包裹R848 的PS仿生脂質(zhì)體增強(qiáng)H7N9 流感病毒滅活疫苗的黏膜免疫效應(yīng)

劉 斌，向雨晴，周慧旭，王成龍，張風(fēng)華，常海艷

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙 410081）

流行性感冒病毒（influenza virus）簡稱流感病毒，歸屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridea），是一種ssRNA 病毒。其引起的流行性感冒以及相關(guān)并發(fā)癥，在全球范圍內(nèi)平均每年造成將近50 萬人死亡。根據(jù)病毒基質(zhì)蛋白與核蛋白抗原性的不同，流感病毒家族被分為甲（A）、乙（B）、丙（C）、?。―）四個型別。而A 型流感病毒在自然界最為常見，宿主具有多樣性，且可跨物種傳播，是導(dǎo)致流感流行及大流行的主要型別。其原因為，A 型流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）裸露在病毒包膜上，基因片段在流感病毒基因組中最容易發(fā)生變異。A 型流感病又根據(jù)HA 以及NA 抗原性不同分為HA 亞型（H1～H18）與NA亞型（N1～N11）。感染人的亞型主要包括H5N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N4、H7N9、H5N6 和H5N8，而H7N9 引發(fā)的感染由于其前期癥狀與普通流感相似，后期發(fā)病迅速，死亡率可達(dá)到40%，已經(jīng)在中國引發(fā)了五波感染，且暫無對應(yīng)疫苗上市。

目前上市的流感疫苗有減毒活疫苗、滅活疫苗以及重組HA 蛋白疫苗，此外，流感mRNA 疫苗已進(jìn)入臨床后期［1］。目前，滅活疫苗依然是在世界各國廣泛使用的流感疫苗，但其通過肌肉注射的途徑接種，很難誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫。事實上呼吸道黏膜上皮細(xì)胞才是流感病毒感染的第一靶位，相對傳統(tǒng)的非胃腸道疫苗只能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的血清型免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）中和抗體，不能刺激呼吸道黏膜產(chǎn)生分泌型IgA（secretory IgA，sIgA），因此不能更加有效地阻止病毒在呼吸道內(nèi)的繁殖。黏膜免疫較非胃腸道免疫效果更為理想。除了能誘導(dǎo)產(chǎn)生sIgA 抗體外，黏膜免疫的效應(yīng)部位并不是只局限在最初致敏的黏膜部位，sIgA 特異性抗體形成細(xì)胞前體可從最初的黏膜部位經(jīng)過位點(diǎn)特異性歸家途徑（site-specific homing pathways）遷移到全身其他部位。基于這些研究和共識，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）大力提倡發(fā)展流感疫苗的黏膜免疫。合適的黏膜疫苗或佐劑不僅能誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，也可以使機(jī)體獲得系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，特別是針對流感等呼吸道病毒有著至關(guān)重要的意義［2］。

肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS）作為肺黏膜系統(tǒng)的組成部分，既能構(gòu)成阻止病原微生物進(jìn)入肺泡區(qū)，進(jìn)而侵襲到肺部的屏障，又能阻止納米粒子以及親水性藥物分子的通過［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，利用磷脂及固醇合成的肺表面活性物質(zhì)的脂質(zhì)體，能與STING（stimulator of interferon genes）激動劑環(huán)鳥苷一磷酸腺苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP）佐劑制備成PS-GAMP，與流感病毒疫苗包裹后經(jīng)黏膜免疫小鼠誘導(dǎo)了IgG 和IgA 抗體，并能提供不同亞型流感病毒攻毒的交叉保護(hù)［4］。

瑞喹莫德（R848）是一種鳥苷衍生物，是Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）7/8 的激動劑［5］，最初是作為I 型干擾素（interferon，IFN）的誘導(dǎo)物開發(fā)出來的，因其具有抗腫瘤和抗病毒活性在臨床得到運(yùn)用。R848 可以促進(jìn)Th1 型細(xì)胞因子如IFN-γ、IFN-α 和白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）等的分泌，能增強(qiáng)針對抗原的細(xì)胞免疫和抗體產(chǎn)生，是一種潛在的 Th1 型候選佐劑［6］。很有趣的一點(diǎn)是，R848 既可以作為一些病毒的抗病毒性藥物，又可以作為疫苗佐劑。而作為佐劑，與TLR4 激動劑（脂多糖）和TLR9 激動劑（CpG-C）相比，R848 在體內(nèi)誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞在淋巴結(jié)中聚集的程度更大，佐劑效果更強(qiáng)［7-8］。R848 經(jīng)皮內(nèi)或鼻內(nèi)免疫都具有普遍的免疫刺激作用，可以促使鼻內(nèi)T 細(xì)胞激活，誘導(dǎo)體內(nèi)IL-10 和IL-17 的產(chǎn)生。相反，經(jīng)皮內(nèi)免疫疫苗誘導(dǎo)的T 細(xì)胞分泌IL-10 的量減少?？傊つっ庖叩男Чc皮內(nèi)免疫相比誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答較弱，這可能是由于皮內(nèi)免疫后抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）對抗原的局部攝取更強(qiáng)所導(dǎo)致［9］。肺表面活性劑層是II型肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cell，AEC）分泌的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的混合物，能夠阻止R848 進(jìn)入AEC，如果要使R848 發(fā)揮黏膜佐劑效應(yīng)，必須將其運(yùn)送到APC或AEC的細(xì)胞中，而不破壞AEC層的完整性。

鑒于此，本文利用磷脂及固醇合成肺表面活性物質(zhì)形成的仿生脂質(zhì)體PS，與R848 制備成PS-R848佐劑，檢測其表征后與H7N9 流感病毒滅活疫苗混合，經(jīng)鼻腔免疫BALB/c 小鼠，檢測誘導(dǎo)的免疫效果與流感病毒攻毒后對免疫小鼠產(chǎn)生的保護(hù)效果，比較其與單獨(dú)疫苗黏膜免疫的增強(qiáng)效果。

1 材料與方法

1.1 病毒、疫苗以及試驗動物和細(xì)胞

試驗動物：6～8 周齡的雌性無特定病原級BALB/c 小鼠（Mus musculus，ired strain），購自斯萊克景達(dá)生物有限公司，飼養(yǎng)于本校無特殊病原菌（specific-pathogen-free，SPF）級動物房。

H7N9 病毒株（NIBRG-26）：由上海生物制品研究所贈予。

H7N9 全病毒滅活疫苗及佐劑：由上海生物制品研究所提供。

MDCK細(xì)胞：本實驗室保存。

1.2 佐劑PS-R848的合成

脂質(zhì)體中含有二棕櫚磷脂酰膽堿（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、二棕櫚磷脂酰甘油（dipalmitoyl phosphatidylglycerol，DPPG）、二棕櫚磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（dipalmitoyl ethanolamine polyethylene glycol，DPPE-PEG）和膽固醇（cholesterol，Chol），其比例為m（DPPC）∶m（DPPG）∶m（DPPE-PEG）∶m（Chol）=10∶1∶1∶1，均購自MeloPEG 公司。準(zhǔn)確稱取20 mg DPPC，等比例稱取DPPG、DPPE-PEG 和Chol 試劑，將以上試劑溶于3 mL 的三氯甲烷中。并用PBS 配置1 mg/mL 的R848 溶液（R848 購自 Invivogen 公司）。利用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，將以上溶有磷脂的三氯甲烷置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上的50 mL蒸餾瓶中，50℃條件下以220 r/min 旋轉(zhuǎn)，溫和地去除有機(jī)溶劑。待蒸餾瓶壁上呈現(xiàn)凝膠狀薄膜時，加入1 mL 溶有1 mg R848 佐劑的緩沖液或1 mL 不含R848 佐劑的緩沖液，50℃條件下以220 r/min 旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行水化，獲得水性混懸液，再經(jīng)0.45 μm 聚碳酸酯膜擠壓塑形，獲得裝載R848 的PS 脂質(zhì)體（PS-R848）與空白PS 脂質(zhì)體，脂質(zhì)體懸液再在4℃條件下以10 000g離心90 min，將未包裹的佐劑與脂質(zhì)體分離，上清存于-4℃，脂質(zhì)體加定量緩沖液后，再加入5%的海藻糖凍干存于-80℃。用馬爾文Nano ZS90 動態(tài)光散射粒徑電位儀檢測粒徑及Zeta電位，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測脂質(zhì)體。

1.3 小鼠免疫、病毒感染及取樣

采用滴鼻免疫途徑對小鼠做單次黏膜免疫。試驗選取6～8 周齡的 BALB/c 小鼠為動物模型，隨機(jī)將60 只小鼠分為 5 組，每組12 只，分別設(shè)置為陰性對照組（僅滴鼻免疫20 μL PBS）、單獨(dú)疫苗組（0.5 μg疫苗）、疫苗+佐劑poly（I∶C）組、疫苗+R848組（0.5 μg 疫苗+10 μg R848）以及疫苗+PS-R848 組（0.5 μg 疫苗+10 μg PS-R848）。其中，每只小鼠的疫苗用量為0.5 μg（以流感疫苗所含 HA 的計量為準(zhǔn)），R848 為10 μg（PS-R848 中以R848 的含量為準(zhǔn)）。疫苗+佐劑的配制過程：將滅活疫苗稀釋到0.05 mg/mL，佐劑稀釋到1 mg/mL，將疫苗與各佐劑或PBS 按體積1∶1 的比例混合后，在冰箱中使用圓盤旋轉(zhuǎn)混勻儀混勻2 h，之后，按每只小鼠20 μL進(jìn)行滴鼻免疫。單次免疫后3 周，從小鼠下頷靜脈取血，用于抗體檢測；而后將小鼠麻醉，通過滴鼻的方式用致死劑量（20 LD50）鼠適應(yīng)型NIBRG-267（H7N9）病毒感染小鼠，觀察感染后小鼠的體征、體重變化和存活率。病毒感染3 d 后，每組取3 只小鼠用氯仿麻醉，取小鼠肺臟于 1.5 mL 病毒稀釋液中勻漿，8 000 r/min 離心 20 min，取上清，分裝后于-80℃保存，用于肺部病毒的滴度測定。

1.4 抗體檢測

用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定疫苗特異性BALF-sIgA 和IgG 抗體及其亞類 IgG1 和 IgG2a 的抗體效價。首先，用含10 μg/mL NIBRG-267（H7N9）的滅活疫苗包被96 孔酶標(biāo)板，37℃溫育 2 h 后加入封閉液［含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS］37℃溫育 2 h；然后，將待測樣本作 2 倍系列稀釋后加入酶標(biāo)板中，37℃溫育 2 h；加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgA、IgG、IgG1 或IgG2a 二抗（Southern Biotechnology Associates，Inc.，USA），37℃溫育 1 h；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白（Southern Biotechnology Associates，Inc.，USA），37℃溫育 1 h；最后，加入含有底物 pNPP（Southern Biotechnology Associates，Inc.，USA）的顯色液，37℃培養(yǎng)箱溫育30 min。用酶標(biāo)儀（GENios，TECAN）測定波長為405/450 nm的光密度（optical density，OD）值，與對照組的平均值＋2×標(biāo)準(zhǔn)差（+2s）進(jìn)行比較，確定抗體IgA、IgG、IgG1 和IgG2a的最高稀釋度。

1.5 細(xì)胞因子檢測

用ELISA 方法測定免疫后小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞因子 IFN-γ、IL-2、IL-4 和 IL-5 的分泌量。單次免疫后3 周，每組隨機(jī)選3 只小鼠取脾臟，無菌條件下分離淋巴細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)后加入24 孔板中37℃培養(yǎng)4 h，再加入5 μg/mL 流感病毒 H7N9 滅活疫苗刺激細(xì)胞，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。而后，將培養(yǎng)液以1 500 r/min離心5 min，取上清。

按照細(xì)胞因子 ELISA 試劑盒（達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）說明書的方法操作，讀取450 nm 處OD值后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定細(xì)胞因子的含量。每組小鼠的細(xì)胞因子的含量用樣本的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.6 肺部病毒滴度檢測

采用噬斑分析法測定小鼠肺部的殘余病毒滴度。將小鼠肺勻漿液用病毒釋稀液按 10 倍梯度稀釋后，分別接種于長有MDCK 細(xì)胞（細(xì)胞占孔面積的80%左右）的 96 孔板中，37℃培養(yǎng)48 h；觀察MDCK細(xì)胞的病變效應(yīng)。每個樣本的病毒滴度用Reed-Muench方法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）。每組小鼠的病毒滴度值用每毫升樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.7 統(tǒng)計與分析

使用GraphPad Prism 中one-way ANOVA 方法對抗體滴度、細(xì)胞因子含量、小鼠肺部病毒殘余量以及小鼠體重丟失率等進(jìn)行分析；用long-rank test 分析小鼠的存活率，當(dāng)P值小于0.05 時，則認(rèn)為在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)體的表征

為了評價制備的脂質(zhì)體的質(zhì)量，用馬爾文Nano ZS90 動態(tài)光散射粒徑電位儀檢測粒徑及Zeta 電位檢測本試驗中所制備的脂質(zhì)體，結(jié)果如圖1 所示。PS 脂質(zhì)體的粒徑為（353.9±88.4）nm，聚集度指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.024，Intercept 為0.927，Zeta 電位為-18.3 mV。PS-R848 脂質(zhì)體的粒徑為（392.7±127.3）nm，PDI 為0.137，Intercept 為0.920，Zeta電位為-12.0 mV。

圖1 空白仿生PS脂質(zhì)體與PS-R848 脂質(zhì)體粒徑與電位分布Fig.1 Particle size and potential distribution of uncoated bionic PS liposomes and PS-R848 liposomes

TEM 電鏡觀察得到的PS-R848 脂質(zhì)體為球形，分散系數(shù)良好，無聚集；利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）280 nm 波長檢測PS-R848 脂質(zhì)體，代入EN/%=（1-Cf/Ct）×100% 公式中，計算得出PS-R848 的包封率（EN）為76.3%（圖2）。Cf為脂質(zhì)體懸液離心后上清中R848含量，Ct為懸液中R848的總量。

圖2 PS-R848脂質(zhì)體的TEM電鏡圖與HPLC測定未包封R848峰面積Fig.2 TEM electron microscopy of PS-R848 liposomes and HPLC determination of unencapsulate R848 peak area

2.2 抗原特異性sIgA抗體滴度

為了評價PS-R848 做黏膜佐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生sIgA的免疫應(yīng)答，將H7N9 流感全病毒滅活疫苗與佐劑混合后經(jīng)滴鼻共免疫小鼠1 次，3 周后取小鼠肺洗液，用ELISA 方法檢測抗流感病毒的特異性sIgA抗體滴度。從圖3 可知，疫苗+poly（I∶C）試驗組以及疫苗+R848 試驗組較單獨(dú)疫苗組誘導(dǎo)的sIgA含量都顯著提高，分別提高了4 倍與3 倍。疫苗+PS-R848 佐劑組的小鼠產(chǎn)生的sIgA 含量較疫苗+R848 組提高了4 倍，且其與單獨(dú)疫苗組以及疫苗+poly（I∶C）組比較分別提高了12倍與3 倍以上，均具有顯著性差異。

圖3 免疫3周后誘導(dǎo)的小鼠支氣管肺泡灌洗液 IgA含量Fig.3 BALF IgA titers of mice 3 weeks after immunization

2.3 免疫后小鼠血清中抗原特異性IgG 及其亞型IgG1、IgG2a效價

為評價PS-R848 做黏膜佐劑經(jīng)滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的血清抗體滴度，在小鼠免疫1 次后3 周，從每組隨機(jī)取3 只小鼠取血，用ELISA 方法分別檢測血清中的疫苗特異性IgG 抗體和IgG1、IgG2a 的亞類抗體，抗體結(jié)果如圖4所示。ELISA 結(jié)果顯示，與未免疫的對照組相比，所有免疫組小鼠體內(nèi)均誘導(dǎo)產(chǎn)生了疫苗特異性的IgG 抗體（圖4a），與無佐劑疫苗組相比，疫苗中添加了佐劑的免疫組小鼠 IgG 抗體滴度均有顯著提升（P ＜0.05）。其中，疫苗+poly（I∶C）組以及疫苗+R848 組較單獨(dú)疫苗組誘導(dǎo)的IgG 含量分別提高了40 倍與20 倍，疫苗+PS-R848 組分別與單獨(dú)疫苗組、疫苗+poly（I∶C）與疫苗+R848 比較，依次提高了512 倍、12 倍、25 倍，均具有顯著性增加。疫苗+poly（I∶C）組與單獨(dú)疫苗組IgG1與IgG2a含量均提高了20 倍與25 倍，疫苗+R848 組較單獨(dú)疫苗組誘導(dǎo)的IgG2a 含量具有顯著性差異，提高了12 倍以上。疫苗+PS-R848 組誘導(dǎo)的IgG1 與IgG2a較單獨(dú)疫苗組與疫苗+R848 組均具有顯著性差異（圖4b～4c），分別提高了40 倍與203 倍。此外，Ig-G2a/IgG1 偏向表明，單獨(dú)疫苗組偏向體液免疫，疫苗+PS-R848 組的IgG1 和IgG2a 均有增加，但I(xiàn)gG2a/IgG1的結(jié)果表明，免疫反應(yīng)偏向于Th1 型。

圖4 免疫3周后誘導(dǎo)的小鼠血清IgG抗體及其分型抗體效價Fig.4 IgG、IgG1 and IgG2a antibody titers in sera of mice 3 weeks after immunization

圖5 免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞受刺激后上清中細(xì)胞因子分泌量Fig.5 Secretion of cytokines in splenic lymphocytes of mice 3 weeks after immunization

2.4 免疫小鼠后檢測脾淋巴細(xì)胞刺激后細(xì)胞因子分泌量

為了檢測PS-R848 脂質(zhì)體做黏膜佐劑誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)，小鼠經(jīng)滴鼻免疫1 次后3 周，每組取3 只小鼠，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后用H7N9 滅活疫苗刺激，收集培養(yǎng)液，用 ELISA試劑盒分別檢測其中含有的 IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5 4 種細(xì)胞因子的分泌量。結(jié)果如圖 5 所示，單獨(dú)疫苗組小鼠的4 種細(xì)胞因子分泌量都很低，疫苗+poly（I∶C）較單獨(dú)疫苗組誘導(dǎo)的INF-γ、IL-2、IL-4含量均顯著性增加，這表明其誘導(dǎo)了細(xì)胞與體液混合免疫應(yīng)答。而疫苗+R848 較單獨(dú)疫苗組INF-γ、IL-2 含量顯著增加，但I(xiàn)L-4、IL-5 含量較單獨(dú)疫苗組無顯著性差異，這表明其誘導(dǎo)偏向細(xì)胞免疫應(yīng)答。疫苗+PS-R848 組較疫苗+R848 組與疫苗+poly（I∶C）組，均具有顯著性差異。

2.5 經(jīng)鼻腔免疫的小鼠攻毒后的保護(hù)效應(yīng)

為評價 PS-R848 佐劑黏膜免疫小鼠后對流感病毒感染提供的保護(hù)效果的影響，我們將各組6 只小鼠，經(jīng)滴鼻免疫1 次，在免疫3 周后用致死劑量（20 LD50）的H7N9 同源病毒進(jìn)行攻擊。在攻毒后21 d 內(nèi)觀察并記錄小鼠的狀態(tài)、體重變化及存活情況和病毒感染后小鼠肺部病毒滴度。結(jié)果表明：疫苗+PS-R848組小鼠全部存活（圖6a），存活率與各組疫苗免疫后的小組相比，均有顯著性差異；病毒攻擊后小鼠的體重丟失曲線波動更?。▓D6b），且最大體重丟失率較單獨(dú)疫苗組與疫苗+R848 組顯著降低。圖7 所示的小鼠肺部病毒滴度結(jié)果表明，疫苗+R848 組與疫苗+poly（I∶C）組較對照組均顯著降低，疫苗+PS-R848組較其他組顯著降低。

圖6 小鼠免疫后致死量流感病毒攻擊后存活率與體重丟失率Fig.6 Survival rate and body weight change of mice within 21 days after lethal-dose challenge

圖7 免疫后攻毒小鼠肺部病毒滴度Fig.7 Lung virus titer of mice against lethal virus challenge

3 討論

每年規(guī)律性的接種疫苗，是應(yīng)對當(dāng)前流感病毒流行最有效的策略。但由于流感病毒高度易變，以及可能出現(xiàn)的原始抗原過失（original antigenic sin，OAS）現(xiàn)象，現(xiàn)有疫苗的免疫效力并不一定能有效地抵御流行株的感染，故需要尋找合適的佐劑去增強(qiáng)疫苗的免疫應(yīng)答、改善免疫偏向或誘導(dǎo)交叉保護(hù)作用。由于流感病毒是呼吸道病毒，經(jīng)黏膜免疫誘導(dǎo)的sIgA 產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，對于阻止流感病毒的感染有非常重要的意義。由于黏膜對外來物質(zhì)的清除效應(yīng)以及疫苗遞送到黏膜表面后引起的免疫反應(yīng)較弱的原因，需要有效的黏膜免疫佐劑或遞送系統(tǒng)，促使抗原釋放延長來改善免疫效應(yīng)。R848作為流感疫苗佐劑，可顯著增加疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在24 h 內(nèi)，R848 可顯著增加淋巴結(jié)中細(xì)胞數(shù)量，以及早期B 細(xì)胞的激活，減少病毒感染后肺部損傷［10-11］。此外，Holbrook 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，R848經(jīng)鼻內(nèi)或皮內(nèi)免疫均可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）亞群的局部轉(zhuǎn)移，引流淋巴結(jié)CD11b+DC增加，CD103+DC減少，偏向于Th1 型極化。Clemens等［13］將甲型流感疫苗與R848 混合后對幼年非洲綠猴免疫，引發(fā)了針對高度保守的HA 莖部抗體應(yīng)答，并在病毒攻擊后促進(jìn)病毒中和特異性抗體的快速誘導(dǎo)，證明其能在幼兒這一高危人群中增強(qiáng)對異源流感病毒的抗體應(yīng)答能力。此后一年，Crofts 等［14］的新研究采用老年非洲綠猴（African green monkeys，AGM）模型對R848 作為IPR8 佐劑的效果進(jìn)行評估，觀察到接種IPR8-R848 而非單獨(dú)接種IPR8 的AGM，初次接種后10 d 病毒特異性IgM 抗體水平升高。此外，在IPR8-R848 疫苗接種動物中病毒特異性IgG 顯著增加。因此，R848 作為佐劑能有效擴(kuò)寬流感疫苗的適齡人群。

R848 作為TLR7/8 激動劑，具有誘導(dǎo)過度免疫的危險，替代措施一般為采用脂質(zhì)體或其他納米顆粒對其進(jìn)行包埋或吸附［15］，將其保持在給藥或靶向部位，改善其藥代動力學(xué)［16］。而Dowling 等［17］在其多項研究中進(jìn)一步證明其可行性。

肺表面活性物質(zhì)覆蓋在整個呼吸道與肺表面，作為抵御細(xì)菌、病毒等有害物的屏障。有研究表明，在食蟹獼猴上利用肺表面活性劑制備的脂質(zhì)體，通過鼻腔遞送裂解流感疫苗，相對單獨(dú)疫苗，更有效誘導(dǎo)了試驗動物的sIgA 和IgG 的分泌量，更明顯地表現(xiàn)出對異源病毒的交叉保護(hù)作用［18］。

在本研究中，我們利用小鼠模型探討了仿生PS包裹R848 做黏膜佐劑，經(jīng)滴鼻免疫流感H7N9 全病毒滅活疫苗的免疫增強(qiáng)效果。滴鼻免疫一次后，用致死劑量（20 LD50）的同源病毒進(jìn)行攻擊。攻毒后通過檢測小鼠的存活率、體重變化和肺部病毒滴度來評判黏膜免疫效果。試驗結(jié)果表明，PS-R848作為疫苗佐劑能夠100%保護(hù)小鼠抵抗病毒的攻擊，小鼠的體重丟失率與R848與H7N9流感病毒滅活疫苗混合后免疫的相比，由16.71%降低到了9.95%，且肺部病毒滴度最低。由此可見，R848仿生PS脂質(zhì)體增強(qiáng)了H7N9流感病毒滅活疫苗的黏膜免疫效應(yīng)。

ELISA檢測的系統(tǒng)性血清抗體IgG、IgG1、IgG2a效價與細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 與未包裹的R848 佐劑組相比均顯著增加，支氣管肺泡灌洗液中的分泌型IgA 含量也顯著提高，這表明，PS 脂質(zhì)體對R848 的遞送既增強(qiáng)了系統(tǒng)免疫應(yīng)答，也增強(qiáng)了肺局部的免疫應(yīng)答。IgG2a/IgG1 的比值能在一定程度上判斷細(xì)胞免疫與體液免疫的平衡，其比值越高，越偏向Th1 型免疫［19］。本試驗中疫苗+PS-R848 組與疫苗+R848組比較，細(xì)胞因子IFN-γ與IL-2含量有顯著提高，且兩組IgG2a/IgG1 比值無顯著性差異，這表明，PS 脂質(zhì)體的遞送并沒有明顯的改變R848 的免疫偏向，且能提高其引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。這均表明，PS-R848脂質(zhì)體作為H7N9流感病毒滅活疫苗黏膜佐劑，是值得進(jìn)一步的研究與優(yōu)化的。