度值。結(jié)果將Sham組ALDH2活性標(biāo)準(zhǔn)化為1，計(jì)算其余組ALDH2的相對(duì)活性。

2.7 Western blot取左心室心尖組織，加入RIPA裂解液，放在研磨器中研磨，離心后得到組織總蛋白。獲取的蛋白經(jīng)蛋白濃度測(cè)定后按相應(yīng)比例加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴10 min后取30 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳。隨后進(jìn)行切膠、轉(zhuǎn)膜，把膜放入快速封閉液中封閉15 min。按蛋白分子量裁出相應(yīng)蛋白條帶，然后分別放入GAPDH(1 ∶2 000)、ALDH2(1 ∶1 000)和4-HNE(1 ∶2 000)的抗體稀釋液中，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜后加入二抗(1 ∶10 000)稀釋液，室溫孵育1 h。再次洗膜后滴加顯影劑反應(yīng)1 min，最后在成像系統(tǒng)上顯出蛋白條帶。

Tab 1 Hemodynamic data in rats

3 結(jié)果

3.1 血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)比較5組大鼠MAP、HR和RPP的基線(xiàn)值間無(wú)明顯差異(P>0.05)。相比于Sham組，其余4組的MAP、HR和RPP在缺血15 min和再灌注完成時(shí)刻均下降(P<0.05)；與IR組相比，RPCT組在缺血15 min和再灌注完成時(shí)刻的MAP、HR和RPP均升高(P<0.05)；而IR組、TCS+RPCT組和TCS組間的血流動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)Tab 1。

3.2 心肌梗死面積的比較5組大鼠的AAR/LV比值間無(wú)明顯差異(P<0.05)，說(shuō)明結(jié)扎位置基本一致。與Sham組相比，其余各組出現(xiàn)白色梗死區(qū)；與IR組相比，RPCT組的IS/AAR百分比明顯減小(P<0.05)；與RPCT組相比，TCS+RPCT組的IS/AAR百分比明顯增加(P<0.05)。結(jié)果表明，RPCT能有效地降低大鼠MI/R損傷后的心肌梗死面積，而TRPA1抑制劑消除了RPCT 的保護(hù)作用。見(jiàn)Fig 1。

3.3 心肌細(xì)胞凋亡水平的比較相比于Sham組，其余4組心肌細(xì)胞凋亡水平明顯增加(P<0.05)；RPCT組相比于IR組，心肌凋亡細(xì)胞減少(P<0.05)；與RPCT組相比，TCS+RPCT組的心肌凋亡細(xì)胞增加(P<0.05)，說(shuō)明預(yù)先給予TRPA1抑制劑使遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理減少心肌細(xì)胞凋亡的作用降低。見(jiàn)Fig 2,3。

Fig 1 Myocardial infarct size in rats A:Representative images for ischemic risk area for each experimental group.Infarcted tissue remains unstained (white) while viable tissue is stained red.B:Area at risk/left ventricle.C:The myocardial infarction area / ischemic risk area.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs IR;△P<0.05 vs RPCT.

Fig 2 Representative images of TUNEL staining in each group

Fig 3 The statistical results of TUNEL staining *P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs IR;△P<0.05 vs RPCT.

3.4 ALDH2活性和蛋白表達(dá)以及4-HNE蛋白表達(dá)情況與Sham組比較，IR組的ALDH2活性和蛋白表達(dá)降低，4-HNE含量增加(P<0.05)；與IR組比較，RPCT組的ALDH2活性和表達(dá)升高，4-HNE含量減少(P<0.05)；相比于RPCT組，TCS+RPCT組的ALDH2活性和表達(dá)降低，4-HNE含量增加(P<0.05)，表明抑制TRPA1受體減弱了遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理升高心肌組織ALDH2活性和蛋白表達(dá)的作用。見(jiàn)Fig 4,5。

Fig 4 ALDH2 activity in each group n=6)*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs IR;△P<0.05 vs RPCT.

Fig 5 The protein expression of 4-HNE and ALDH2 *P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs IR;△P<0.05 vs RPCT

4 討論

遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理是一種有效的心臟保護(hù)方法，由Ren等[7]于2004年首次報(bào)道，并在小鼠和大鼠心肌缺血/再灌注模型中得到證實(shí)[8-9]。本研究參照文獻(xiàn)[6]構(gòu)建大鼠遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理模型和心肌缺血/再灌注模型。結(jié)果觀察到心肌缺血時(shí)心尖組織明顯發(fā)紺，心電圖ST段明顯抬高。而且，RPCT組較IR組的IS/AAR百分比、心肌細(xì)胞凋亡水平明顯減少，證明遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理降低了心肌缺血/再灌注損傷。

TRPA1受體屬于瞬時(shí)受體電位通道超家族，是細(xì)胞膜上的一種鈣通透性非選擇性陽(yáng)離子通道，作為機(jī)體感受溫度、化學(xué)以及機(jī)械等傷害性刺激的主要感受器[10]。研究證實(shí)，心肌細(xì)胞中存在TRPA1，且TRPA1的激活介導(dǎo)了阿片類(lèi)藥物的心肌保護(hù)作用[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺血前于大鼠腹部涂抹冬青油(水楊酸甲酯，TRPA1激動(dòng)劑)軟膏能夠減少心肌缺血/再灌注損傷[11]。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示TRPA1在介導(dǎo)心肌保護(hù)作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TCS 5861528是一種選擇性TRPA1通道拮抗劑，可抑制AITC(TRPA1激活劑)誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流[12]，被廣泛用于研究TRPA1功能實(shí)驗(yàn)中。在本實(shí)驗(yàn)中，為了研究TRPA1是否參與遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理對(duì)大鼠MI/R的保護(hù)作用，進(jìn)行了TCS+ RPCT組實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與RPCT組比較，TCS+RPCT組可明顯增加IS/AAR比值和心肌細(xì)胞凋亡水平，說(shuō)明TRPA1受體拮抗劑TCS可消除遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)，提示TRPA1受體在遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理降低大鼠MI/R損傷的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

缺血心肌血流恢復(fù)后，生成活性氧簇(ROS)，并通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成大量毒性醛如4-HNE，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[13]。ALDH2是醛脫氫酶家族成員，可以將脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的毒性醛分解為無(wú)毒的羧酸，降低細(xì)胞毒性和氧化損傷[14]。大量數(shù)據(jù)表明，ALDH2的活性和表達(dá)增加可以增強(qiáng)其代謝4-HNE的能力，導(dǎo)致4-HNE的含量減少，從而減輕心肌缺血/再灌注損傷[5,15]。Chaudhuri等[16]發(fā)現(xiàn)TRPA1可通過(guò)鈣調(diào)激酶信號(hào)通路激活核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)，Nrf2已被證實(shí)可調(diào)控ALDH2的表達(dá)[17]。因此，我們推測(cè)藥物抑制TRPA1受體可能會(huì)影響ALDH2的活性和表達(dá)。本研究觀察到心肌經(jīng)歷缺血/再灌注損傷后ALDH2活性和表達(dá)下降，毒性物質(zhì)4-HNE表達(dá)升高，而遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理可上調(diào)ALDH2的活性和表達(dá)，減少4-HNE含量。但當(dāng)給予TRPA1受體特異性拮抗劑后，遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理上調(diào)ALDH2活性和表達(dá)的作用消失。該結(jié)果提示TRPA1受體可能是通過(guò)調(diào)控ALDH2活性和表達(dá)，影響4-HNE含量，從而介導(dǎo)了遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理對(duì)大鼠MI/R損傷的保護(hù)作用。

目前，關(guān)于TRPA1的研究主要集中在神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)、慢性疼痛治療方面，TRPA1抑制劑未來(lái)有望成為新的臨床鎮(zhèn)痛藥物[3,18]。研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端的疼痛刺激能夠?qū)θ毖募‘a(chǎn)生保護(hù)作用，這說(shuō)明疼痛信號(hào)通路與心臟保護(hù)之間存在關(guān)聯(lián)[2]。因此，在開(kāi)發(fā)直接阻斷TRPA1通道的臨床用非麻醉性止痛藥之前，需考慮TRPA1在介導(dǎo)特異性心臟保護(hù)和一般器官保護(hù)方面的貢獻(xiàn)。本研究提示TRPA1受體在心肌保護(hù)中具有重要作用，這表明如果在圍術(shù)期通過(guò)阻斷TRPA1進(jìn)行鎮(zhèn)痛治療，將可能對(duì)缺血性心臟病患者或是行心臟手術(shù)患者帶來(lái)安全隱患。

綜上所述，遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理可減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，而藥物拮抗TRPA1受體阻斷了遠(yuǎn)端創(chuàng)傷預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控ALDH2活性和表達(dá)，影響4-HNE含量有關(guān)。