ZLY18通過抑制TGF-β1/Smads通路改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化

馬定虎，周宗濤，李 政，張淯涬，路 靜，劉培慶,

(1.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510008，3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510275)

心肌纖維化是指在心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維大量積聚、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)明顯升高或其成分發(fā)生改變,該病理過程減弱了心肌舒張及收縮功能,是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生的重要原因之一[1-2]。研究已證實心肌纖維化與心房顫動、室性心動過速、心室顫動的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]?？估w維化治療有望成為治療心律失常的新型手段。

心肌纖維化主要是由心肌成纖維細胞的激活所介導(dǎo)的，這是一個由成纖維細胞通過增殖和收縮等方式轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的過程，在此過程中基因表達增加，如ACTA2(編碼α-平滑肌肌動蛋白，α- SMA)。此外，肌成纖維細胞還通過產(chǎn)生和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloprotein-ase，TIMPs)來驅(qū)動組織間ECM重構(gòu)，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)表達水平升高等[4-5]。TGF-β蛋白家族在成纖維細胞激活和ECM產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[5-6]。Smads是TGF-β蛋白家族中表征最好的細胞內(nèi)效應(yīng)子，TGF-β1能夠明顯激活Smads依賴性信號級聯(lián)反應(yīng)，在纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[7]。迄今為止，尚無臨床治療方法能有效阻斷心肌纖維化且無副作用，其具體病理機制仍需要待進一步闡明。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ZLY18是一種新型的四聯(lián)FFA1/PPAR-α/γ/δ激動劑，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成、氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化相關(guān)基因表達方面具有明顯的作用，如ZLY18能夠明顯抑制TGF-β1、TIMP-1和1型膠原蛋白α (type 1 collagen，COL1A1)等纖維化相關(guān)基因的表達。此外，ZLY18對非酒精性脂肪性肝炎(NASH)引起的脂肪肝和纖維化具有明顯的改善作用，并且對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化的預(yù)防作用強于吡非尼酮[8]?；诖?，本研究旨在探究ZLY18對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化的作用及其調(diào)控機制，為心肌纖維化導(dǎo)致的心臟疾病提供新治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與實驗動物 本實驗所采用的心肌成纖維細胞均為從成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠分離所得。SD大鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心，雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，用于構(gòu)建Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化動物模型，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。動物質(zhì)量合格證(No.44007200085381)。所有的實驗操作均在中山大學(xué)動物中心屏障環(huán)境內(nèi)實施完成。所有動物實驗流程均嚴格按照《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》執(zhí)行。

1.1.2試劑 BCA蛋白定量試劑盒(Pierce，23227);胎牛血清(Gibco，10270106);α-Tubulin 抗體(Sigma，F(xiàn)2168-.2ML);4%多聚甲醛 (武漢博士德，AR1069)；RIPA裂解液 (武漢博士德，AR0105-10);PMSF (Sigma，10837091001)；一抗稀釋液 (廣州勵德生物，PN1810)；分子量Marker #26616(Thermo，26616)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Tanon，180-5001)；Fibronectin抗體(Abcam，ab45688)；Collagen I抗體(武漢博士德，BA0325)；α-SMA抗體(武漢博士德，BM0002)；Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG (Proteintech，SA00006-2);Alexa Fluor 594-conjugated anti-rabbit IgG (Proteintech，SA00006-4);Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Proteintech，SA00006-1)；Alexa Fluor 594-conjugated anti-mouse IgG (Proteintech，SA00006-3);Smad2/3抗體 (Abcam，ab202445);phospho-Smad3抗體(Abcam，ab118825)；TGF-β1抗體(Abcam,ab215715)。

1.2 方法

1.2.1原代心肌成纖維細胞的分離 在無菌條件下開胸取SD大鼠心臟，浸于預(yù)冷PBS溶液中，重復(fù)沖洗干凈血污后置于干凈玻璃皿中，修剪多余組織后將心臟對稱剪碎至1～3 mm3小塊，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中用PBS再次洗滌，棄PBS加入0.1%Ⅱ型膠原酶(0.22 μm微孔濾膜濾過除菌)在37 ℃恒溫水浴消化30 min，然后用0.25%胰蛋白酶消化3次每次5 min，接著重復(fù)用Ⅱ型膠原酶消化2～3次至消化完全。吸取上清至預(yù)冷的15 mL離心管中(提前加入含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，終止消化。細胞懸液1 000轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清后重懸細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中孵育60 min，差速貼壁法棄去未貼壁細胞，重新加入含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基。取傳代2～4代的心肌成纖維細胞，按實驗需求進行不同處理。

1.2.2免疫印跡檢測(Western blot) 細胞總蛋白提取：心肌成纖維細胞經(jīng)傳代、加藥處理后，棄培養(yǎng)基用PBS洗滌干凈加適量RIPA裂解液，在冰上將細胞全部刮下，轉(zhuǎn)移至提前預(yù)冷1.5 mL離心管中冰上孵育 30 min，隔5 min渦旋一次，使細胞充分裂解。得到的細胞裂解液離心15 min (4 ℃、12 000×g)，取蛋白上清定量、分裝、變性制成樣品；組織總蛋白提?。喝∫欢ㄙ|(zhì)量的心臟組織剪碎、用PBS洗滌干凈后離心棄上清，加入適量RIPA裂解液重懸，冰上充分超聲均勻，然后離心15 min (4 ℃、12 000×g)，取蛋白上清定量、分裝、變性制成樣品，然后用適宜濃度的SDS-PAGE 凝膠電泳分離，經(jīng)電泳，電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶封閉60 min，一抗孵育過夜(4 ℃過夜)，二抗室溫孵育60 min，然后顯影。

1.2.3實驗小鼠隨機分為對照組和模型組，每組各6只。模型組小鼠皮下注射Ang Ⅱ(2.5 mg·kg-1·d-1)，持續(xù)4周，對照組給予相同體積生理鹽水。

1.2.4超聲心動檢測 用異氟烷經(jīng)小動物麻醉機將C57BL/6小鼠麻醉，剔除胸部毛發(fā)并用蒸餾水洗干凈避免損傷探頭，將其四肢固定在于含傳感器的恒溫板上，用Vevo 2000超聲心動儀檢測C57BL/6小鼠的各項心功能指標。

1.2.5免疫熒光(immunofluorescence，IF) 心肌成纖維細胞種于激光共聚焦小皿中，細胞結(jié)束處理后，棄去培養(yǎng)基，用1 mL PBS洗2次；加200 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，加入1 mL PBS，置于搖床上洗2次(每次5 min)；加入200 μL 1% Triton(PBS配制)溶液，室溫透膜處理10 min，加入1 mL PBS，置于搖床上洗2次(每次5 min)；用150 μL山羊血清室溫封閉30 min，棄去山羊血清(免洗)加入 1 ∶100稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；加入1 mL PBS洗去未結(jié)合的抗體，5 min×3 次；加150 μL Alexa Flour 594 兔熒光二抗，避光孵育 1 h(1 ∶200，山羊血清稀釋)，傾去二抗，加入PBS，避光，置脫色搖床上洗脫，5 min×3次；加入100 μL DAPI(1 ∶5 000，PBS 稀釋)染核10 min，加入1 mL PBS，置搖床上洗脫，5 min×3次。在超高分辨率激光掃描顯微鏡下進行拍攝。

2 結(jié)果

2.1 建立AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞纖維化模型使用AngⅡ(10-7mol·L-1)誘導(dǎo)心肌成纖維細胞纖維化模型，每隔12 h補加一次,孵育36 h。如Fig 1A所示，AngⅡ處理后模型組纖維化相關(guān)指標Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA呈現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢，提示成功構(gòu)建AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞纖維化模型。

2.2 建立Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的心肌纖維化動物模型在C57BL/6小鼠皮下注射AngⅡ(2.5 mg·kg-1)誘導(dǎo)心肌纖維化動物模型，每天給藥連續(xù)4周，對照組給予相同體積的生理鹽水。實驗結(jié)果表明：與對照組相比，AngⅡ處理后，小鼠心臟體積明顯增大(Fig 1B)，心臟系數(shù)即心質(zhì)量體質(zhì)量比(HW/BW)、心質(zhì)量脛骨長比(HW/TL)明顯上調(diào)(Fig 1C-D)。為進一步觀察小鼠心臟的改變，心臟組織切片HE染色(Fig 1E,F)結(jié)果顯示，AngⅡ處理引起小鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞體積增大，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，提示心臟發(fā)生病變。采用PSR染色(Fig 1G)觀察心肌細胞纖維化情況，結(jié)果顯示，AngⅡ組小鼠心臟細胞發(fā)生了明顯的膠原纖維化。進一步檢測組織蛋白分子生物學(xué)指標，Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ處理后，小鼠心臟組織中Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA明顯上調(diào)(Fig 1H)。以上結(jié)果提示，心肌纖維化動物模型成功建立。

2.3 ZLY18對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞纖維化的影響化合物ZLY18的結(jié)構(gòu)式如Fig 2A所示，在心肌成纖維細胞中，以Ang Ⅱ(10-7mol·L-1)誘導(dǎo)心肌成纖維細胞纖維化，每隔12 h補加一次AngⅡ，孵育36 h，模擬心肌纖維化模型。藥物組分為ZLY18(L)組、ZLY18(M)組和ZLY18(H)組，分別給予不同劑量的ZLY18 1 μmol·L-1、2 μmol·L-1和5 μmol·L-1，孵育24 h，研究其對心肌纖維化的作用。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，給予不同劑量ZLY18均能改善由Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的纖維化相關(guān)標志蛋白Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA的上調(diào)，并且改善作用具有一定的劑量依賴性(Fig 2B)。進一步免疫熒光實驗結(jié)果表明與Western blot結(jié)果具有相同趨勢(Fig 2C)。以上結(jié)果提示，ZLY18在細胞水平上能夠明顯改善由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞纖維化。

Fig 1 Ang Ⅱ-induced cardiac fibrosis in vitro and in or 6)A:Cardiac fibroblasts were incubated with Ang Ⅱ (10-7 mol·L-1) for the indicated durations;B:C57BL/6 mice were submitted to the subcutaneous injection of angiotensin Ⅱ;C,D:Postmortem measurements of HW/BW and HW/TL were performed;E,F:HE stained transections of the left ventricle were shown;G:Transverse views of left ventricle with PSR staining were shown.*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

Fig 2 Effect of ZLY18 on Ang Ⅱ-induced cardiac fibroblasts A:Chemical structural formula of ZLY18;B:The protein expression of Fibronectin,Collagen Ⅰ and α-SMA;C:The protein expression of α-SMA in cardiac fibroblasts.*P<0.05 vs Control group,#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group.

2.4 ZLY18對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化動物模型的保護作用探究首先，小鼠超聲心動圖結(jié)果如Fig 3A所示，進一步對超聲心動結(jié)果分析，如Fig 3B-I所示，與對照組相比，Ang Ⅱ組小鼠超聲心動射血分數(shù) (ejection fraction,EF)、左室短軸縮短率 (fraction shortening ,FS)等參數(shù)明顯下降，左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度 (LVPW)、左室內(nèi)徑(Diameter)等超聲心動參數(shù)均明顯增高，說明Ang Ⅱ 組的小鼠心功能下降，造模成功。而ZLY18處理后EF、FS明顯上調(diào)，LVAW、LVPW、Diameter明顯下調(diào)，并且具有一定的劑量依賴性。提示藥物組均能夠有效的改善由AngⅡ誘導(dǎo)的EF、FS下降，并一定程度上下調(diào)由AngⅡ誘導(dǎo)的LVAW、LVPW和Diameter的增高。

進一步觀察大鼠心臟的改變，心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示(Fig 4A-C)，與對照組相比，AngⅡ組小鼠心臟體積明顯增大，心肌細胞排列紊亂，心肌細胞體積增大，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，提示心臟發(fā)生病變，而化合物ZLY18處理均能夠明顯的改善AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞排列紊亂，心肌細胞體積增大，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡。此外，與對照組相比，AngⅡ組HW/BW、HW/TL明顯上調(diào)，表明小鼠心功能異常，而ZLY18處理均能夠明顯的改善AngⅡ引起的HW/BW、HW/TL上調(diào)(Fig 4D，E)。

心臟發(fā)生纖維化病變往往伴隨著大量ECM沉積，它主要由膠原蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖以及某些細胞因子、MMPs等組成。如Fig 5A-B所示，與對照組相比，Ang Ⅱ組小鼠膠原水平明顯增加，藥物組處理后小鼠膠原水平均明顯減少。進一步Western blot結(jié)果表明，AngⅡ處理后，C57BL/6小鼠心臟組織中Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA明顯上調(diào)，而給予不同劑量ZLY18均能下調(diào)由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的纖維化標志蛋白的表達，具有一定的劑量依賴性(Fig 5C-D)。以上結(jié)果表明，ZLY18不同劑量均能夠發(fā)揮良好的抗纖維化作用。

2.5 ZLY18通過抑制TGF-β1/Smads信號通路改善心肌纖維化如Fig 6A所示，在AngⅡ刺激下，TGF-β1、Smad3的磷酸化水平升高；相比AngⅡ組，給予不同劑量ZLY18下調(diào)了TGF-β1、Smad3的磷酸化水平。如Fig 6B所示，ZLY18能夠明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1、Smad3磷酸化水平增加。以上結(jié)果表明，ZLY18在體內(nèi)、外實驗中均能抑制AngⅡ介導(dǎo)TGF-β1/Smads通路的激活。

Fig 3 The echocardiography results of C57BL/6 mice treated with A:Echocardiography parameters were presented;B:Ejection fraction was detected and calculated;C:Fractional shortening was calculated;D,E:Left ventricular anterior wall thickness was detected and calculated;F,G:Left ventricle posterior wall thickness was detected and calculated;H,I:Both left ventricular internal dimensions at end-diastole and at end-systole were detected and calculated.**P<0.01 vs control group,#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group.

Fig 4 Effect of ZLY18 on Ang Ⅱ-induced cardiac fibrosis A:The control group animals received saline;B,C:HE-stained transections of the left ventricle were shown;D,E:Postmortem measurements of HW/BW and HW/TL were performed.**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Ang Ⅱ group.

磷酸化的Smad2/3可與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)位入核進而調(diào)節(jié)下游纖維化基因的表達[9]，同時給予AngⅡ、ZLY18共處理，處理完成后，通過IF實驗檢測Smad2/3在胞質(zhì)、胞核分布情況。Fig 6C顯示，正常組Smad2/3在胞核胞質(zhì)中分布均勻，在AngⅡ刺激下，Smad2/3在細胞核的分布增加，相比AngⅡ組，ZLY18低中高劑量處理均能減少Smad2/3在胞核的分布。以上結(jié)果提示：ZLY18通過下調(diào)TGF-β1水平，減少Smad2/3入核來抑制AngⅡ介導(dǎo)TGF-β1/Smads通路的激活。

3 討論

心肌纖維化廣泛存在于各類心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，其具體發(fā)病機制仍需要進一步闡明。在不同心臟疾病中，心肌纖維化所發(fā)揮的作用和具體機制各不相同，心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展伴隨著心功能的下降，最終發(fā)展為難治性心衰，成為心臟病患者死亡的主要原因之一[10],因此，預(yù)防與延緩心肌纖維化已是目前治療各種心臟疾病的重要策略。

TGF-β1/Smads信號通路激活在心肌纖維化中扮演重要角色，AngⅡ通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路[11]、PPAR γ信號通路[12]等多途徑激活心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在血容量、血壓和鈉穩(wěn)態(tài)的生理調(diào)節(jié)中具有重要的作用[13]。鑒于這一關(guān)鍵作用，RAAS信號傳導(dǎo)也與高血壓、心力衰竭、細胞外基質(zhì)重塑和纖維化等幾種重要臨床疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[14]。AngⅡ是一種多功能分子，在幾乎所有身體組織中以內(nèi)分泌/自分泌/旁分泌的方式起作用，與多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。心肌細胞損傷后，心臟局部RAAS成分明顯升高，AngⅡ增強心肌成纖維細胞與各種ECM蛋白的結(jié)合，促進纖維化相關(guān)蛋白的表達，從而導(dǎo)致心肌纖維化[16]。本研究采用AngⅡ建立心肌纖維化體內(nèi)體外模型，給予化合物ZLY18處理后，實驗結(jié)果提示ZLY18可能通過抑制RAAS的異常激活，改善由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，其具體機制仍需要進一步實驗證實。

TGF-β1是調(diào)節(jié)心肌組織纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)之一，且主要通過激活其下游受體Smads信號導(dǎo)致纖維化的發(fā)生發(fā)展。大量研究表明，TGF-β1通過直接激活Smads信號傳導(dǎo)來引發(fā)促纖維化基因過表達。TGF-β1/Smads通路的失常是導(dǎo)致組織纖維化的重要致病機制，而Smad2/3和Smad3則是促進TGF-β1介導(dǎo)的組織纖維化的兩個主要下游調(diào)節(jié)因子[17]。在病理條件下TGF-β1大量表達并激活TGF-β1/Smads通路，TGF-β1通過與轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(TGF-β RII)相互作用時被激活，然后TGF-βRII磷酸化轉(zhuǎn)化生長因子β受體I(TGF-β RI)，其又磷酸化細胞質(zhì)介質(zhì)Smad2/3和Smad3，并且與Smad4形成復(fù)合物，易位到細胞核中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而促進心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[18]。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，在Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的心肌纖維化模型下，化合物ZLY18能夠明顯下調(diào)TGF-β1、Smad3磷酸化水平和Smad2/3入核增加，抑制了TGF-β1/Smads信號通路異常激活，提示化合物ZLY18可以明顯改善由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化。

Fig 6 ZLY18 involved in inhibition of Smad3 phosphorylation and nucleus transfer of Smad2/3 by A，B：The protein level of p-Smad3 was analyzed by Western blot in vivo and in vitro；C：The nucleus transfer of Smad2/3 in primary myocardial fibroblasts was detected by IF assay.**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group.

此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ZLY18通過激活FFA1/PPAR-α/γ/δ信號通路在高脂、高糖飲食聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝模型中明顯抑制了纖維化相關(guān)基因的表達，與抗纖維化劑吡非尼酮相比，ZLY18對肝纖維化導(dǎo)致的炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死和靜脈間膠原橋形成減弱作用優(yōu)于吡非尼酮[10]。因此，我們猜想化合物ZLY18發(fā)揮抗纖維化作用是否與FFA1/PPAR-α/γ/δ信號通路激活有關(guān)？這種可能性需要進一步實驗證實。

綜上所述，ZLY18可以通過抑制TGF-β1/Smads信號通路來改善由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化。但是，化合物ZLY18對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化的保護作用是否優(yōu)于吡非尼酮尚不清楚，其抑制RAAS的異常激活仍須進一步探究。