復(fù)方山莨菪堿注射液的遺傳毒性評價

田逸君，侍雯靖，董雅春，張?zhí)鞂殻煊衿?（海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 衛(wèi)生毒理學(xué)教研室； . 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心, 上海 200433）

山莨菪堿是托品酸和有機堿形成的酯類，結(jié)構(gòu)與阿托品和東莨菪堿相類似，在托品基的6位碳原子上有不對稱的羥基，是一種天然的莨菪烷類生物堿[1-3]。山莨菪堿屬于非選擇性的毒蕈堿受體阻斷劑，能夠阻斷M1和M5受體亞型。因此，山莨菪堿有一系列相似于阿托品的藥理作用[4]，如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌、抑制胃腸蠕動及膀胱收縮，其他還包括散瞳、擴張支氣管等[5]，適用于胃或腸道的絞痛、急性微循環(huán)障礙及有機磷酸中毒等臨床病癥[4，6]。但單獨使用山莨菪堿用藥劑量大，故常出現(xiàn)口干、面紅、視近物模糊、心跳加快、排尿困難等阿托品樣副作用，因此極大限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年來，隨著對山莨菪堿注射液及其衍生物藥理作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)其膽堿能抗炎通路對慢性炎癥如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等慢性疾病具有較好的藥效作用[4]。但這些疾病的療程較長，如何降低或消除山莨菪堿在治療過程中的阿托品樣副作用是臨床現(xiàn)實問題。

新斯的明是膽堿酯酶抑制劑，進入機體后，通過可逆性抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿不能水解，從而提高體內(nèi)受體部位的乙酰膽堿濃度，加強和延長乙酰膽堿的作用，呈現(xiàn)出全部膽堿能神經(jīng)興奮的效應(yīng)[4]。將毒蕈堿受體阻斷劑和膽堿酯酶抑制劑這兩類藥物以適當(dāng)?shù)谋壤?lián)合使用（即復(fù)方山莨菪堿）來協(xié)同激活膽堿能抗炎通路，增強其抗炎效果并降低其副作用的治療方案，有望為臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供新的治療方案[4]。

前期的研究結(jié)果顯示：通過將鹽酸消旋山莨菪堿與甲硫酸新斯的明組合制備而成的復(fù)方山莨菪堿注射液不僅對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有良好的抗炎效果，還可明顯降低山莨菪堿的阿托品樣不良反應(yīng)。但目前國內(nèi)外未見有關(guān)復(fù)方山莨菪堿注射液遺傳毒性安全性評價方面的研究報道。為提高臨床用藥的安全性，本實驗采用鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）、體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞染色體畸變試驗和ICR小鼠骨髓微核試驗方法評價其是否具有遺傳毒性，為進一步的臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物及溶媒對照

受試物為復(fù)方山莨菪堿注射液,兩種成分的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式詳見圖1和圖2（無色澄明溶液，批號20101222；規(guī)格：5 ml中含鹽酸消旋山莨菪堿1 g與甲硫酸新斯的明2 mg；由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系提供）。溶媒對照為氯化鈉注射液（無色透明液體，批號110714K2，安徽豐原藥業(yè)股份有限公司）。

圖1 消旋山莨菪堿結(jié)構(gòu)式 [7]

圖2 甲硫酸新斯的明結(jié)構(gòu)式 [7]

1.2 菌株及細(xì)胞

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）TA1535、TA102、 TA100、TA98和TA97 5個菌株，由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室贈予，儲存于液氮中。實驗前進行菌株鑒定，均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。CHO細(xì)胞由國家上海新藥安全評價研究中心贈予。

1.3 大鼠肝微粒體酶S9

購自美國MOLTOX公司（批號分別為2765和2715，有效期至：2013-05-17和2012-02-12），保存于-80 ℃冰箱。

1.4 動物

選用60只SPF級的ICR小鼠，雌雄各半（上海市西普爾-必凱動物有限公司，合格證號2008001616722）。檢疫期為3 d，每日觀察動物的外觀、糞便和攝食等情況并記錄。自購入日起的當(dāng)日和檢疫結(jié)束當(dāng)日共兩次稱量所有動物的體重（檢疫結(jié)束時的體重：雌鼠21.24～23.74 g; 雄鼠21.32～23.72 g），且根據(jù)該體重將雌、雄小鼠分別按隨機區(qū)組法分組，共分為6組，每組10只。

1.5 試驗方法

按《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等[8-9]的設(shè)計要求，選用標(biāo)準(zhǔn)試驗組合中的細(xì)菌回復(fù)突變試驗[10]，體外染色體畸變試驗[11]和體內(nèi)微核試驗[12]來全面評價復(fù)方山莨菪堿注射液的遺傳毒性。

1.5.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗[13-17]

應(yīng)用組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98和TA97共5種菌株進行測試。對不受溶解度或細(xì)胞毒性限制的受試物最高濃度應(yīng)達(dá)到5 mg/皿[10]，故設(shè)復(fù)方山莨菪堿注射液（以5 ml中含鹽酸消旋山莨菪堿1 g與甲硫酸新斯的明2 mg為計）總劑量為0.5、5、50、500、5 000 μg/皿共5組，此外還有對照組，包括空白對照、溶媒對照和陽性對照。按標(biāo)準(zhǔn)的平板摻入法操作，細(xì)菌在有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)（-S9組在每個平皿的試驗體系中加入0.5 ml的磷酸緩沖液，+S9組在每個平皿的試驗體系中加入0.5 ml的S9混合液）的平行條件下，將相應(yīng)濃度的受試物溶液、溶媒對照品（氯化鈉注射液）或陽性對照品溶液分別加入到無菌的試管中（表1和表2）0.1 ml，每個組別均設(shè)3個平行。以上所有物質(zhì)與頂層瓊脂混勻后，迅速鋪澆到底層瓊脂平板上，待其凝固后倒置培養(yǎng)48～72 h，通過肉眼或顯微鏡仔細(xì)觀察各劑量組的菌苔是否正常，區(qū)分受試物沉淀與白色菌落，判斷是否有由受試物導(dǎo)致的明顯抑菌現(xiàn)象，接著采用手工計數(shù)的方法記錄每皿中全部回復(fù)突變的菌落數(shù)量，統(tǒng)計3個平行皿的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，與溶媒對照組進行比較。按上述操作再驗證一次。

表1 復(fù)方山莨菪堿注射液的第1次Ames試驗結(jié)果(個/皿， +s，n=3)

表1 復(fù)方山莨菪堿注射液的第1次Ames試驗結(jié)果(個/皿， +s，n=3)

陽性對照品：-S9組TA97、TA98敵克松（50 μg/皿），TA100、TA102 甲基磺酸甲酯（1 μg皿）；TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿)+S9組TA97、TA98、TA100 2-AF（10 μg/皿）；TA102 1,8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）；TA1535環(huán)磷酰胺（50 μg/皿）

劑量組(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 76.7±4.2 76.3±3.2 46.3±2.3 38.3±6.8 96.3±10.5 112.7±17.0 123.0±2.6 170.7±38.3 15.3±5.0 33.3±9.5 500 69.3±8.3 112.0±12.2 46.0±1.7 45.7±9.7 97.3±11.4 115.3±17.9 187.0±53.8 166.7±41.6 28.3±4.5 30.7±2.1 50.0 74.7±1.2 83.7±14.8 36.7±7.0 39.3±12.8 85.3±3.0 132.7±20.0 183.3±5.7 159.0±36.8 31.3±8.1 30.0±10.5 5.0 76.7±12.3 64.7±11.0 40.7±12.2 36.3±13.6 138.7±47.4 137.7±15.9 158.3±17.4 155.0±32.6 25.3±3.2 27.3±8.3 0.5 63.0±5.2 74.0±20.3 42.7±12.8 36.3±11.9 138.0±45.4 119.3±10.3 176.0±44.2 170.7±40.0 23.3±1.2 29.3±5.7空白對照 90.7±29.5 78.7±2.3 35.0±4.4 41.3±8.1 119.3±14.0 125.3±9.2 201.3±21.4 192.0±20.8 27.3±6.8 28.0±3.6溶媒對照 72.0±12.0 72.0±11.1 35.3±2.3 37.0±2.0 121.3±9.0 123.3±9.4 167.3±18.6 210.0±25.0 32.3±6.6 30.0±2.0陽性對照653.3±83.3 583.3±28.9 714.0±53.0 625.3±162.0 802.7±140.9 651.0±64.5 1 093.3±122.2 1 026.7±83.2 622.7±189.9 752.0±44.5

表2 復(fù)方山莨菪堿注射液的第2次Ames試驗結(jié)果(個/皿， +s，n=3)

表2 復(fù)方山莨菪堿注射液的第2次Ames試驗結(jié)果(個/皿， +s，n=3)

陽性對照品：-S9組TA97、TA98敵克松（50 μg/皿），TA100、TA102 甲基磺酸甲酯（1 μg皿）；TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿)+S9組TA97、TA98、TA100 2-AF（10 μg/皿）；TA102 1,8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）；TA1535環(huán)磷酰胺（50 μg/皿）

劑量組(μg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 65.0±23.4 64.7±15.7 17.0±3.5 25.7±1.5 74.3±1.0 89.0±4.4 108.3±6.6 102.7±19.2 18.3±2.1 16.0±3.5 500 73.0±6.1 69.0±12.1 22.0±6.9 20.3±2.9 82.3±24.4 97.7±7.8 162.0±45.4 169.3±31.0 20.0±4.6 19.0±5.6 50.0 74.0±26.4 78.3±7.1 20.0±6.2 24.3±7.5 82.3±29.4 88.0±8.2 188.3±4.5 157.0±37.6 22.0±5.3 20.0±3.6 5.0 60.7±16.8 58.0±8.0 24.0±3.0 21.3±3.9 92.0±45.2 89.7±10.0 162.7±51.0 161.0±35.0 22.7±9.8 21.0±3.6 0.5 56.7±8.1 68.7±11.8 21.0±6.0 19.0±1.7 104.0±31.2 97.7±7.6 143.0±56.2 157.3±41.0 20.0±2.6 24.0±2.0空白對照80.7±7.0 76.7±2.1 25.3±2.5 22.3±6.8 110.0±10.0 102.7±30.6 221.3±34.0 151.0±36.8 17.3±3.0 15.0±5.2溶媒對照85.7±7.6 84.0±7.0 24.0±5.2 21.3±3.0 111.3±21.9 92.3±7.4 169.3±18.0 155.0±32.4 30.3±9.3 23.3±5.0陽性對照660.0±66.8 581.0±157.0 564.0±65.8 618.7±112.1 565.3±65.2 657.3±115.7 1 064.0±24.0 1 044±26.2 552.0±78.0 597.0±89.3

1.5.2 體外染色體畸變試驗[13-17]

采用體外培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)的平行條件下進行測試。預(yù)試驗最高濃度設(shè)定為5 mg/ml，再按等比級數(shù)設(shè)計若干個濃度。正式試驗的最高濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)約為50%[11]。故根據(jù)預(yù)試驗測定IC50（50 %細(xì)胞生長抑制濃度）為235.0 μg/ml，因此一共設(shè)3個劑量組，依次為58.75、117.5和235.0 μg/ml，另設(shè)陽性對照組（-S9組為0.5 μg/ ml絲裂霉素C溶液，+S9組為60 μg/ ml環(huán)磷酰胺溶液）和溶媒對照組（氯化鈉注射液），每個組別均設(shè)2個平行。-S9/4 h組和+S9/4 h組：受試物作用細(xì)胞4 h后棄全部培養(yǎng)基，用PBS洗滌后重新添加新的10 ml 1 640完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h后收集細(xì)胞；-S9/24 h組：受試物作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。終止培養(yǎng)前4 h加入20 μg/ml秋水仙堿，目的是使大部分細(xì)胞的有絲分裂停止在中期相，所有細(xì)胞依次經(jīng)過0.75% KCl低滲、固定（甲醇∶冰乙酸=3∶1）、涂片和Gimsa染色處理，在顯微鏡下選擇染色體數(shù)目完整且分散良好的中期分裂相染色體作為觀察對象，觀察染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變。分別記錄各組含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)和畸變類型（表3），計算每組的染色體畸變率。

表3 復(fù)方山莨菪堿注射液對體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞的染色體畸變試驗結(jié)果

1.5.3 體內(nèi)微核試驗[13-17]

采取與臨床擬用途徑一致的給藥方式[12]，對ICR小鼠采用單次經(jīng)尾靜脈注射的給藥方式。根據(jù)受試物急性毒性的試驗結(jié)果：半數(shù)致死量LD50為60.4 mg/kg。本次試驗的最高劑量為1/2 的LD50，最高劑量之下的其他劑量保持劑量間距為2～3倍[12]。故共設(shè)3個劑量組（分別為7.5、15.0和30.0 mg/kg），及溶媒對照組（氯化鈉注射液，給藥方式與受試物組相同）和陽性對照組（劑量為40 mg/kg的環(huán)磷酰胺溶液，臨用時用氯化鈉注射液配制成4.0 mg/ml的環(huán)磷酰胺溶液，給藥方式為單次腹腔注射），給藥容積均為10 ml/kg。因此，總共有六組，其中的高劑量組有兩組，分別在藥物作用24 h和48 h后處死，除高劑量48 h組外，其他組均在藥物作用24 h后處死。取小鼠兩側(cè)大腿股骨制備骨髓涂片，每只小鼠制2張骨髓片，自然干燥后染色。所有動物均鏡檢約1 000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計數(shù)含微核的PCE數(shù)（MNPCE），統(tǒng)計微核發(fā)生率，在記錄200個PCE的同時計數(shù)觀察到的所有正染紅細(xì)胞（NCE）的數(shù)量（表4），通過PCE/NCE值來評價受試物是否具有骨髓毒性。

1.6 判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)菌回復(fù)突變試驗的結(jié)果判定是將各劑量組的受試物與溶媒對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)進行比較，如果某個組別的回復(fù)突變菌落數(shù)是溶媒對照組突變菌落數(shù)的2倍及以上，且可重復(fù)性，并在劑量范圍內(nèi)存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷為陽性；體外染色體畸變試驗和體內(nèi)微核試驗的結(jié)果，也是與溶媒對照組進行比較，均采用卡方檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗

所有平皿經(jīng)均未見雜菌污染，可觀察到目標(biāo)菌苔的正常生長。所有菌株的自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)和陽性物誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)都在歷史對照數(shù)據(jù)庫的范圍內(nèi)，且陽性對照組與空白對照組相比回復(fù)突變菌落數(shù)是顯著增加的，該結(jié)果提示整個試驗系統(tǒng)符合要求[13-17]。最高濃度已達(dá)到5 mg/皿時，未觀察到復(fù)方山莨菪堿注射液的抑菌現(xiàn)象。兩種平行條件下，即有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)中，各劑量組的受試物所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與自發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)接近，未見明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。兩次結(jié)果見表1和表2。

2.2 體外染色體畸變試驗

經(jīng)顯微鏡觀察，陽性對照組能顯著誘發(fā)細(xì)胞染色體的畸變，與溶媒對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），驗證了該系統(tǒng)的有效性[13-17]；復(fù)方山莨菪堿注射液各劑量組的CHO細(xì)胞染色體畸變率與溶媒對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表3。

2.3 體內(nèi)微核試驗

各劑量組小鼠在給藥后未見異常，且未出現(xiàn)動物死亡。雌、雄小鼠在給予陽性對照品后，其骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率與溶媒對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示試驗系統(tǒng)符合要求[13-17]。復(fù)方山莨菪堿注射液各劑量組的雌、雄小鼠骨髓PCE/(PCE+NCE) ＞ 50%，即受試物對骨髓無抑制作用，各劑量組微核率與溶媒對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

3 討論

作為單藥，山莨菪堿與甲硫酸新斯的明均已進行過完整的遺傳毒性評價，且皆為陰性。但既往研究表明，藥物聯(lián)合作用可改變單藥的致突變性。用TA98、TA100和TA102菌株對順鉑和卡鉑與新斯的明、博萊霉素、5-氟尿嘧啶和長春新堿聯(lián)合用藥的遺傳毒性進行評價，發(fā)現(xiàn)藥物之間的相互作用會產(chǎn)生抗致突變性作用，聯(lián)合用藥時的致突變性比單藥要低[18]。復(fù)方山莨菪堿是由鹽酸消旋山莨菪堿與甲硫酸新斯的明按照500:1的比例組成的復(fù)方注射劑，為考察其是否會產(chǎn)生與單藥不同的遺傳毒性，本研究按照《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]推薦的組合方法，分別從體外到體內(nèi)，從微生物、離體細(xì)胞和整體動物水平上對復(fù)方山莨菪堿注射液的遺傳毒性進行了評價，該試驗組合能檢測染色體畸變、基因突變等多個遺傳學(xué)終點[8-9]。Ames試驗表明復(fù)方山莨菪堿注射液在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受試劑量下，兩種平行條件下，即有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)時，與溶媒對照組的突變菌落數(shù)進行比較，各劑量組所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均和其相近。CA試驗結(jié)果表明58.75、117.5和235.0 μg/ml 3個劑量的受試物，所有劑量在兩種平行的系統(tǒng)條件下（即有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)時）對CHO細(xì)胞的染色體無明顯的畸變影響。MNT試驗設(shè)的7.5、15.0和30.0 mg/kg 3個劑量，對ICR小鼠骨髓的微核誘發(fā)率均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果顯示，在本實驗條件下,復(fù)方山莨菪堿注射液對鼠傷寒沙門氏菌無致突變性，對哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體無致畸變作用，對ICR小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無誘發(fā)微核的效應(yīng)；此也提示復(fù)方山莨菪堿注射液在受試條件下對人體不具有潛在致癌性和遺傳毒性。

綜上可知，在本實驗條件下結(jié)果提示復(fù)方山莨菪堿注射液不具有遺傳毒性和潛在致癌性，與單方相關(guān)的文獻報道結(jié)論基本相符，本研究結(jié)果為該藥的臨床安全性評價提供了前期科學(xué)依據(jù)。