免疫細胞來源的外泌體在結直腸癌中的研究進展

楊 健，盛康亮，王永中

(安徽大學生命科學學院，安徽省人體微生態(tài)與精準醫(yī)藥重點實驗室，安徽 合肥 230601)

消化道惡性腫瘤囊括多種，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是其中較為常見的一種，已成為繼肺癌、乳腺癌的第三大腫瘤疾病。根據(jù)我國最新惡性腫瘤流行病學研究發(fā)現(xiàn)，CRC發(fā)病率在男性和女性中分別排名第4位及第3位，死亡率為第5位及第4位，城鎮(zhèn)居民發(fā)病率更高。目前CRC已被列入重大防治疾病之一，CRC的早期防治、早期診斷和早期治療已成為當前的研究熱點。

外泌體是一種包含豐富的蛋白質(zhì)、RNA、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)的囊泡樣小體，直徑為20～100 nm，由細胞內(nèi)多囊泡體與胞膜融合后向細胞外分泌，廣泛分布于人體的各種體液中。外泌體通過與靶細胞識別結合，繼而進行細胞間信號轉導和信息傳遞。此外，外泌體識別的靶細胞的類型多種，作用于靶細胞的方式多樣，通過此效應維持機體正常的生理過程，還可以調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展，進一步可作為腫瘤早期診斷及治療的重要手段。

在免疫早期階段，固有免疫細胞行使免疫監(jiān)視功能，通過抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)提呈抗原，T細胞接受抗原刺激，分化形成效應T細胞，啟動特異性免疫反應，殺傷腫瘤細胞。然而，在腫瘤微環(huán)境中，免疫細胞并不都是殺傷腫瘤細胞，也可能會促進腫瘤進展。因此，在腫瘤的發(fā)生中，免疫細胞來源外泌體可能發(fā)揮重要作用，探究其發(fā)揮作用的機制大有必要。本文將對免疫細胞來源的外泌體對于CRC的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療的相關作用及其機制作一綜述。

1 外泌體

1.1 來源胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)主要由外泌體、微囊泡和凋亡小體組成。外泌體通過識別、組裝、融合后分泌至細胞外[1]。外泌體由多囊泡體產(chǎn)生，分泌到胞外，將其內(nèi)容物從供體細胞轉移到受體細胞來傳遞信息，從而影響靶細胞的功能。

1.2 功能外泌體的功能與多個因素相關，如細胞來源不同，其分泌的外泌體所行使的功能不同；外泌體中所包含的內(nèi)容物的種類不同，行使的功能也就不同。在生理和病理的不同階段，由不同細胞分泌的外泌體行使相應的功能而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。

1.2.1清除功能 早期假說證實外泌體可能作為細胞垃圾袋，排出多余和非功能細胞成分。在綿羊網(wǎng)織紅細胞體外培養(yǎng)中，最先發(fā)現(xiàn)外泌體。研究認為，網(wǎng)織紅細胞成熟為功能性紅細胞是一個復雜的過程，需要廣泛的細胞質(zhì)和質(zhì)膜重塑，細胞骨架重排和細胞結構的改變，此過程產(chǎn)生大量的廢棄物，網(wǎng)織紅細胞通過此機制清除細胞內(nèi)不需要的蛋白質(zhì)和其他生物分子，達到適合自身生長和生存狀態(tài)[2]。

1.2.2維持正常生理過程 (1)外泌體調(diào)控受體細胞生理活動和生理狀態(tài)。外泌體中包含信使RNA(messenger RNA，mRNA)和非編碼RNA(non-coding RNA)，具有多種生物調(diào)控功能。外泌體通過內(nèi)容物作用于靶細胞，調(diào)控其轉錄過程，進而影響其生理狀態(tài)。外泌體中的RNA還通過對細胞間通信功能的影響來調(diào)控受體細胞的生理活動。(2)外泌體維持受體細胞免疫耐受和免疫激活功能。Li等[3]以間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)來源的外泌體為基礎，采用逐層自組裝的方法構建靶向樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)RNA遞送系統(tǒng)，DCs來源的外泌體可以特異性結合DCs，同時引導嵌合體和外泌體的內(nèi)吞作用，然后核糖核酸內(nèi)切酶將適配體/siRNA(small interfering RNA)嵌合體切割成mTOR siRNA，在溶酶體消化下從外泌體釋放微小RNA(microRNA，miRNA)。DCs特異性細胞間黏附分子-3-結合非整合素分子(dendritic cell specific intercellular-adhesion-molecule-3 grabbing non-integrin，DC-SIGN)適配體快速誘導免疫耐受，隨后形成mTOR siRNA抑制mTOR(mammalian target of rapamycin)通路，抑制免疫應答。此外，DCs和腫瘤外泌體表達大量的主要組織相容性復合體類分子(MHC I)和腫瘤標記物熱休克蛋白(HSP)，參與抗原遞呈和刺激T細胞，觸發(fā)CD8+T細胞依賴性抗腫瘤反應，發(fā)揮免疫激活功能[4]。(3)外泌體調(diào)節(jié)細胞分化。外泌體調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路(canonical Wnt/β-catenin pathway)，Wnt信號靶點可作為肺泡上皮修復的潛在靶點，Wnt信號可調(diào)節(jié)Ⅱ型肺泡上皮細胞向Ⅰ型上皮細胞的分化，從而影響肺泡上皮修復過程。(4)外泌體調(diào)控細胞凋亡過程。有研究表明，外泌體中所包含的miR-542-3p通過靶向Toll樣受體4( Toll-like receptor 4 ，TLR4)調(diào)節(jié)細胞凋亡進程[5]。Liu等[6]也發(fā)現(xiàn)，在骨關節(jié)炎中，MSC來源的外泌體通過lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1(G-proteincoupled receptor kinase interacting protein-1)軸促進軟骨細胞增殖和抑制凋亡。

1.2.3介導病理過程 在感染、自身免疫性疾病和腫瘤等多種病理過程中，均有外泌體參與和介導。在病原菌感染期間，受感染細胞分泌的外泌體可對其周圍細胞防御感染的先天免疫應答產(chǎn)生影響。受感染細胞分泌的外泌體與抗原激活和調(diào)節(jié)免疫功能的關鍵分子的轉移相關，從而影響免疫應答。在流感感染期間，miRNAs和外泌體分泌失調(diào)與致病性和免疫調(diào)節(jié)有關[7]。受流感病毒刺激后，宿主miRNAs的表達發(fā)生改變。在病毒感染過程中，這些異常調(diào)控的miRNAs直接或間接地靶向病毒基因調(diào)控病毒復制，刺激或抑制固有免疫反應和細胞凋亡。

自身免疫性疾病是由自身對于自身抗原的免疫反應引起的疾病，進而損害自身組織。外泌體可參與免疫信號、炎癥和血管生成等過程介導自身免疫性疾病。在多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)的情況下，外泌體可以穿過血腦屏障，有助于將抗原擴散到外周，以便通過免疫系統(tǒng)的APC進行呈遞來進行介導。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中已顯示存在促炎外泌體，這些外泌體通過TLR介導的機制誘導外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和干擾素-α(interferor α，IFN-α)的分泌[8]。

此外，腫瘤細胞主動產(chǎn)生、釋放和利用外泌體促進腫瘤生長。腫瘤來源的外泌體(tumor-derived exosome，TEX)與靶細胞接觸，發(fā)揮其效應，影響靶細胞的相應功能，進而促進血管生成、血栓形成和腫瘤轉移。TEX介導的免疫反應進一步調(diào)控腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的互作。研究證實，TEX攜帶過量的免疫抑制蛋白CD3，在體外和體內(nèi)抑制了免疫細胞功能，從而促進腫瘤生長[9]。

2 外泌體在CRC中的作用

外泌體與CRC的發(fā)生、發(fā)展及診斷和預后密切相關。分泌外泌體的細胞來源類型多樣，包括腫瘤細胞和非腫瘤細胞。與非腫瘤細胞相比，腫瘤細胞分泌的外泌體更多，其分泌的外泌體內(nèi)含有的多種生物活性物質(zhì)，如蛋白、非編碼RNA、脂質(zhì)等，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2.1 外泌體促進CRC發(fā)生研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞來源外泌體中的RNAs誘導中性粒細胞，進而促進結直腸癌的發(fā)生。其機制主要是RNAs通過模式識別核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號軸誘導白細胞介素-1β(IL-1β)的表達以維持中性粒細胞生存。結直腸癌干細胞(colorectal cancer stem cells，CRCSCs)分泌的趨化因子1(chemokines 1，CXCL1)和趨化因子2(CXCL2)募集CRCSC誘導的中性粒細胞，通過釋放IL-1β促進CRC的發(fā)生[10]。

2.2 外泌體調(diào)控CRC進展結腸癌細胞來源的外泌體內(nèi)含有某種生物活性物質(zhì)，與腫瘤轉移密切相關。有研究表明，結腸癌細胞來源的外泌體內(nèi)miR-934通過下調(diào)PTEN(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten)表達和激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路進而誘導M2型巨噬細胞極化，促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[11]。外泌體通過轉移多種生物分子，包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)，介導腫瘤進展中的細胞間通信。研究也發(fā)現(xiàn)，LncRNAUCA1在結直腸癌組織中高表達，并在結直腸癌中發(fā)揮原癌基因作用，增加腫瘤細胞增殖和遷移能力[12]。

2.3 外泌體發(fā)揮促凋亡作用不同細胞來源的外泌體通過調(diào)控AKT/mTOR、NF-κB信號通路等途徑促進細胞凋亡。Beloribi-Djefaflia等[13]研究表明，胰腺腫瘤細胞來源的外泌體通過對AKT通路的調(diào)控，進而調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2( Bcl-2 associated X/B-cell lymphoma-2)凋亡分子比例以及抑制相關細胞核受體的表達來激活細胞凋亡。Cai等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，活化T細胞源性外泌體可以通過激活NF-κB通路誘導T細胞的自我凋亡。還有研究證實，在促進結直腸癌細胞凋亡的研究中，外泌體中miR-16-5p過表達可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時通過下調(diào)整合素α2(integrin α2，ITGA2)促進結直腸癌細胞的凋亡[15]。

2.4 外泌體引發(fā)免疫反應外泌體在腫瘤免疫反應中具有兩面性：一方面，腫瘤細胞來源的外泌體實現(xiàn)抗腫瘤免疫效應；另一方面，腫瘤細胞來源的外泌體在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。來自腫瘤微環(huán)境中DCs來源的外泌體通過誘導免疫系統(tǒng)的殺傷和抑制作用進而介導抗腫瘤免疫激活；相反，一些腫瘤細胞來源的外泌體可以通過抑制DCs的分化和成熟，以及負向調(diào)節(jié)T細胞受體的表達進而介導腫瘤免疫抑制反應，導致腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視。

2.5 外泌體可作為CRC診斷分子標志物外泌體可以作為新的腫瘤診斷分子標志物。Zeng等[16]提出，CRC細胞來源外泌體中的miR-25-3p，是促進CRC轉移的miRNA，其通過外泌體從CRC細胞轉移到內(nèi)皮細胞。miR-25-3p通過靶向Kruppel樣轉錄因子2(Kruppel-like factor2，KLF2)和KLF4調(diào)控內(nèi)皮細胞VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2)、ZO-1、Occludin和Claudin-5的表達，從而提高血管通透性和促進血管生成。此外，發(fā)生腫瘤轉移的CRC患者血漿外泌體中的miR-25-3p表達水平明顯高于無轉移的CRC患者。外泌體miR-25-3p參與了轉移前生態(tài)位的形成，并可作為診斷CRC轉移的血液中生物標志物。Li等[17]報道，結直腸癌患者手術治療前腫瘤組織和血漿外泌體中GPC1+外泌體的百分率和硫酸肝素蛋白(glypican-1，GPC1)表達明顯高于對照組組織和血漿中GPC1+外泌體的表達；miR-96-5p和miR-149在結直腸癌患者腫瘤組織、血漿以及結直腸癌患者GPC1+外泌體中的表達明顯低于健康對照組組織和血漿中的表達。血漿GPC1+外泌體表達增加，血漿miR-96-5p和miR-149表達降低，是CRC診斷的特異性標志物，也是CRC治療的靶點。

2.6 外泌體在CRC預后評價中的作用Liu等[18]評估了80例CRC患者的差異表達miRNA后，選擇miR-106b-3p作為CRC轉移相關的miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，有轉移的CRC患者血清外泌體miR-106b-3p的表達水平明顯高于無轉移的CRC患者。此外，患者血清外泌體miR-106b-3p高表達與預后不良相關。研究結果表明，來自血清外泌體的轉移相關miR-106b-3p可作為CRC患者潛在的預后生物標志物和治療靶點。Tian等[19]的研究結果發(fā)現(xiàn)了一個基因簇miR-221/222，其在CRC伴肝轉移患者的血清外泌體樣本中呈結構性上調(diào)，這種上調(diào)預示著較低的總生存率。研究結果表明，外泌體miR-221/222促進結直腸癌的進展，并可能作為結直腸癌合并肝轉移患者的一種新的預后標志物和治療靶點。

3 免疫細胞來源的外泌體與CRC

在CRC進展過程中，大量固有免疫細胞如巨噬細胞、DCs、T淋巴細胞、B淋巴細胞均在CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，發(fā)揮機體抵抗病原物入侵的首道防線。免疫細胞通過分泌炎癥因子、趨化因子等進而影響CRC的病理進程。同時，免疫細胞來源的外泌體組成了CRC微環(huán)境，參與細胞間的物質(zhì)和信息傳遞，參與介導免疫反應，調(diào)控CRC發(fā)生發(fā)展。

3.1 T淋巴細胞來源的外泌體T淋巴細胞是機體內(nèi)一種最為常見的免疫細胞，參與并介導細胞免疫反應過程，在免疫應答中行使重要的功能。病原體進入機體，首先由APC結合并遞呈，T淋巴細胞接受APC遞呈信息而活化，形成效應T淋巴細胞，從而發(fā)揮免疫應答作用。有研究表明，IL-17信號可以抑制腫瘤細胞誘導T細胞趨化因子CXCL9和CXCL10的產(chǎn)生。CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTLs)和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory cells，Tregs)需要CXCL9/10信號轉導。CRC中IL-17信號丟失可導致CTLs和Tregs的募集顯著增加，CTLs一般被認為是介導腫瘤細胞殺傷的最終效應細胞，進而抑制結直腸癌的發(fā)展。

T淋巴細胞是在特異性免疫應答階段發(fā)揮免疫作用最為主要的細胞。T淋巴細胞來源的外泌體含有具有生物活性的Fas配體，可誘導腫瘤細胞的凋亡。T淋巴細胞被激活后，可分化為CTLs，其中含有特征性的外泌體，通過上調(diào)β-catenin來調(diào)控NF-κB/snail信號通路，抑制腫瘤轉移進程。Qiu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞來源的外泌體在腫瘤程序性細胞死亡起抑制作用。Tregs來源的外泌體中miRNA作用于DCs，進而影響DCs分泌炎癥因子以調(diào)節(jié)結直腸癌的進程。

3.2 巨噬細胞來源的外泌體巨噬細胞來源于單核細胞，作為吞噬細胞的一種，巨噬細胞起識別、攝取和殺滅病原體及異物的作用。巨噬細胞分泌細胞因子，招募其他的免疫細胞，是非特異性免疫反應中的重要參與者。腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞一般分為兩種重要類型：一類是M1型，能有效抑制腫瘤的生長；另一類是M2型，促進腫瘤的生長和轉移。

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)在腫瘤微環(huán)境中扮演重要角色，并協(xié)調(diào)各種細胞因子影響腫瘤進展。研究表明，M1型巨噬細胞促進脂肪組織來源的干細胞中的相關凋亡誘導配體表達，通過增加CD133+腫瘤干細胞的凋亡和減少M2型巨噬細胞的數(shù)量進而抑制結腸炎相關的結腸癌[21]。而M2型巨噬細胞可以通過基質(zhì)金屬蛋白酶增強結腸癌細胞的侵襲能力，促進結腸癌的生長和轉移。

巨噬細胞來源的外泌體對腫瘤的生長和遷移也有重要的影響。巨噬細胞來源的外泌體可以影響腫瘤細胞增殖和侵襲。Wnt 5α是一種富含半胱氨酸結構域的分泌性糖蛋白，在很多惡性腫瘤中都呈高表達狀態(tài)，其主要功能是促進腫瘤的增殖、分化和轉移。巨噬細胞可以受到來自腫瘤細胞來源的外泌體的誘導，增加Wnt 5α的表達，并在巨噬細胞分泌的外泌體膜表面富集，這種巨噬細胞來源的外泌體被腫瘤細胞攝取后可以被檢測到，并被證明能明顯增強腫瘤的侵襲性[22]。

巨噬細胞來源的外泌體對結腸癌進程具有顯著影響。相關研究表明，M2型巨噬細胞調(diào)控結直腸癌細胞的遷移和侵襲依賴于M2型巨噬細胞衍生的外泌體(macrophage-derived exosomes，MDE)。MDE高表達miR-21-5p和miR-155-5p，并且證實MDE介導的結直腸癌細胞的遷移和侵襲依賴于這兩種miRNAs。miR-21-5p和miR-155-5p通過MDE轉移至結直腸癌細胞，并結合BRG1抑癌基因編碼序列，下調(diào)BRG1表達。BRG1被認為是促進結直腸癌轉移的關鍵因素，但在轉移性結直腸癌細胞中表達下調(diào)[23]。M2型巨噬細胞來源的外泌體中的miR-155-5p還可通過靶向ZC3H12B，降低ZC3H12B的表達進而上調(diào)IL-6水平，從而誘導免疫逃逸和腫瘤形成，增強結直腸癌的侵襲性。此外，通過下調(diào)ZC3H12B表達進而促進IL-6的水平，最終抑制T細胞免疫應答，促進CRC免疫逃逸。綜上所述，MDE顯著地調(diào)控BRG1基因表達，在腫瘤惡性進展過程中維持腫瘤微環(huán)境，誘導結直腸癌細胞的遷移和侵襲。因此，結直腸癌細胞和MDE之間的動態(tài)相互作用為轉移性結直腸癌的治療提供了新的靶點。

除了miRNA對CRC進展產(chǎn)生影響以外，外泌體中包含的其它成分也會對CRC進展產(chǎn)生影響。研究表明，外泌體包含的功能性蛋白，如纖連蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)、PROM1(prominin1)和整聯(lián)蛋白 β1(ITGB1)等參與了與CRC轉移和進展相關的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Ras相關蛋白1(Ras-related protein 1，Rap1)、和整合素，促進結直腸癌的發(fā)展[24]。此外，外泌體中LncRNAs可能在包括腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移在內(nèi)的癌癥發(fā)病和進展的細胞過程中發(fā)揮關鍵作用。已有研究結果表明，外泌體中的LINC00152的表達水平下降，會加速CRC進展[25]。

總之，免疫細胞來源的外泌體與CRC進展密切相關。然而，對于B淋巴細胞、NK細胞和DCs來源的外泌體對CRC進展的影響鮮有報道，相信在未來的研究中會不斷發(fā)現(xiàn)不同免疫細胞來源的外泌體調(diào)控CRC的生物學作用。

Tab1 Effects of bioactive substances in exosomes on proliferation，invasion and metastasis of CRC

4 小結與展望

CRC已然成為當前最常見的消化道惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率和死亡率較高，對于CRC的預防及治療已成為當前的研究熱點。外泌體與CRC的發(fā)生、發(fā)展、診斷及其預后密切相關。免疫細胞來源的外泌體對CRC的生長、侵襲、轉移的調(diào)控產(chǎn)生重要影響，特別是M2型巨噬細胞和T淋巴細胞通過自身釋放外泌體。其外泌體包含的生物活性物質(zhì)，如miRNA和功能性蛋白等，對CRC的產(chǎn)生不同的生物學效應。不同免疫細胞來源的外泌體在腫瘤的診治及預后方面發(fā)揮重要作用，值得繼續(xù)深入探討。