一株褐家鼠戊型肝炎病毒的發(fā)現(xiàn)鑒定及系統(tǒng)發(fā)生分析

宗利東，殷紅敏，楊 銀，趙維玉，徐粉慧，韓培鈺，崔鳳靈，何明仙，張?jiān)浦?

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省高校人獸共患病跨境防控與檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理 671000；2.大理州第二人民醫(yī)院，大理 671000）

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）屬于肝炎病毒科（Hepeviridae），引起的病毒性肝炎稱為戊型肝炎。該病是一種主要經(jīng)糞-口傳播、也可通過(guò)血液和母嬰傳播、以家畜或野生動(dòng)物為宿主的人獸共患?。?］。戊型肝炎病毒感染在臨床上常常引起患者發(fā)熱，普通人群致死率約為1%，孕婦及嬰幼兒致死率高達(dá)15%～25%［2-4］。HEV 每年造成約2 000 萬(wàn)人感染，2015 年造成全球約4.4 萬(wàn)人死亡［5］。2022 年，國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將戊型肝炎病毒科分為正戊型肝炎病毒（Orthohepevirinae，OHEV）和副戊型肝炎病毒（Parahepevirinae，PHEV）2 個(gè)亞科，其中，OHEV 含4 屬9 種，PHEV 含1 屬1 種［6］。OHEV 感染哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類，PHEV 感染魚(yú)類［7］。OHEV 的4 個(gè)屬分別為：1）靈長(zhǎng)偶蹄樹(shù)鼩兔形目戊型肝炎病毒屬（Paslahepevirus，PASLHEV）（2 種），感染靈長(zhǎng)目（Primates）、偶蹄目（Artiodactyla）、樹(shù)鼩目（Scandentia）和兔形目（Lagomorpha）動(dòng)物，其中，巴拉揚(yáng)尼種（Paslahepevirus balayani）可分8個(gè)基因型（HEV-1～HEV-8），主要感染人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、單峰駱（Camelus dromedarius）和雙峰駝（Camelus bactrianus）；2）嚙齒食肉目戊型肝炎病毒屬（Rocahepevirus，RCHEV）（2 種），感染嚙齒目（Rodentia）和食肉目（Carnivora）動(dòng)物，其中，家鼠種（Rocahepevirus ratti）分為HEV-C1［感染家鼠屬（Rattus）和臭鼩鼱（Suncus murinus）］、HEV-C2［感染雪貂（Mustela putorius）］和HEV-C3［感染田鼠（Apodemus）］3 個(gè)基因型；3）翼手目戊型肝炎病毒屬（Chirohepevirus，CHHEV）（3 種），感染翼手目（Chiroptera）動(dòng)物；4）禽類戊型肝炎病毒屬（Avihepevirus）（2種），感染禽類（Avian）。

HEV基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約為7.2 kb，通常包含3 個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。ORF1 的長(zhǎng)度約占整個(gè)基因組的2/3，編碼與復(fù)制相關(guān)的多聚蛋白。蛋白由1 693 個(gè)氨基酸組成，含7 個(gè)功能域，包括甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，Met）、Y 結(jié)構(gòu)域、木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine protease，PLP）、高變區(qū)（hypervarible，HVR)、X 結(jié)構(gòu)域、RNA 解旋酶（RNA helicase，Hel）和RNA 依賴的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA ploymerase，RdRp）［8-10］。ORF2 編碼長(zhǎng)度為660 個(gè)氨基酸的核衣殼蛋白，含有重要的抗原決定簇［11-12］。ORF3 與ORF2 約有300 個(gè)堿基的重疊，編碼一個(gè)長(zhǎng)度約123 個(gè)氨基酸的小磷蛋白，參與HEV顆粒從感染細(xì)胞中的釋放，可能與病毒粒子的形態(tài)形成有關(guān)［13］。在HEV-1 和嚙齒動(dòng)物攜帶的HEV 的C1～C3 中還發(fā)現(xiàn)了存在于ORF1 中的ORF4。ORF4的編碼蛋白被認(rèn)為可以增強(qiáng) RdRp 的活性。2021 年的一項(xiàng)研究表明，ORF4 可以促進(jìn)HEV-3 在細(xì)胞中的復(fù)制［14-15］。

嚙齒目動(dòng)物種類繁多，且與人類生活關(guān)系密切，是HEV-C1 的主要宿主。本研究對(duì)云南省大理市褐家鼠（Rattus norvegicus）攜帶的HEV 開(kāi)展了篩查，在采集的樣本中檢測(cè)到HEV-C1型毒株，并完成1 株DL147 病毒全基因組序列的鑒定?；蚪M比較和系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，DL147 與香港1 例肝炎患者血清中檢測(cè)得到的HEV 高度相似，提示要加強(qiáng)此類病毒在褐家鼠中流行的監(jiān)測(cè)［16］。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021 年11 月—2022 年1 月，在大理市鳳儀鎮(zhèn)、銀橋鎮(zhèn)、海東鎮(zhèn)、挖色鎮(zhèn)、大理鎮(zhèn)、上關(guān)鎮(zhèn)、喜洲鎮(zhèn)7個(gè)鎮(zhèn)采用鼠籠法和鼠夾法（夾夜法）捕獲嚙齒動(dòng)物，捕獲后的樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后立即解剖，分別取心、脾、腎、肺、肝、腸各2 份，放于-80℃冰箱中待檢。物種采用形態(tài)學(xué)和分子鑒定2種方法進(jìn)行鑒定［17］。

1.2 核酸的提取

將解剖后的嚙齒動(dòng)物肝組織用無(wú)菌剪取約1 g放入Gene Ready 動(dòng)物PIII 粉碎管（遂真,中國(guó)杭州）中，加入滅菌的700 μL 磷酸緩沖液，再置于Gene Ready U1-timate 生物樣本低溫快速制備離心系統(tǒng)（遂真，中國(guó)杭州）中進(jìn)行研磨，然后取300 μL 的研磨液加入到MagaBio plus 病毒DNA/RNA 純化試劑盒III，放入全自動(dòng)核酸提取儀（博日，中國(guó)杭州）中提取，按照制造商的說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 HEV核酸檢測(cè)

采用巢式RT-PCR 進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，兩輪PCR 反應(yīng)體系均為25 μL。第1輪使用Fastking 一步法RT-PCR 試劑盒（TIANGEN，中國(guó)北京），RNA模板3 μL，反應(yīng)程序：逆轉(zhuǎn)錄42.0℃ 30 min，預(yù)變性94.0℃ 3 min，變性94.0℃ 30 s，退火52.8℃ 30 s，延伸72.0℃ 30 s，循環(huán)35 次，再延伸72.0℃ 5 min，4.0℃保存。第2輪使用Green Taq Mix（Vazyme，中國(guó)南京），第1 輪產(chǎn)物模板1 μL，反應(yīng)程序：預(yù)變性94.0℃ 3 min，變性94.0℃ 30 s，退火50.0℃ 15 s，延伸72.0℃ 15 s，循環(huán)30 次，再延伸72.0℃ 5 min，10.0℃保存。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。將通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定出的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向序列測(cè)定。若測(cè)序結(jié)果為重疊峰，則將PCR產(chǎn)物純化回收（OMEGA Bio-tek，美國(guó)諾克羅斯）、T-1克隆（全式金，中國(guó)北京），再送陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primer information

1.4 高通量測(cè)序與HEV全基因組的擴(kuò)增

用檢測(cè)引物擴(kuò)增獲得DL147 號(hào)樣品基因大小為340 bp。為了進(jìn)一步獲得更長(zhǎng)的片段，用引物HEVDL147-F1、HEVDL147-R1、HEVDL147-R2（表1）共擴(kuò)增得到DL147HEV 的基因片段為1 034 bp，blastn 比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有必要進(jìn)行高通量測(cè)序，再將DL147 核酸樣本送至華大基因，采用MGI RS2000 測(cè)序儀進(jìn)行高通量的測(cè)序，用fastqc 和Trimmomatic 軟件對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除原始數(shù)據(jù)（raw data）中測(cè)序質(zhì)量較差和讀長(zhǎng)較短的讀數(shù)（reads），切除reads 中的接頭序列，獲得清除數(shù)據(jù)（clean data）用于后續(xù)分析。使用DIAMOND 軟件將reads 比對(duì)至預(yù)先建好的HEV 序列數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到clean data 中所含有的HEV reads，使用megahit、soapdenovo 軟件對(duì)篩選后reads 進(jìn)行拼接，得到重疊群（contigs），并對(duì)所獲取contigs 進(jìn)行blastn 比對(duì)，獲取最近參考序列。使用Geneious 軟件進(jìn)行有參contigs 拼接，再以拼接后得到的序列為參考序列，對(duì)clean data 進(jìn)行有參拼接，組裝得到contigs，所得結(jié)果即為高通量測(cè)序分析結(jié)果。利用在線工具IBS 2.0（https://ibs.renlab.org/#/server）對(duì)基因結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)行繪制。

1.5 HEV陽(yáng)性樣本基因分型和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從NCBI 的GenBank 中下載HEV 代表株和相似性較高毒株的基因組序列，用MEGA-X 軟件進(jìn)行比對(duì)，選擇最大似然法（maximum likelihood，ML）進(jìn)行超1 000次的bootstrap重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 HEV分歧時(shí)間計(jì)算

利用IQtree 尋找最適模型，以貝葉斯進(jìn)化分析軟件（BEASTv1.10.4）的BEAUti 程序設(shè)置序列的采樣時(shí)間、氨基酸置換模型分子鐘模型、馬爾科夫鏈長(zhǎng)和先驗(yàn)參數(shù)，利用BEAST 程序運(yùn)算，通過(guò)馬爾可夫-蒙特卡洛算法（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）進(jìn)行樹(shù)的重復(fù)抽樣，得到具有最大后驗(yàn)概率的進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)TreeAnnotator 程序設(shè)置Burnin值，以FigTree v1.4.4 軟件對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行修飾和分歧時(shí)間的標(biāo)定，分析病毒序列的演化過(guò)程。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P ＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 嚙齒動(dòng)物的種類與感染率

共捕獲小型哺乳動(dòng)物114 只，涵蓋6 個(gè)屬的7 種動(dòng)物，其中居民區(qū)黃胸鼠（Rattus tanezumi）占64.79%（46/71），褐家鼠（Rattus norvegicus）占35.21%（25/71）；野外耕作地高山姬鼠（Apodemus chevrieri）占83.72%（25/43），大絨鼠（Eothenomys miletus）占6.98%（3/43）；樹(shù)鼩占4.65%（2/43），臭鼩鼱（Suncus murinus）占2.33%（1/43），針毛鼠（Niviventer fulvescens）占2.33%（1/43）。居民區(qū)以黃胸鼠和褐家鼠為優(yōu)勢(shì)種，野外耕作地以高山姬鼠為優(yōu)勢(shì)鼠。檢測(cè)到2 份HEV 陽(yáng)性樣本（DL143 和DL147），宿主動(dòng)物均為褐家鼠，感染率為8.00%（2/25）（表2）。

表2 云南省大理市小型哺乳動(dòng)物物中HEV檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection of HEV in small mammals from Dali City,Yunnan Province,China

2.2 基因組結(jié)構(gòu)與同源性比對(duì)分析

對(duì)D L 1 4 7 號(hào)樣本進(jìn)行了全基因組測(cè)序（OR786722），全長(zhǎng)6 970 bp，其中ORF1長(zhǎng)4 823 bp，編碼1 607 個(gè)氨基酸（amino acid，aa）非結(jié)構(gòu)蛋白，其包含的Met 位于159～704 nt（54～234 aa）、Y 域位于639～1 310 nt（214～436 aa），PLP位于1 311～1 731 nt（438～577 aa），HVR 位于2 0 4 2～2 2 2 7 n t（6 8 2～7 4 2 a a），X 域 位于2 249～2 684 nt（751～894 aa），Hel 位于2 746～3 470 nt（916～1 156 aa），RdRp 位于3 485～4 921 nt（1 163～1 640 aa）；ORF2 長(zhǎng)1 934 bp，編碼長(zhǎng)為644 aa 的結(jié)構(gòu)蛋白；ORF3 長(zhǎng)395 bp，與ORF2 重疊297 bp，編碼長(zhǎng)為118 aa 的結(jié)構(gòu)蛋白；ORF4 全長(zhǎng)551 bp，編碼長(zhǎng)為183 aa 的非結(jié)構(gòu)蛋白。DL147號(hào)全基因組結(jié)構(gòu)模式圖見(jiàn)圖1。

圖1 DL147 全基因組結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 DL147 genome wide structural pattern map

將DL147 號(hào)樣本的全基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的序列進(jìn)行blast 比對(duì)，選出相似度最高的7條序列再進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與香港1 例HEV 患者血清分離株核苷酸同源率為95.21%（MN450853），與其他6 株從鼠類中分離核苷酸的相互之間的同源性為84.10%～93.89%（表3）。

表3 DL147全序列核苷酸同源性比對(duì)Tab.3 DL147 whole-sequence nucleotide homology alignment unit: %

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

DL147 號(hào)全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，DL147 與香港HEV患者血清中分離得到的病毒（MN450853）親源性最高，形成一個(gè)分支，Bootstrap 值為100%；同時(shí)，其與中國(guó)香港其他患者、加拿大患者以及鼠類分離出來(lái)的其他HEV 型親緣關(guān)系較為集中，均為HEV-C1 型，同屬于正戊型肝炎病毒亞科，與OHEV分的其他3個(gè)屬相差較遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 基于DL147 全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the whole genome of DL147

2.4 分歧時(shí)間計(jì)算

HEV ORF2 序列的貝葉斯進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，DL147 與香港株的分歧時(shí)間約為2003 年，屬于較晚分化的HEV 株型。其他分支中較晚分化的株型主要是日本和馬來(lái)西亞發(fā)現(xiàn)的人的HEV 毒株，包括AB220977、AB369690、KX426575 在內(nèi)的株型約分化于2004 年。除以上三株外，本研究發(fā)現(xiàn)的DL147株型分化時(shí)間早于世界的其他HEV 毒株，說(shuō)明大理市褐家鼠中感染的HEV 可能是由其他地區(qū)的毒株傳播演化而來(lái)的（圖3）。

圖3 HEV 序列的貝葉斯進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Bayesian evolutionary tree of HEV sequences

3 討論

云南省大理市地處云貴高原西部，緊鄰青藏高原，獨(dú)特的地形與氣候形成了當(dāng)?shù)氐莫?dú)特的生物多樣性。我們先前的調(diào)查在云南省的高山姬鼠（Apodemus chevrieri）和黑腹絨鼠（Eothenomys melanogaster）中發(fā)現(xiàn)存在新型HEV，并命名為HEV-C3和HEV-C4［19］。本次調(diào)查在褐家鼠（Rattus norvegicus）中檢測(cè)出HEV，鑒定的DL147號(hào)HEV陽(yáng)性樣本與香港患者血清中檢測(cè)得到的HEV 高度相似，基因組序列一致性達(dá)到95.21%。從本次調(diào)查獲得的DL147的全基因組來(lái)看，其屬于家鼠種（Rocahepevirus ratti）中的HEV-C1基因型。到目前為止，HEV-C1感染人的病例約有20例被報(bào)道［16，20-22］。特別值得注意的是，褐家鼠在居民區(qū)活動(dòng)，為居民區(qū)的優(yōu)勢(shì)種，與人的關(guān)系十分密切［21］。褐家鼠攜帶的HEV 在云南省大理市是否感染人有待于進(jìn)一步的研究。

已有研究顯示，HEV 中能感染人的巴拉揚(yáng)尼種（Paslahepevirus balayani）的8個(gè)基因型中有4個(gè)（HEV-1～HEV-4）主要感染人，其中HEV-1和HEV-2只感染人，而HEV-3 和HEV-4 為人獸共患，豬為其主要的宿主動(dòng)物。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，豬的飼養(yǎng)時(shí)間逐漸縮短，一般在半年以內(nèi)屠宰，所以豬做為HEV-3、HEV-4 保存宿主而導(dǎo)致的感染傳播的概率可能會(huì)逐漸減少［24］。而鼠類，特別是褐家鼠等家鼠，具有分布廣泛、種類數(shù)量繁多、繁殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，與人類和其他動(dòng)物的聯(lián)系又十分密切，其攜帶的HEV 值得繼續(xù)關(guān)注［23］。病毒分歧時(shí)間結(jié)果顯示，大理市褐家鼠中發(fā)現(xiàn)的HEV-C1 出現(xiàn)的時(shí)間較晚，有從其他宿主動(dòng)物感染演化而來(lái)的可能。同時(shí)，世界各地褐家鼠攜帶HEV-C1 或相關(guān)的HEV 病毒均有報(bào)道［25］，所以鼠類作為HEV 的宿主動(dòng)物的情況值得重視。