非洲豬瘟病毒B646L和F778R雙基因PCR 檢測方法的構(gòu)建

王 慧，鐘菊花，楊 俊，杜麗飛，王紅兵，劉俊琦，2*

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、出血性、高傳染性、高致死性的疾病，該病主要發(fā)生在家豬和野豬中，致死率高達100%［1-2］。ASFV 是非洲豬瘟病毒科非洲病毒屬的唯一成員，也是目前唯一已知的雙鏈DNA 蟲媒病毒，其基因組大小約190 kb，可編碼170 多種蛋白［1］。其中編碼的大多數(shù)蛋白功能尚不明確，限制了ASFV 致病機理的研究以及疫苗的研制［3］。ASFV 基因組中的B646L基因主要編碼衣殼蛋白p72。p72 蛋白不僅是ASFV 病毒粒子的主要組成成分，也是ASFV 檢測中常用的靶標(biāo)之一。基于B646L基因的3′端可變核苷酸序列進行分類，ASFV 在全世界至少有24種基因型［4-6］。

ASF 于1921 年首次在肯尼亞發(fā)現(xiàn)，起初只是非洲撒哈拉以南的一種地區(qū)性疾病，后來十年時間內(nèi)便成為了嚴(yán)重威脅全世界豬業(yè)發(fā)展的一種豬傳染性疾病，其中對歐洲和亞洲影響最大［7-8］。2018 年，中國首次發(fā)現(xiàn)ASFV［9］，隨后蔓延開來，出現(xiàn)各種傳播速度快且自然變異能力強的ASFV 毒株，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失［10-12］。

ASFV 病毒粒子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同的毒株毒力、傳播力不同，且不同毒株之間交叉保護力弱［13］，各豬場根據(jù)實際情況制定的監(jiān)控、防護措施及定點清除的方法大不相同，毒株的早期發(fā)現(xiàn)和清除較為困難。ASF 的早期預(yù)防、發(fā)現(xiàn)、診斷以及毒株分型對于防控具有至關(guān)重要的作用［11］。國內(nèi)尚無同時檢測ASFVB646L和F778R基因的雙基因PCR 檢測方法，且同時檢測多基因可增強該方法的特異性，因此，本研究以ASFVB646L基因和F778R基因為檢測靶點，建立雙基因普通PCR 檢測方法，為檢測ASFV提供一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株和質(zhì)粒

ASFV、豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus 2，PCV2）、偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）、豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemic diarrhea virus，PEDV）及豬傳染性胃腸炎病毒（swine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）核酸由湖南省畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)獸藥實驗室保存。B646L質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和F778R質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由北京擎科生物科技股份有限公司提供，質(zhì)粒質(zhì)量濃度皆為200 ng/μL。拷貝數(shù)分別為7.2×1010copies/μL、1.5×1011copies/μL?？截悢?shù)計算公式：拷貝數(shù)（copies/μL）=［質(zhì)粒質(zhì)量濃度/（ng/μL）×10-9］×（6.02×1023）÷（堿基數(shù)×660）。

1.1.2 主要試劑與儀器

病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒購自湖南大圣寵生物科技有限公司；Pfu DNA 聚合酶購自杭州博奧爾科技有限公司；普通PCR 儀購自德國eppendorf生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 中已登錄的B646L和F778L基因序列，在NCBI 上選擇來源于20 條（各10 條）非洲豬瘟毒株的B646L和F778L基因全長序列，通過MegAlign 軟件篩選基因的保守區(qū)域，并使用NCBI網(wǎng)站的Primer designing tool 各自設(shè)計兩對特異性引物（表1）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 PCR反應(yīng)程序與反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.2.1.1 普通PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序

PCR 反應(yīng)體系：Pfu 酶0.5 μL、10×Reaction Buffer 2.5 μL、2.5 mmol dNTP Mixture 2.0 μL、兩對10 μmol/L 上下游引物（B646L上、下游引物，F(xiàn)778R上、下游引物）各1.0 μL、DNA 模板1.0 μL、ddH2O 15.0 μL。

PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s、退火溫度為56℃、退火15 s、72℃延伸，30 個循環(huán)。

擴增完成后，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶的位置與明亮度。

1.2.1.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

對反應(yīng)體系組分中dNTP 及反應(yīng)程序中退火溫度依次進行優(yōu)化，得到最優(yōu)引物比和組分比。設(shè)置dNTP 分別加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL；退火溫度分別為55、56、57、58、59、60、61、62℃。通過優(yōu)化篩選出最適合的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，建立普通PCR 檢測方法，對獲得的PCR 擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 特異性試驗

分別以PCV2、PRV、PEDV 及TGEV 核酸為模板，同時以ASFV兩種陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，以ddH2O 為陰性對照，按照1.2.1 優(yōu)化的反應(yīng)條件對本方法進行特異性檢測，觀察能否擴增出條帶，以驗證其特異性。

1.2.3 敏感性試驗

通過十倍比稀釋，以不同濃度的兩種ASFV 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為擴增模板，以本方法建立的雙基因普通PCR 方法進行檢測，確定本方法的最小可檢測質(zhì)量濃度。

1.2.4 重復(fù)性及臨床驗證試驗

以最低檢測限度的ASFV 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行重復(fù)試驗，對實驗室保存的ASFV 陽性核酸樣本進行臨床驗證應(yīng)用，按優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行，根據(jù)得到的結(jié)果進行分析，以驗證該方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化

以ASFV 兩種B646L和F778R質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用兩對引物進行PCR 擴增和核酸電泳，結(jié)果擴增出兩條分別為約1 272 bp 和672 bp 的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1、2）。

圖1 ASFV多重PCR檢測方法引物的驗證Fig.1 Verification of primers for ASFV multiplex PCR detection method

圖2 ASFV多重PCR檢測方法引物的驗證Fig.2 Verification of primers for ASFV multiplex PCR detection method

經(jīng)過反應(yīng)體系優(yōu)化，最終確認(rèn)反應(yīng)體系為：Pfu 酶0.2 μL、10×Reaction Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL、B646L上游和下游引物各1.5 μL、F778R上游和下游引物各0.5 μL、DNA 模板1.0 μL、ddH2O14.8 μL（圖3、4）。

圖3 ASFV多重PCR檢測方法dNTP的優(yōu)化Fig.3 Optimization of dNTP for ASFV multiplex PCR detection

圖4 ASFV多重PCR檢測方法引物比例的優(yōu)化Fig.4 Optimization of primer ratio for ASFV multiplex PCR detection method

PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性1.5 min，95℃變性30 s、退火溫度為57℃、退火30 s、72℃延伸2.5 min，30 個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶（圖5）。

圖5 ASFV多重PCR檢測方法退火溫度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of annealing temperature for ASFV multiplex PCR detection method

2.2 特異性試驗

利用已建立的雙PCR 方法，以PCV2、PRV、PEDV、TGEV 核酸為模板進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法對ASFV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行了特異性擴增，無其他病原核酸擴增的情況，顯示建立的方法具有較強的特異性。

2.3 敏感性試驗

將B646L、F778R陽性質(zhì)粒進行10 倍倍比稀釋后作為擴增模板，以建立的雙重普通PCR 方法和單一普通PCR 方法進行檢測。結(jié)果顯示，該方法對B646L及F778R兩種ASFV 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限分別為7.2×107copies/μL、1.5×106copies/μL（圖6）。

圖6 ASFV多重PCR檢測方法敏感性檢測限度Fig.6 Sensitivity limits of ASFV multiplex PCR assay

2.4 重復(fù)性試驗

以最低檢測限度的ASFV 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及實驗室保存的ASFV 陽性核酸樣本進行重復(fù)試驗，結(jié)果顯示，該方法重復(fù)性良好（圖7）。

圖7 重復(fù)性及臨床驗證應(yīng)用Fig.7 Reproducibility and clinically validated application

3 討論

多重PCR 是在普通單一PCR 反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，即在1次PCR反應(yīng)體系中加入2對或2對以上引物，以做到1 次擴增檢測同一病原多種基因或多種病原。多重PCR 和單一PCR 的原理相同，但多重PCR的反應(yīng)體系需要多次反復(fù)進行試驗摸索，同時多對引物之間不可避免會出現(xiàn)競爭和互相干擾，且多對引物的退火溫度不同，對多重PCR 反應(yīng)體系的特異性和敏感性影響較大。這就要求引物要高度特異，退火溫度盡量相近，才能夠保證擴增到最大程度。

多重PCR 技術(shù)是將多個基因或序列在同一反應(yīng)系統(tǒng)中同時檢測，檢測敏感性和特異性高，減少了假陰性和假陽性結(jié)果的發(fā)生，且縮短了試驗的操作時間，增加了試驗的效率，節(jié)省了反應(yīng)試劑、樣品和實驗室時間的成本。

非洲豬瘟病毒基因組中主要編碼衣殼蛋白p72的是B646L基因。p72 蛋白是ASFV 病毒粒子的主要組成成分，同時也常常用來作為ASFV 檢測中的靶標(biāo)之一。任名等［14］和吳亞楠等［15］均建立了基于B646L基因的TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法。蘇金輝等［11］建立了基于針對B646L、F778R和I177L基因的三重?zé)晒舛縋CR 鑒別檢測方法。本研究針對的B646L和F778R兩個基因的序列均保守，與Georgia 2008/1株、AQS-P-201202 DNA株、SY-2株等相關(guān)基因序列的相似度達100%，具有良好的通用性。在此基礎(chǔ)上，本研究針對B646L、F778R兩個基因重新設(shè)計引物，確立了非洲豬瘟B646L、F778R雙基因普通PCR的檢測方法。

從試驗結(jié)果看，本試驗建立的該種普通PCR方法特異性、重復(fù)性較好，所建立的方法對ASFV陽性質(zhì)粒B646L、F778R標(biāo)準(zhǔn)品的最低限度分別為7.2×107copies/μL、1.5×106copies/μL。相比于于新友等［16］建立的非洲豬瘟雙重?zé)晒釶CR檢測方法最低檢測限度（9.5 copies/μL）及蔡曉麗等［17］非洲豬瘟病毒p72 和CD2v 雙基因?qū)崟r熒光定量PCR 檢測方法的建立及初步應(yīng)用的最低檢測限度（7.3 copies/μL～24.5 copies/μL），以及蘇金輝等［11］建立的基于針對B646L、F778R和I177L基因的三重?zé)晒舛縋CR 鑒別檢測方法里B646L和F778R陽性質(zhì)粒的最低檢測下限（分別為1、10 copies/ μL）來說，本試驗建立的普通PCR 方法的敏感性要差一些。這說明普通PCR 的敏感性還是不及熒光定量PCR的敏感性好。

在試驗過程中，試驗操作技術(shù)、樣品或試驗材料制備、基因變異等因素可能會造成病毒交叉反應(yīng)、PCR 儀器污染或試劑污染，導(dǎo)致檢測結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性或假陰性。如要避免假陽性的發(fā)生，就需要加強實驗室實驗人員技術(shù)操作的規(guī)范性以及對實驗室器材樣品等的質(zhì)量控制。檢測環(huán)境中易產(chǎn)生氣溶膠污染，也經(jīng)?？赡艹霈F(xiàn)假陽性的情況。氣溶膠等樣品中DNA 含量極低，屬于無法進行DNA 測定的低劑量環(huán)境污染樣本，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果［18］。樣本采集或處理不當(dāng)也會導(dǎo)致樣本中可能存在干擾物質(zhì)或被污染，導(dǎo)致PCR 產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。也可能是檢測條件設(shè)置不當(dāng)，導(dǎo)致PCR 結(jié)果偏高，產(chǎn)生假陽性；或者是PCR 試劑質(zhì)量問題，如PCR 試劑可能受到氧化、污染或保存不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊懀瑢?dǎo)致PCR反應(yīng)失調(diào)，也有出現(xiàn)假陰性的情況。其他可能出現(xiàn)假陰性的情況如下：1）ASFV 血清學(xué)類型不符。由于PCR 檢測是基于ASFV 特定基因的DNA 序列擴增，所以如果ASFV血清學(xué)類型與PCR引物不相符，就會導(dǎo)致假陰性。2）樣品處理不當(dāng)。樣品提取和制備過程中，如果操作不規(guī)范或出現(xiàn)污染等問題，就會影響PCR 檢測結(jié)果。3）ASFV 數(shù)量過少。ASFV的含量過低也會導(dǎo)致PCR檢測結(jié)果為假陰性。這通常是由于感染的早期或治療后ASFV 數(shù)量低于檢測限度所致。4）非洲豬瘟樣品的反復(fù)凍融、保存不當(dāng)會導(dǎo)致樣品降解失效。5）核酸免抽提會導(dǎo)致核酸從蛋白質(zhì)及鹽等物質(zhì)中沒有完全的分離出來，不可避免地會使檢測結(jié)果有所偏差，甚至出現(xiàn)假陰性［19］。

試驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性有以下四種解決辦法：1）注意樣本采集。確保樣本的純度和完整性，避免干擾物質(zhì)的影響。2）對PCR 反應(yīng)條件進行優(yōu)化。使用恰當(dāng)?shù)囊铮{(diào)整合適的溫度，適當(dāng)改變PCR反應(yīng)條件，確保PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性。3）檢查PCR試劑質(zhì)量。檢查PCR 試劑是否存在問題，如有問題及時更換。4）建立質(zhì)控體系。建立ASF PCR 檢測的質(zhì)控體系，定期檢查PCR 反應(yīng)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。試驗結(jié)果出現(xiàn)假陰性有以下三種解決辦法：1）選擇正確的PCR 引物。根據(jù)ASFV 的流行病學(xué)特點和病原體基因序列特征，合理選擇PCR 引物，以提高檢測敏感性和特異性。2）優(yōu)化樣品處理步驟。嚴(yán)格按照操作規(guī)程，避免樣品污染，并對樣品進行充分制備和提取，以確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確。3）增加樣品量或改變PCR 反應(yīng)條件。如果ASFV 數(shù)量較少，可以增加樣品量或改變PCR 反應(yīng)條件，例如，增加反應(yīng)時間、溫度、循環(huán)次數(shù)等，以提高檢測效率?？傊?，為了準(zhǔn)確診斷ASF，必須采用合適的方法、設(shè)置正確的反應(yīng)條件、注意質(zhì)控和確保樣本純度等措施。