中藥調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞改善阿爾茨海默病的研究進(jìn)展

潘予璠，信琪琪，袁 蓉，繆 宇，叢偉紅

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病實驗室，國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100091)

小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的主要免疫細(xì)胞，約占CNS細(xì)胞的0.10～0.15。作為神經(jīng)炎癥調(diào)控機(jī)制的主要參與者，MG以3種不同表型存在并發(fā)揮作用，即靜息狀態(tài)M0型和活化狀態(tài)M1、M2型。靜息狀態(tài)下，MG動態(tài)監(jiān)測腦內(nèi)微環(huán)境，清除細(xì)胞碎片和感染物質(zhì)，形態(tài)上表現(xiàn)為“分枝形”，胞體較小，突起變長；當(dāng)腦組織受到感染或損傷時，MG被激活為M1和M2兩種表型：M1型為促炎癥表型，在疾病過程中誘發(fā)多種炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等，誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)突觸丟失，加速疾病進(jìn)程；M2型為抗炎癥表型，通過產(chǎn)生抗炎因子和神經(jīng)保護(hù)因子，如白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等，增強(qiáng)MG對淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的吞噬作用，抑制炎癥，改善疾病狀態(tài)[1]。綜合已有研究發(fā)現(xiàn)，MG過度激活可能促進(jìn)神經(jīng)炎癥、加速神經(jīng)元損傷。中藥可改善AD腦內(nèi)Aβ沉積，減輕神經(jīng)炎癥，并通過調(diào)節(jié)MG表面受體表達(dá)促進(jìn)其發(fā)揮M2型保護(hù)作用，從而改善大腦認(rèn)知功能，起到預(yù)防和延緩AD的作用。本文對相關(guān)內(nèi)容及中藥通過MG發(fā)揮改善AD的可能作用和機(jī)制進(jìn)行總結(jié)和分析，以期為中藥治療神經(jīng)退行性疾病提供理論依據(jù)。

1 MG在AD病變中的可能作用和機(jī)制

在AD病變中，MG以兩種激活狀態(tài)同時存在并發(fā)揮作用。伴隨衰老和受遺傳等因素的影響，M1型的比例不斷上升，可誘發(fā)釋放神經(jīng)炎癥因子、加速微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein，TAU)蛋白過磷酸化并增加突觸的丟失和膽堿系統(tǒng)功能障礙。MG在AD病變中的可能作用和機(jī)制，見Fig 1。

1.1 雙向調(diào)節(jié)Aβ沉積淀粉樣蛋白學(xué)說目前仍是AD發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為，Aβ聚集、沉積產(chǎn)生的神經(jīng)毒性是最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的主要形式。有研究提示在疾病不同階段，MG對Aβ沉積表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用[2]。一方面，MG大量聚集在Aβ斑塊周圍形成屏障，抑制斑塊體積增加并保護(hù)神經(jīng)元。另一方面，在Aβ的長期刺激下，激活的MG表現(xiàn)出有害作用，其釋放的炎癥介質(zhì)(如炎性因子、補體成分和自由基等)參與AD發(fā)病，反過來加速Aβ的產(chǎn)生和積累，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激等病理現(xiàn)象。研究表明，髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)可能參與MG活化，進(jìn)而發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)Aβ沉積的機(jī)制。TREM2是MG表面的跨膜受體蛋白。TREM2釋放可溶性sTREM2，通過激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路促進(jìn)MG增殖發(fā)生的同時，增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)和吞噬Aβ斑塊的作用[3]。

1.2 促進(jìn)慢性神經(jīng)炎癥神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是AD三大發(fā)病機(jī)制(Aβ沉積、TAU蛋白過度磷酸化和神經(jīng)炎癥)之一。大腦中的炎癥是由激活的MG和星形膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的，其中MG被認(rèn)為是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因素。研究表明，MG能夠被多種物質(zhì)活化并激活其下游信號通路核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)毒性細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6和活性氧自由基等)，導(dǎo)致Aβ清除受阻、TAU病理加重以及突觸丟失等病理現(xiàn)象[4]。

Fig 1 Role and possible mechanisms of microglia in pathological changes of AD

補體是一組存在于人和動物細(xì)胞表面的蛋白，經(jīng)活化后具有生物活性，可介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，也稱為補體系統(tǒng)。研究表明，MG是大腦補體C1q(complement C1q)蛋白的主要來源，而后者的上調(diào)將作為經(jīng)典補體系統(tǒng)的啟動信號，靶向神經(jīng)炎癥因子的產(chǎn)生和神經(jīng)元丟失，抑制C1q活動可以挽救神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙[2]。經(jīng)典補體系統(tǒng)釋放炎癥信號誘導(dǎo)M1型細(xì)胞活化，釋放IL-1β、IL-6等炎癥因子引發(fā)慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)[5]。因此，抑制MG激活或使用抗炎藥物成為治療AD神經(jīng)炎癥的一種潛在方式，但其療效和長期服用可能導(dǎo)致的副作用尚無統(tǒng)一結(jié)論。具有抗炎作用的傳統(tǒng)中藥種類繁多，相較長期服用西藥治療，中藥具有療效顯著、副作用小的特點，有潛在開發(fā)價值。

1.3 加速TAU蛋白過磷酸化TAU蛋白是CNS中含量最高的微管相關(guān)蛋白。Fuyuki等[6]于2018年提出TAU誘導(dǎo)的突觸功能障礙早于Aβ病理的產(chǎn)生，且突觸丟失與認(rèn)知能力下降具有極強(qiáng)的相關(guān)性，故推測TAU蛋白而非Aβ可能是影響AD進(jìn)展的主要因素。

MG在TAU病理的啟動和傳播中發(fā)揮重要作用。研究表明，TREM2和APOE過表達(dá)調(diào)節(jié)MG釋放多種炎性因子(如IL-6、TNF-α和IL-1β等)以及補體C1q蛋白，誘發(fā)神經(jīng)炎癥和經(jīng)典的補體級聯(lián)反應(yīng)，加速病理性TAU蛋白聚集和突觸丟失。另外，MG可通過吞噬細(xì)胞和體外分泌囊泡的方式參與介導(dǎo)病理性TAU蛋白的傳播，減少MG數(shù)量可以顯著抑制病理性TAU蛋白的產(chǎn)生和傳播過程[7]。但是，MG如何啟動和介導(dǎo)TAU的病理過程，目前尚不明確。

1.4 誘導(dǎo)膽堿能系統(tǒng)功能障礙在AD病變過程中，乙酰膽堿酯酶與Aβ相互作用，促進(jìn)淀粉樣斑塊的形成和MG活化，Yulia等[8]采用腦室注射免疫毒素192IgG-saporin誘導(dǎo)膽堿能細(xì)胞死亡，構(gòu)建膽堿能神經(jīng)元變性模型，研究發(fā)現(xiàn)注射1.5月后大鼠海馬CA3區(qū)和DG區(qū)離子鈣結(jié)合適配器分子 1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，更多MG呈現(xiàn)“胞體增大、突起回縮”的活化狀態(tài)，并伴隨神經(jīng)元的丟失。毒蕈堿型受體、煙堿型受體是存在于MG表面的兩類膽堿能受體。APP/PS1小鼠終生補充5.0 g·kg-1氯化膽堿飲食后，其水迷宮實驗結(jié)果獲得改善、MG誘導(dǎo)的炎癥得到緩解，相關(guān)機(jī)制可能與抑制MG活化以及煙堿樣乙酰膽堿受體α7亞型(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nACh)等煙堿型受體的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[9]。

2 中藥提取物及有效成分對AD小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

中藥有多成分、多靶點、多途徑的治療特點，對于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的疾病表現(xiàn)出較好的療效和較低的毒副作用。西醫(yī)對AD一直缺乏有效治療手段，而近年來中醫(yī)藥防治AD的研究引起廣泛關(guān)注，為患者帶來新的希望。有學(xué)者指出，MG作為神經(jīng)炎癥的主要參與者，其不同表型變化伴隨疾病的發(fā)展表現(xiàn)出對AD的雙向調(diào)節(jié)作用，Aβ激活的MG通常表現(xiàn)為神經(jīng)毒性細(xì)胞因子產(chǎn)生、早期突觸丟失和記憶功能損傷。另外，隨著年齡的增長，慢性炎癥也會損害MG的防御功能并引發(fā)促炎癥型MG活化，而MG的激活與其穩(wěn)態(tài)基因的下調(diào)和AD風(fēng)險基因的上調(diào)有關(guān)，包括APOE、TREM2和TYRO蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白(transmembrane immune signaling adaptor，TYROBP)，其中TREM2被證明參與MG的激活過程，該蛋白功能的改變可能對AD中MG的活化和不同表型之間的轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要作用[10]。因此，依據(jù)MG的作用機(jī)制可將中藥的干預(yù)途徑總結(jié)為以下3種：通過抑制MG促炎癥表型增強(qiáng)對Aβ的吞噬作用，限制MG激活的有害影響；通過增加M2型抗炎特性減少腦內(nèi)神經(jīng)炎癥，增強(qiáng)MG神經(jīng)保護(hù)作用；通過調(diào)節(jié)多種受體蛋白表達(dá)干預(yù)MG的免疫反應(yīng)。

2.1 抑制MG激活，增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用有研究指出，Aβ毒性蛋白沉積與MG不同表型的激活關(guān)系密切。隨著Aβ沉積增多，MG吞噬和清除作用增強(qiáng)。但在衰老和遺傳等因素影響下，過量的Aβ沉積將激活MG進(jìn)入炎癥狀態(tài)，即M1表型，在這種狀態(tài)下，MG吞噬突觸神經(jīng)、分泌炎性細(xì)胞因子并促進(jìn)TAU病理變化的擴(kuò)散，大大加速疾病的發(fā)展過程[2]。

苦參堿是一種喹諾里西啶類生物堿，是中藥苦參的主要活性成分之一，Li等[11]通過側(cè)腦室注射低聚Aβ蛋白(2.5 g·L-1，4 μL)建立認(rèn)知障礙和神經(jīng)炎癥模型小鼠，腹腔注射不同濃度苦參堿溶液(10、20和40 mg·kg-1)21 d后發(fā)現(xiàn)，MG活化程度顯著較低，海馬組織中ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平均下降，且兩種還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶亞型的表達(dá)下調(diào)?；熞鸬恼J(rèn)知障礙是化療期間常見的副反應(yīng)，患病率高達(dá)0.69～0.78。有研究表明，10 mg·kg-1人參皂苷RG1給藥3周，可以顯著提高腹腔注射DAC(多西他賽、阿霉素、環(huán)磷酰胺)引起的化療腦模型小鼠水迷宮游泳成績，降低海馬神經(jīng)元活性，減少促炎因子表達(dá)，提示人參皂苷RG1可以通過調(diào)節(jié)MG活化介導(dǎo)的細(xì)胞因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和改善認(rèn)知的作用[12]。此外，大豆中的異黃酮類成分可通過抑制MG激活及其激活后產(chǎn)生和釋放的可溶性促炎因子而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]。白藜蘆醇是廣泛存在于多種植物中的一種非黃酮類多酚化合物，由于其具有顯著的神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等作用，成為近年來AD研究的熱點。李曉光[14]用FAM熒光標(biāo)記Aβ蛋白，通過檢測含有FAM-Aβ熒光的BV-2細(xì)胞數(shù)量來顯示細(xì)胞的吞噬作用，結(jié)果表明，20 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著提高BV-2細(xì)胞對Aβ的吞噬作用，給藥組TREM2蛋白表達(dá)量是對照組的1.7倍，血清中sTREM2含量相比對照組降低0.7，且吞噬作用隨外源性sTREM2的增加而增強(qiáng)，推測白藜蘆醇通過促進(jìn)TREM2蛋白表達(dá)及抑制sTREM2，進(jìn)一步影響B(tài)V-2細(xì)胞對Aβ的吞噬功能。

另有研究表明，姜黃素可以有效抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥因子釋放，降低M1型細(xì)胞比例，并增強(qiáng)細(xì)胞吞噬作用，推測姜黃素可能通過靶向TREM2-TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號通路抑制MG活化、發(fā)揮吞噬和抗炎作用[5]。Gao等[15]利用TLR4-/-基因敲除小鼠探究中藥姜黃素調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)MG的作用機(jī)制，結(jié)果表明腹腔注射50、100和200 mg·kg-1姜黃素24 h可顯著抑制TLR4、NF-κB和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)等蛋白表達(dá)。其中，姜黃素100 mg·kg-1可顯著抑制促炎因子釋放和MG激活。

2.2 促進(jìn)M2型活化，減少腦內(nèi)炎癥神經(jīng)炎癥是CNS在感染、毒性代謝物、創(chuàng)傷或自身免疫的刺激下發(fā)生的一種免疫失調(diào)。為了應(yīng)對CNS損傷、保護(hù)腦功能，小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞會調(diào)控突觸平衡并促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除。在神經(jīng)退行性疾病中，上述過程可能會受到影響。代替激活型MG(M2極化)是MG的一種具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)炎癥抑制作用的活化表型，通常存在于疾病的急性損傷期，具有促進(jìn)組織修復(fù)和再生、保護(hù)神經(jīng)元并釋放IL-4和IL-10等抗炎細(xì)胞因子、抑制炎癥反應(yīng)的作用。可見，在不同病理時期，MG激活后將發(fā)揮不同的作用，因此，如何促進(jìn)MG向M2表型活化并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用被認(rèn)為是治療和改善AD的關(guān)鍵。

補虛藥是治療AD時使用頻率最高的一類中藥，其中淫羊藿的有效成分淫羊藿苷已被證明是一種有效的抗炎劑。以炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)標(biāo)記M1型細(xì)胞、以抗炎因子(IL-4、IL-10和TGF-1)標(biāo)記M2型細(xì)胞，探究淫羊藿苷調(diào)節(jié)MG極化的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可顯著提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠水迷宮游泳成績、抑制M1型標(biāo)記物的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過激活PPARγ受體蛋白通路從而誘導(dǎo)M1向M2極化[16]。另外，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB也是中藥調(diào)控MG激活、表型轉(zhuǎn)化和神經(jīng)炎癥的重要信號分子。研究表明，西紅花的主要成分西紅花苷可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子和活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，其機(jī)制可能是通過抑制NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)和NF-κB信號通路、促進(jìn)MG向M2型極化進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[17]。以脂多糖誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞模型研究丹參酮I干預(yù)神經(jīng)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，丹參酮I可顯著降低NO、TNF-α和IL-6的生成、抑制NF-κB信號通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并顯示出劑量依賴性。隨后采用C57BL/6小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 -四氫吡啶的方法建立帕金森病模型，再次證實了這一結(jié)論[18]。黃柏的甲醇提取物在干預(yù)AD引發(fā)的炎癥時也表現(xiàn)出相同的作用機(jī)制，MG中炎性因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)被高度抑制，同時NO誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡減少[19]。銀杏葉提取物EGb 761被證明具有抗炎作用，其機(jī)制可能是通過降低前列腺素E2的釋放而抑制MG活化和細(xì)胞因子的釋放[20]。此外，β-細(xì)辛酮[21]、川芎嗪[22]和延胡索[23]等成分也被證明具有調(diào)節(jié)MG極化、降低炎性因子表達(dá)，從而改善神經(jīng)炎癥的作用。

2.3 調(diào)節(jié)MG受體蛋白表達(dá)人類基因組測序結(jié)果提示，MG中多種免疫相關(guān)受體的基因在AD中呈高表達(dá)(如TREM2、CR1和CD33等)，且其蛋白產(chǎn)物通常作為膜受體參與呈遞抗原、吞噬有害物質(zhì)以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等免疫功能。地黃所含成分梓醇可抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞表面TLR4和LPS的結(jié)合，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路的活化發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[24]。黃芪甲苷是中草藥黃芪的主要活性成分，給藥14 d后可顯著改善大鼠腦損傷所致的中樞神經(jīng)炎癥，增加PPARγ受體蛋白表達(dá)和神經(jīng)保護(hù)因子的釋放[25]。

除中藥有效成分外，中藥復(fù)方調(diào)控MG研究也有進(jìn)展。新近結(jié)果提示，灌胃給予3×Tg-AD轉(zhuǎn)基因小鼠芍藥甘草湯36 d，可顯著提高其水迷宮成績，降低小鼠海馬區(qū)和大腦皮層內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，抑制腦內(nèi)Aβ聚集和TAU蛋白過磷酸化，通過下調(diào)NLRP1/NLRP3蛋白表達(dá)發(fā)揮抗Aβ聚集和神經(jīng)保護(hù)作用[26]。王蕾等采用腹腔注射百日咳毒素和皮下注射隧橋少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白建立C57BL/6J小鼠炎癥模型，灌胃給予補腎益髓膠囊(3.02 g·kg-1)，結(jié)果顯示小鼠體質(zhì)量增加、炎癥減輕，其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(iNOS+/Iba1+)降低，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(Arg1+/Iba1+)升高，炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平均顯著降低，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-124表達(dá)、上調(diào)miR-155表達(dá)、促進(jìn)M2型細(xì)胞極化有關(guān)[27]。目前已知的中藥調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制參見Tab 1。

3 展望

據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會2018年報告，全球每3 s就會有1例癡呆患者產(chǎn)生，預(yù)計到2050年，全球?qū)?.51億人患有癡呆，其中2/3為AD患者[28]?，F(xiàn)有的AD治療藥物均無法抑制AD的發(fā)生或發(fā)展進(jìn)程，包括適用于任何階段的膽堿酯酶抑制劑和用于中度或重度患者的鹽酸美金剛片。因此，有學(xué)者提出，以多種藥物聯(lián)合療法作為治療阿爾茨海默病的未來方案。可見，針對發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病理現(xiàn)象相互影響的多因素疾病，其治療必須從單一靶點藥物轉(zhuǎn)向多靶點的藥物，中藥因其自身特性可作為神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物。另外，藥物能夠被吸收并通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)也是AD藥物開發(fā)時需要考慮的關(guān)鍵因素，對此中藥提供了豐富的備選資源[23]。

“雙刃劍”效應(yīng)使得以MG為靶點的治療復(fù)雜化。在疾病早期，激活MG有助于Aβ吞噬作用和神經(jīng)保護(hù)；而在疾病后期，抑制M1型活化對于減緩疾病進(jìn)程至關(guān)重要。Aβ吞噬作用是MG作為中樞神經(jīng)免疫細(xì)胞具有的特殊功能，在AD疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。但目前關(guān)于MG對Aβ的吞噬作用研究較少。已知通過FAM、methoxy-X04免疫熒光染色可有效檢測吞噬性MG數(shù)量，酶聯(lián)免疫吸附法可檢測血清中Aβ積累[29]，或可為中藥調(diào)控MG吞噬作用研究提供有效檢測方法。盡管大量研究已證實，中藥有效成分或復(fù)方對調(diào)控MG、改善AD表現(xiàn)出較好的潛在治療作用，但存在體內(nèi)研究較少、檢測手段單一、作用機(jī)制不明確等問題。因此，未來的研究一方面應(yīng)充分關(guān)注中藥在疾病不同階段的多靶點作用以及對MG表型轉(zhuǎn)化的影響；另一方面應(yīng)深入探究MG在神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、能量代謝等方面的作用機(jī)制以及中藥的相關(guān)調(diào)控途徑，從而為中藥或復(fù)方靶向調(diào)控MG、改善AD提供新的思路。

Tab 1 Regulative mechanisms of traditional Chinese medicine on microglia