酵母菌的磁性載體固定化及處理精煉大豆油廢水

吳 松

(大唐東北電力試驗研究院有限公司,吉林 長春 130102)

大豆油在精煉過程中會產(chǎn)生大量有機負荷比較高的廢水，此類廢水直接排放會降低水中溶解氧，加重水體自凈化負擔(dān)，使水質(zhì)富營養(yǎng)化，嚴重污染環(huán)境，對人們生活造成危害[1-3]。精煉大豆油廢水的特點：一是有機物含量較高，其中油脂難溶于水且黏度較高，易生成乳化液，難生物降解；二是有毒物質(zhì)少，可生化性好[4]。因此，目前針對大豆油精煉過程中產(chǎn)生的廢水，國內(nèi)一般通過預(yù)處理去除懸浮物和乳化態(tài)油，再通過生化處理去除溶解態(tài)油和剩余有機物，使其達標(biāo)排放[5]，但是該處理工藝存在投資成本高、占地面積廣、工藝復(fù)雜且會造成二次污染等缺點。為了解決傳統(tǒng)生物處理技術(shù)存在的問題，近年來采用固定化技術(shù)，通過一定的技術(shù)手段(如載體材料，包埋材料或合理控制水力條件)固定微生物。固定化微生物技術(shù)是利用物理或化學(xué)手段將微生物固定在載體上，使其高度致密并保持其生物活性，在適當(dāng)條件下也可擴大生產(chǎn)規(guī)模以滿足生物技術(shù)應(yīng)用的需要[6]。微生物固定化方法一般分為吸附法[7]、交聯(lián)法、包埋法[8]、介質(zhì)保留法和多種固定化組合方法如復(fù)合固定化方法[9]等。Pai等[10]研究了在高負荷條件下固定化微生物濾床對苯酚的降解，結(jié)果表明：與顆粒狀活性炭相比，以海藻酸鈣為載體的固定化活性炭顆粒對苯酚具有較高的降解率。周相林等[11]比較了游離細胞與固定化細胞降解氰的某些特征，發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性明顯提高。因固定化微生物穩(wěn)定性高、重復(fù)利用性好，故固定化微生物技術(shù)有望成為處理含油廢水的新型高效方法。磁性載體又稱磁性微球或磁種，是由超順磁性納米粒子與高分子或其它無機材料復(fù)合形成的膠態(tài)顆粒。磁性微粒作為一種磁性載體在酶固定、細胞分離與固定、靶向載藥治療及核酸的純化與分離等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[12]。近幾年來，對于磁場效應(yīng)在廢水生物降解中的應(yīng)用研究有大量的報導(dǎo)。水經(jīng)磁化處理后，其物理與化學(xué)性質(zhì)會發(fā)生變化，磁場的作用能提高微生物的生物活性，增加微生物對廢水有機污染物的吸附和利用能力，因而提高了污水生物凈化效果[13]。固定在磁性載體上的酶和微生物細胞存在較大的pH值和溫度范圍，且穩(wěn)定性更高。多種酶活生物細胞的共固定化也可以通過基于磁性載體的固定方法來完成[14]。磁分離技術(shù)可以使磁性載體與被吸附物質(zhì)更易分離，該吸附劑是由微生物、海藻酸鈉、聚乙烯醇和四氧化三鐵組成，該吸附劑在去除和回收廢水中的重金屬方面具有潛在價值[15]。本研究利用磁性載體和海藻酸鈉固定的酵母菌對精煉大豆油廢水進行處理，并對廢水處理條件進行優(yōu)化，以期為精煉大豆油廢水的生物處理提供新思路。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

發(fā)酵性絲孢酵母(TrichoporonfermantansCICC 1368)，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。實驗所用試劑均為市售分析純。

為了實驗的可控性和操作簡便，本研究使用的廢水是根據(jù)取自吉林省某豆油生產(chǎn)加工廠的精煉大豆油廢水水質(zhì)分析結(jié)果而配制的模擬廢水。精煉大豆油原廢水和模擬廢水水質(zhì)分析情況見表1。

表1 精煉大豆油產(chǎn)生的廢水和模擬廢水水質(zhì)

571型COD測定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；722型分光光度計，渡揚精密儀器(上海)有限公司；D8Advance XRD衍射儀，廣州創(chuàng)儀欣儀器有限公司。

1.2 酵母菌的磁性載體固定化

1.2.1培養(yǎng)基的制備 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，作為液體種子培養(yǎng)基。在液體種子培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L作為固體培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基均在1×105Pa飽和蒸汽下滅菌20 min。

1.2.2菌種的保藏和活化 菌種保藏：從培養(yǎng)菌種的固體YPD中挑取單菌落，接種到裝有100 mL 液體YPD的250 mL搖瓶中，30 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)24 h；然后將菌種液保存于濃度為20%的甘油中，于-80 ℃下凍存。

菌種活化：從冰箱中取出保藏菌種，劃線接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，30 ℃ 下恒溫培養(yǎng)24～48 h，為本研究提供酵母菌。

1.2.3磁性載體的制備 采用化學(xué)共沉淀法制備水溶性的磁性載體Fe3O4納米顆粒，具體步驟如下：用去離子水分別配制1.0 mol/L的FeCl2和1.75 mol/L的FeCl3水溶液各50 mL，加入到500 mL的三口瓶中，通入氮氣進行保護，持續(xù)機械攪拌，當(dāng)水浴加熱至60 ℃時快速滴加氨水(質(zhì)量分數(shù)25%～28%)至pH值10～11，溶液由棕色變?yōu)楹谏纯?。再升溫?0 ℃恒溫保持1 h后室溫冷卻，用永久磁體將產(chǎn)物從溶液中分離，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，在室溫下真空干燥24 h，制得Fe3O4納米顆粒。

1.2.4酵母菌的固定化 酵母菌懸液的配置：用接種環(huán)將固體培養(yǎng)基上發(fā)酵性絲孢酵母的一株單菌落接入到100 mL無菌的YPD中，在30 ℃ 搖床上以180 r/min培養(yǎng)1天，得到培養(yǎng)好的酵母菌懸液，存放在4 ℃ 冰箱中，備用。

海藻酸鈉固定化酵母菌：用100 mL蒸餾水加熱溶解10 g海藻酸鈉，將10 mL酵母菌懸液與100 mL配制好的海藻酸鈉溶液充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液[16]。然后稱取3.00 g無水氯化鈣，溶于150 mL蒸餾水中，配制成所需質(zhì)量分數(shù)(2%)的氯化鈣溶液，將其置于設(shè)定溫度(20 ℃)的電子恒溫水浴鍋中，將100 mL海藻酸鈉-酵母菌懸液滴入150 mL氯化鈣溶液中造粒，并恒溫維持2 h，使酵母充分固定化。傾去上清液，用蒸餾水沖洗固定化酵母3次，然后重新置于150 mL 2%的氯化鈣溶液中平衡24 h后，懸液備用[16]。

磁性載體固定化酵母菌：取10 mL酵母菌懸液，加入5 g的磁性載體Fe3O4納米顆粒，于搖床中恒溫(30 ℃、 150 r/min)搖動一定時間，懸液備用[17]。

1.3 精煉大豆油產(chǎn)生的廢水處理

本研究中所有廢水處理均在250 mL搖瓶中進行，分別將適量酵母菌、磁性載體、海藻酸鈉固定化酵母菌和磁性載體固定化酵母菌與100 mL模擬廢水在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min下培養(yǎng)48 h。實驗中分別考察了處理時間(0～48 h)對廢水水質(zhì)以及酵母菌生長情況的影響，廢水的pH值(5.0～7.5)對廢水中酵母菌的生產(chǎn)情況以及酵母菌接種量(0～10%)對廢水的COD值的影響。

1.4 分析與測試

OD600的測定：利用可見分光光度計722型測量濕菌體在600 nm處的吸光度，以判斷酵母菌生長情況。

廢水COD值的測定：由于COD測定儀的上限為150 mg/L，待測樣品需要用去離子水稀釋至適宜濃度。取2 mL稀釋后的待測樣品放入COD消解管中，加入3 mL重鉻酸鉀專用氧化劑，擰緊管帽將液體搖勻，將消解管放入消解裝置中，165 ℃消解10 min，冷卻至室溫，把消解結(jié)束后的樣品倒入石英比色皿中，放入COD測定儀進行測量。

XRD分析：對磁性載體的結(jié)構(gòu)組成采用XRD進行定性分析。測量時稱取15～25 mg磁性載體置于樣品臺上，用蓋玻片和稱量紙壓平，擦去樣品臺表面多余的磁性載體粉末后放至衍射儀的上樣器上測量。衍射儀的發(fā)生器功率為40 kV，其射線源為Cu Kα射線，掃描范圍(2θ)為20～80°，掃描速度5 (°)/min，掃描步長0.05°。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性載體的表征

采用化學(xué)共沉淀法制備的Fe3O4的XRD圖譜見圖1?？梢钥闯?，在2θ為18.2°、 30.0°、 35.4°、 43.0°、 56.9°及62.5°處均出現(xiàn)強衍射峰，分別對應(yīng)于Fe3O4的(111)、(220)、(311)、(400)、(511)及(440)晶面，說明所得的產(chǎn)物為立方晶系結(jié)構(gòu)的Fe3O4，即FeO(Fe2O3)。結(jié)合其衍射峰尖銳且半峰寬窄，證明所制備的Fe3O4結(jié)晶度高，具有尖晶石結(jié)構(gòu)，晶型好，無其他衍射峰存在。

圖1 四氧化三鐵納米晶體粒子的XRD圖譜Fig.1 XRD pattern of Fe3O4 nanocrystalline particles

2.2 精煉大豆油廢水的固定化酵母菌處理

2.2.1不同處理時間對廢水水質(zhì)的影響

2.2.1.1酵母菌處理廢水 酵母菌(1.2.4節(jié)酵母菌懸液)處理精煉大豆油廢水時，在接種量10%，其它條件同1.3節(jié)，不同處理時間對廢水pH值和COD值，以及酵母菌OD600值的影響情況見表2。

由表可以看出，隨著酵母菌處理時間的增加，廢水的pH值先減小后增加，在0～12 h范圍內(nèi)pH值的減小是因為酵母菌在處理含油廢水時產(chǎn)生了脂肪酸，而12 h后廢水pH值隨著廢水中脂肪酸被消耗逐漸增大，在36 h后保持穩(wěn)定。由此可見，當(dāng)廢水中的菌體濃度較高時，發(fā)酵性絲孢酵母可以直接利用廢水中的物質(zhì)。酵母菌的OD600值隨處理時間增加呈上升趨勢，12 h之后酵母菌的OD600值迅速增大，這是因為酵母菌這時處于對數(shù)生長期，菌體的增長量急速上升而導(dǎo)致酵母菌的OD600值增大。廢水的COD值在24～36 h急速下降，36 h時廢水的COD值為3 630 mg/L。一般來說，COD值小于5 000 mg/L，就是理想的處理效果?？梢娺@個時間段酵母菌對廢水處理的效果最好。

2.2.1.2磁性載體處理廢水 利用磁性載體對精煉大豆油廢水進行處理時不考慮酵母的生長情況(OD600值)。在1.3節(jié)條件下，5 g磁性載體處理精煉大豆油廢水時，不同處理時間對廢水pH值和COD值的影響情況見表2。

表2 處理時間對精煉大豆油廢水水質(zhì)的影響

由表可以看出，隨著處理時間的延長，pH值變化不大。這是因為酵母菌的生長會產(chǎn)生脂肪酸從而導(dǎo)致廢水的pH值發(fā)生大幅度變化，而磁性載體處理廢水過程中無酵母菌參與，因此，廢水的pH值變化不大。通過分析COD值可知：0～24 h磁性載體對廢水的處理幾乎沒有效果，而24～36 h廢水的COD值急速下降，這是因為在此時間段內(nèi)，由于攪拌作用，磁性載體經(jīng)過一段時間搖瓶振動混合，對廢水中的物質(zhì)有一定吸附能力，經(jīng)磁性載體處理36 h，廢水的COD值為6 530 mg/L。

2.2.1.3固定化酵母菌處理廢水 按照1.3節(jié)操作，不同處理時間下，接種量10%的海藻酸鈉固定化酵母菌和磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水的結(jié)果見表3。

表3 固定化酵母菌處理對精煉大豆油廢水水質(zhì)的影響

由表可看出, 不管是海藻酸鈉固定化酵母菌處理還是磁性載體固定化酵母菌處理，廢水的pH值均隨著酵母菌處理時間的增加先減小后增加。0～12 h廢水的pH值減小，這是因為酵母菌在此階段處理含油廢水時產(chǎn)生了脂肪酸。而12 h后pH值逐漸上升，在36 h后保持穩(wěn)定，這是因為該階段酵母菌的生長量急劇上升，會消耗脂肪酸，當(dāng)菌體生長量一定時，pH值變化緩慢。由此可見，初始菌體濃度較高時，發(fā)酵性絲孢酵母可以直接利用廢水中的物質(zhì)。酵母菌的OD600值變化在0～24 h增長速度較為緩慢，24 h之后迅速增長。這是因為24 h屬于酵母菌的對數(shù)生長期，此時菌體的增長量急速上升，從而導(dǎo)致OD600值的迅速變大。而廢水的COD值，經(jīng)過海藻酸鈉固定化酵母菌處理的廢水，在0～36 h，由于酵母菌對廢水的降解能力稍微緩慢，COD值變化不大，而在36～48 h，廢水的COD值急速下降，48 h時COD值為4 580 mg/L。而經(jīng)過磁性載體固定化酵母菌處理的廢水，在0～24 h，由于酵母菌對廢水的降解能力稍微緩慢，COD值變化不大；在24～36 h，廢水的COD值急速下降，36 h時COD值為2 430 mg/L。由此可見，相同條件下磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水效果最佳，且合適的處理時間為36 h。

2.2.2不同pH值對廢水水質(zhì)的影響 由于酵母的生長與廢水的pH值密切相關(guān)，因此本節(jié)主要考察pH值對酵母菌OD600值的影響。在1.3節(jié)條件下，接種量10%的酵母菌和固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水的結(jié)果見圖2。

a.酵母菌處理treated by yeast; b.海藻酸鈉固定化酵母菌處理treated by sodium alginate immobilized yeast;

由圖2(a)可以看出，無論廢水pH值如何變化，酵母菌的OD600值總是隨著時間的增長而增大。在pH值為5.0和5.5時，處理12 h的廢水中的酵母菌的OD600值較大，但是處理24和36 h時的廢水中的酵母菌的OD600值均小于pH值為6.0時的酵母菌的OD600值。且隨著pH值的增加，12 h的OD600值是逐漸減小的，也就是說酵母菌生長前期廢水的pH值越高，會影響酵母的正常生長；而24和36 h的OD600值先略有增大而后減小，這是因為在酵母的生長中期和生長末期，過小和過大的pH值都會影響酵母的正常生長。pH值為6.0時，廢水處理12、 24和36 h時，廢水中的酵母菌的OD600值較高，分別為5.88、 13.74和19.20，可見絲孢酵母菌適合在此pH值下生長。

由圖2(b)可以看出，經(jīng)海藻酸鈉固定化酵母菌處理12和24 h的廢水中的酵母菌，在pH值大于6.5或小于6.0時的生長情況都要優(yōu)于pH值為6.0～6.5，但是處理36 h的廢水中的酵母菌的OD600值卻是先增大后減小。這是因為酵母菌經(jīng)過海藻酸鈉固定化后生長性質(zhì)發(fā)生了變化。由此可見，對于海藻酸鈉固定化酵母菌，在其生長前期，廢水呈弱酸性會影響12和24 h的酵母菌的正常生長，而在酵母菌的生長初期和生長中期，廢水呈酸性或者堿性，則對36 h的酵母菌的正常生長有促進作用。由此可見，海藻酸鈉固定化酵母菌處理36 h的廢水中，酵母菌在pH值5.5時生長量最大，OD600值為19.12。

由圖2(c)可以看出，經(jīng)磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水中的酵母菌，隨著pH值的增加，12 h的酵母菌的OD600值是波動變化的，也就是說生長前期廢水的pH值變化對酵母的正常生長影響較小；而24和36 h的酵母菌的OD600值，變化總趨勢是先增大后減小，即在酵母的生長中期和生長末期，過小和過大的pH值都會影響酵母菌的正常生長。pH值6.0比較適合磁性載體固定化酵母菌的生長，12、 24和36 h的酵母菌的OD600值分別為5.14、 10.25和19.78。

綜上，處理精煉大豆油廢水36 h時，廢水中磁性載體固定化酵母菌的OD600值最高，達到19.78，而發(fā)酵性絲孢酵母和海藻酸鈉固定化酵母菌的OD600值分別為19.20和19.12。

2.2.3不同接種量對廢水水質(zhì)的影響 由于廢水的處理效果與酵母菌的接種量密切相關(guān)，因此本節(jié)主要考察酵母菌接種量對廢水COD值的影響。

在1.3節(jié)條件下，酵母菌和固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水(pH值6)時，接種量對廢水COD值的影響情況見圖3。

a.酵母菌處理treated by yeast; b.海藻酸鈉固定化酵母菌處理treated by sodium alginate immobilized yeast;

由圖3(a)可知,酵母菌接種量大于4%時，廢水的COD值隨著處理時間的增加，出現(xiàn)先減小后增加的趨勢，這可能是因為接種量過大，影響酵母處理廢水的效果。而當(dāng)接種量為4%，經(jīng)酵母菌處理的廢水COD值隨時間增大而減小，處理時間為36 h時，COD值最小，為3 630 mg/L。

由圖3(b)可知, 廢水COD值隨著海藻酸鈉固定化酵母菌接種量的增加發(fā)生變化。接種量為4%和6%時，廢水的COD值隨著處理時間的增加均為先減小后增加。接種量為8%時，廢水的COD值雖然隨著處理時間的增加逐漸減小，但是COD值仍然較大，廢水處理效果不佳。而當(dāng)接種量為10%、處理時間為12 h時，廢水的COD值最小，為4 580 mg/L。

由圖3(c)可知, 磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水時，廢水COD值隨著接種量的增加，除處理時間12 h的之外，24和36 h的均整體呈下降趨勢。接種量為8%時，精煉大豆油廢水的COD值隨處理時間的增加逐漸減小，處理36 h的廢水COD值為9 840 mg/L，但是仍然較大，廢水處理效果不佳。當(dāng)接種量為10%、處理時間為36 h時，磁性載體固定化后的酵母菌對廢水的處理效果最好，廢水COD值最小，為2 430 mg/L。

綜上，通過對比分析可知，相同條件下磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水的COD值最佳。

3 結(jié) 論

3.1 先采用化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵納米磁性材料，再對酵母菌進行固定化，并用磁性載體固定化酵母菌對精煉大豆油廢水進行處理，并與海藻酸鈉固定化酵母菌和絲孢酵母菌處理廢水結(jié)果進行對比，結(jié)果顯示：在相同條件下，酵母菌、磁性載體、海藻酸鈉固定化酵母菌和磁性載體固定化酵母菌4種物質(zhì)中，磁性載體固定化酵母菌對精煉大豆油廢水處理36 h時效果最佳。廢水中酵母菌的生長量最大，OD600值為19.12。pH值6.0比較適合磁性載體固定化酵母菌的生長，處理36 h的廢水中的酵母菌的OD600值為19.78。

3.2 磁性載體固定化酵母菌對精煉大豆油廢水進行處理的較優(yōu)條件為pH值6.0，處理時間36 h，接種量10%。此條件下，廢水的COD值為2 430 mg/L。