活性氧自由基響應(yīng)型脂質(zhì)體在抗腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展

高習(xí)清，盧光照，魯 瑩，鄒 豪 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室, 上海 200433）

脂質(zhì)體是包封藥物納米載體的理想選擇[1]，它可以提高被包載物質(zhì)溶解度，增強(qiáng)物質(zhì)的穩(wěn)定性，減少外周不良反應(yīng)發(fā)生，且自身無(wú)毒。在腫瘤疾病治療中，依賴(lài)高滲透長(zhǎng)滯留(EPR)效應(yīng)的假設(shè)，基于病變區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)、生理功能和正常組織間的差異，脂質(zhì)體可使藥物輸送至腫瘤組織富集，更好地發(fā)揮治療作用[2]。但是，基于EPR效應(yīng)的納米制劑在實(shí)體瘤內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的靶向效率仍面臨很多質(zhì)疑[3]，所有納米顆粒(包括脂質(zhì)體在內(nèi))僅有0.7%(中位數(shù))的注射劑量被遞送至實(shí)體瘤，面臨脫顆粒困難、藥物釋放緩慢等問(wèn)題[4]。因此在脂質(zhì)體載體的研究中，針對(duì)內(nèi)源性刺激因素pH[5]、氧化還原反應(yīng)[6]和酶等[7]，外源性刺激因素溫度變化[8]、磁場(chǎng)[9]、光等[10]，研究者開(kāi)發(fā)出基于刺激響應(yīng)以及具有主動(dòng)運(yùn)輸功能的靶向脂質(zhì)體，以期在目標(biāo)部位高效、可控地釋放運(yùn)載藥物，提高脂質(zhì)體的靶向性并增強(qiáng)細(xì)胞毒性[11]。

1 活性氧自由基在腫瘤微環(huán)境中的作用

活性氧自由基(ROS)包括自由基、離子或分子，因在它們的最外層電子中具有單個(gè)未配對(duì)的電子，所以ROS具有很高的反應(yīng)活性[12]。ROS的形式有：①游離氧自由基：超氧化物(O2·-)，羥基自由基(·OH)，一氧化氮(NO·)，有機(jī)自由基(R·)，過(guò)氧自由基(ROO·)，烷氧基自由基(RO·)，噻吩基自由基( RS·)，磺?；?ROS·)，巰基過(guò)氧自由基(RSOO·)和二硫化物(RSSR)；②非自由基ROS：過(guò)氧化氫(H2O2)，單態(tài)氧(1O2)，臭氧/三氧(O3)，有機(jī)氫過(guò)氧化物(ROOH)，次氯酸鹽(HOCl)等。內(nèi)源性ROS主要來(lái)自于線粒體有氧呼吸中的電子傳遞鏈和黃嘌呤氧化酶、脂氧合酶、細(xì)胞色素P450、NADP氧化酶等[13]。

一方面，ROS通過(guò)直接與蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和基因反應(yīng)并修飾其結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)其功能，從而調(diào)節(jié)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同時(shí)ROS還參與信號(hào)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，調(diào)節(jié)酶(如核糖核苷酸還原酶)的活性，通過(guò)刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并消除病原體和異物。另一方面，ROS與生物分子(包括DNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì))具有高度反應(yīng)性，可能導(dǎo)致這些生物分子的氧化修飾并改變功能。 ROS水平的輕度升高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞瞬時(shí)改變，而細(xì)胞中ROS的嚴(yán)重升高則可能導(dǎo)致不可逆的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。ROS具有廣泛的致病作用，癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病均顯示出ROS參與的有力證據(jù)[14]。針對(duì)腫瘤的化學(xué)治療、放射治療大多是通過(guò)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生及聚集，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[15]。而腫瘤組織為了規(guī)避過(guò)度氧化應(yīng)激對(duì)自身造成傷害，會(huì)“戰(zhàn)略性”地調(diào)整多種抗氧化酶并廣泛利用代謝途徑提供的抗氧化分子(如GSH和NADPH)來(lái)中和并清除ROS[16]。

2 ROS響應(yīng)型脂質(zhì)體

有研究顯示，癌細(xì)胞的ROS濃度(100 μmol/L)大約比正常細(xì)胞(20 nmol/L)高2個(gè)數(shù)量級(jí)[17]。ROS響應(yīng)型脂質(zhì)體是基于ROS 在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的特點(diǎn)而制備。研究者通過(guò)化學(xué)合成方法在磷脂上鍵合硫醚[19]、硼酸酯類(lèi)[20]、二茂鐵[21]等特殊結(jié)構(gòu)對(duì)磷脂進(jìn)行修飾，當(dāng)制備的脂質(zhì)體到達(dá)腫瘤部位后，在ROS的氧化作用下其脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)包載藥物的釋放。此外，也可在脂質(zhì)體處方中直接加入適量含不飽和碳碳鍵的磷脂[10，24-25]，如L-α- 卵磷脂 (Egg PC)、1,2-二-(9Z-十八烯?；?-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1,2-二亞油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:2 (Cis) PC)等，不飽和碳碳鍵可與ROS發(fā)生反應(yīng)引發(fā)脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的改變，達(dá)到釋放藥物的目的。

3 磷脂結(jié)構(gòu)的修飾

與其他ROS響應(yīng)型化學(xué)結(jié)構(gòu)相比，硫醚顯得最簡(jiǎn)單有效，且具有更高的應(yīng)用潛力。在ROS氧化作用下，硫醚結(jié)構(gòu)將轉(zhuǎn)變成亞砜和其他砜類(lèi)[18]。Du等[19]通過(guò)化學(xué)合成方法開(kāi)發(fā)出新型的硫醚磷脂酰膽堿(S-Pcs)，再與DSPE-PEG2000和膽固醇混合，制備出ROS響應(yīng)型隱形脂質(zhì)體(S-LPs)。采用硫酸銨梯度法將模型藥物阿霉素(DOX)包入脂質(zhì)體，得到載藥脂質(zhì)體(DOX/S-LPs)。在考察ROS敏感性和DOX響應(yīng)釋放時(shí)，S-LPs表現(xiàn)出很好的ROS敏感性反應(yīng)。當(dāng)H2O2濃度在1～10 mmol/L范圍內(nèi)，包封DOX能夠得到有效釋放。在細(xì)胞毒性和體外抗腫瘤作用研究中，空白脂質(zhì)體未表現(xiàn)出對(duì)L929細(xì)胞的毒性；以MCF-7和A549為靶細(xì)胞，DOX/S-LPs表現(xiàn)出比DOX/LPs更顯著的抗癌效果。再以荷瘤4T1小鼠為模型考察體內(nèi)的抗癌作用，通過(guò)測(cè)量小鼠體重及腫瘤體積、重量進(jìn)行分析，DOX/S-LPs具有比傳統(tǒng)隱形脂質(zhì)體更高的抗癌效果。ROS響應(yīng)型硫醚脂質(zhì)體作為新型的藥物載體具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

Lou等[20]利用硼酸酯類(lèi)化合物開(kāi)發(fā)出包含合成脂質(zhì)1的H2O2響應(yīng)型脂質(zhì)體。他們先將對(duì)H2O2敏感的芳基硼酸酯頭基團(tuán)與DOPE相連得到合成脂質(zhì)1，再將脂質(zhì)1與PC混合制備脂質(zhì)體。當(dāng)脂質(zhì)體與H2O2接觸后，一個(gè)氧原子將插入芳基硼酸酯頭基團(tuán)的碳硼鍵中間，經(jīng)預(yù)先設(shè)計(jì)的自毀連接鍵反應(yīng)即可釋放出DOPE。由于自身結(jié)構(gòu)的特異性，DOPE具有不同大小的頭尾體積，無(wú)法維持脂質(zhì)體雙層膜穩(wěn)定性，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)遭到破壞，使包載的藥物釋放。該實(shí)驗(yàn)選擇脂溶性熒光染料尼羅紅來(lái)考察脂質(zhì)體響應(yīng)釋放特性。尼羅紅可在脂質(zhì)體雙分子層中溶解并發(fā)出熒光，而當(dāng)其釋放到水相或析出時(shí)，熒光即被淬滅。因此，尼羅紅不但可以用來(lái)模擬非極性藥物的性質(zhì)，還可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的下降跟蹤藥物釋放過(guò)程。在分析實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)加入H2O2后，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)即時(shí)下降。且在脂質(zhì)體中，熒光強(qiáng)度下降表現(xiàn)出對(duì)合成脂質(zhì)1含量依賴(lài)性。當(dāng)脂質(zhì)1含量為25%時(shí)，熒光強(qiáng)度下降約5%；當(dāng)脂質(zhì)1含量升至50%時(shí)，熒光強(qiáng)度下降增至約25%；當(dāng)脂質(zhì)1含量達(dá)到75%時(shí)，熒光強(qiáng)度急劇下降至約40%。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同脂質(zhì)1含量的脂質(zhì)體可在5 min內(nèi)得到完全釋放，為脂質(zhì)體可作為刺激響應(yīng)性藥物釋放載體提供了有力證據(jù)。

Tomer等[21]利用二茂鐵修飾的磷脂制備了一種載藥脂質(zhì)體，不僅可以表現(xiàn)出H2O2響應(yīng)釋放特性，而且能夠?qū)⒒熕幬锇邢蜉斔椭聊[瘤部位。二茂鐵是一種性質(zhì)穩(wěn)定且無(wú)毒的金屬有機(jī)絡(luò)合物，具有明確的外球面電子傳遞機(jī)制[22]。首先將DSPE與二茂鐵乙酸經(jīng)直接偶合反應(yīng)得到氧化還原活性磷脂，再加入其他原料制備出包含模型藥物阿霉素的氧化還原活性脂質(zhì)體，同時(shí)制備了不含二茂鐵結(jié)構(gòu)的非氧化還原脂質(zhì)體作對(duì)照。作者將脂質(zhì)體與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)5 h后，清洗細(xì)胞，成像。在590 nm處觀察細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒庑盘?hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)弱能夠反映出阿霉素經(jīng)脂質(zhì)體氧化還原響應(yīng)釋放后被細(xì)胞攝取的程度。結(jié)果顯示，氧化還原活性組光信號(hào)強(qiáng)烈，而非氧化還原活性組信號(hào)幾乎可以忽略，證明了新建釋放載體的氧化還原釋放機(jī)制。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩種脂質(zhì)體對(duì)癌細(xì)胞響應(yīng)的特異性，他們發(fā)現(xiàn)用氧化還原活性脂質(zhì)體處理的癌細(xì)胞(HeLa)顯示的熒光信號(hào)比非癌細(xì)胞(MRC-5)高整整一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4 不飽和磷脂的應(yīng)用

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是利用光動(dòng)力效應(yīng)進(jìn)行疾病診斷和治療的一種新技術(shù)。當(dāng)特定波長(zhǎng)的激光照射時(shí)，被組織吸收的光敏劑受到激發(fā)把能量傳遞給周?chē)难酰苫钚院軓?qiáng)的單態(tài)氧(1O2)，后者和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡。

考慮到腫瘤微環(huán)境中ROS水平的不確定性，結(jié)合PDT療法中外界光刺激在空間和時(shí)間上的靈活性優(yōu)勢(shì)，研究者開(kāi)發(fā)出光觸發(fā)ROS脂質(zhì)體。將光敏劑、化療藥物包載于處方中含不飽和磷脂的脂質(zhì)體中，這種同時(shí)包載光敏劑與化療藥物的光觸發(fā)ROS脂質(zhì)體[23]通過(guò)EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤病變組織。于腫瘤部位給予外界光刺激，光敏劑激發(fā)產(chǎn)生大量1O2，氧化不飽和磷脂，破壞脂質(zhì)膜穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)化療藥物可控釋放。

Fuse等[24]以DSPC、DOPE等為膜材制備出包載水溶性光敏劑他拉泊芬鈉和模型藥物鈣黃綠素的光響應(yīng)脂質(zhì)體。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予脂質(zhì)體近紅外光照射后，模型藥物在短時(shí)間會(huì)從脂質(zhì)體內(nèi)部大量釋放，5 min就達(dá)60%左右。進(jìn)一步研究顯示，藥物釋放量與不飽和磷脂DOPE的量呈正相關(guān)性，缺乏DOPE的脂質(zhì)體(DOPE 0%)在近紅外光照射下釋放較少，10 min達(dá) (18.7±1.0)%，，30 min達(dá)(25.7±0.4)%。而更多的藥物可從含有5%或10% DOPE的脂質(zhì)體釋放，5 min 達(dá)(61.1±3.1)%，DOPE 5%；5 min 達(dá)(84.3±1.8)%，DOPE 10%。再將鈣黃綠素?fù)Q成抗癌藥物吉西他濱制成類(lèi)似脂質(zhì)體，在被近紅外光照射后，吉西他濱5 min可從脂質(zhì)體中釋放(65.6±16.2)%，10 min釋放(81.2±11.4)%。作者利用EMT6/P乳腺癌細(xì)胞系評(píng)估含吉西他濱和他拉泊芬鈉的近紅外光響應(yīng)脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性作用，光照組細(xì)胞分別存活率＜ 5%和(1.7±2.5)%；無(wú)光照組細(xì)胞分別存活率＜90%和(94.9±23.1)%。

Luo等[10]以卟啉磷脂(porphyrin-phospholipid，PoP)、不飽和磷脂DOPC、DSPC、膽固醇等為原料制備的一種NIR響應(yīng)脂質(zhì)體，以DOX為模型藥物。在665 nm近紅外光照射下研究脂質(zhì)體的響應(yīng)釋放，當(dāng)DOPC摩爾含量為2%時(shí)，DOX釋放50%所需要時(shí)間僅為61 s，比不含DOPC的脂質(zhì)體快11.6倍。增加DOPC含量可促使DOX更快釋放，當(dāng)DOPC含量達(dá)到5%，DOX釋放出50%僅需43 s。磷脂的飽和度越高越能更快的促進(jìn)釋放，在近紅外光下，分別含18∶2(cis)PC(4個(gè)不飽和鍵)、 18∶1(cis)PC(2個(gè)不飽和鍵)的不同脂質(zhì)體釋放50%DOX所需時(shí)間依次為31、46 s。作者采用雙腫瘤模型評(píng)估光療誘導(dǎo)DOX積累，經(jīng)近紅外光照射后，DOX在光照組腫瘤部位積累量是非光照組的5.6倍。作者利用載MIA PaCa-2荷瘤小鼠評(píng)價(jià)脂質(zhì)體抗腫瘤效果，在給予6 mg/kg注射劑量后，光照組(DOX-POP+laser)明顯優(yōu)于無(wú)光照組(DOXPoP alone)，兩組小鼠的中位存活天數(shù)分別為80.5、22.5 d，P＜0.001。

Zhao等[25]報(bào)道了一種由近紅外(NIR)激活，同時(shí)包載奧沙利鉑羧酸(HOC)和Fe3O4的1O2響應(yīng)型脂質(zhì)體(RALP @HOC @ Fe3O4)。在該脂質(zhì)體處方中，甲基菁染料(cypate)作為NIR響應(yīng)光敏劑，其與聚乙二醇通過(guò)對(duì)酮縮硫醇基團(tuán)接合形成聚合物mPEG-TK-Cy，在808 nm激光照射下可促進(jìn)1O2的產(chǎn)生。蛋黃L-α磷脂酰膽堿(egg-yolkL-aphosphatidylcholine，EPC)的脂鏈中包含的不飽和碳碳雙鍵可被1O2氧化裂解。當(dāng)脂質(zhì)體通過(guò)EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織后，給予外界近紅外光照射，光敏劑激發(fā)產(chǎn)生的單態(tài)氧(1O)使EPC中不飽和雙鍵氧化，脂質(zhì)體雙層膜結(jié)構(gòu)通透性改變，釋放出奧沙利鉑羧酸和Fe3O4納米粒。奧沙利鉑羧酸能與谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為奧沙利鉑，同時(shí)促進(jìn)H2O2生成。Fe3O4納米粒中Fe2+與H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)生成羥基自由基(·OH)，這是一種在腫瘤治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用的ROS，它不僅可以促進(jìn)脂質(zhì)體裂解，還可對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA造成嚴(yán)重?fù)p傷，使抗腫瘤效果得到增強(qiáng)。

此外，當(dāng)光響應(yīng)ROS脂質(zhì)體處方中沒(méi)有加入不飽和磷脂時(shí)，由光敏劑激發(fā)產(chǎn)生的1O2可通過(guò)氧化膽固醇改變脂質(zhì)膜的通透性，促進(jìn)包封藥物的釋放[10]。Carter等[26]制備了一種以鞘磷脂(SPM)、pyro-lipid(卟啉磷脂的一種，化學(xué)鍵合pyropheophorbide-a)、膽固醇為原料的光響應(yīng)ROS脂質(zhì)體，包載藥物為伊立替康(IRT)。作者在血清液中研究其藥物釋放特性，結(jié)果表明經(jīng)665 nm近紅外光照射后，脂質(zhì)體在60 s內(nèi)就可釋放出大部分IRT。當(dāng)給予激光照射時(shí)釋放開(kāi)始，照射停止時(shí)釋放終止。進(jìn)一步的裸鼠單耳熒光成像也證明了IRT的快速釋放與激光照射處理有關(guān)。在隨后進(jìn)行以荷PaCa-2異種移植瘤裸鼠為模型的抗腫瘤研究中，他們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(IRT-PoP+laser)治愈率可達(dá)80%，其余各組中位存活天數(shù)分別為29(IRT-PoP alone)、42(empty PoP+laser)、18(free IRT)、17(Saline)d。

5 結(jié)語(yǔ)

脂質(zhì)體因能提高包載藥物的溶解度，減少不良反應(yīng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，在眾多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在治療實(shí)體瘤的藥物研究中，因?yàn)镋PR效應(yīng)的存在，脂質(zhì)體可以作為良好的藥物載體，促進(jìn)藥物在腫瘤部位積聚。尤其是結(jié)合腫瘤特殊微環(huán)境和外界刺激而進(jìn)行的刺激響應(yīng)型脂質(zhì)體的研究，可獲得更加安全、高效的治療效果，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的精準(zhǔn)可控釋放。ROS響應(yīng)型脂質(zhì)體可實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的集聚，并對(duì)腫瘤組織內(nèi)部ROS高水平表達(dá)做出響應(yīng)，使藥物在發(fā)病局部釋放。與光動(dòng)力療法結(jié)合后，可以進(jìn)一步克服微環(huán)境中ROS表達(dá)水平不可控的特性，結(jié)合光具有的時(shí)空靈活性，可以快速高效的實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。盡管如此，脂質(zhì)體并不會(huì)因?yàn)镋PR效應(yīng)而完全進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮作用，循環(huán)至人體其他部位的脂質(zhì)體可能存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。不飽和磷脂在空氣中容易被氧化，因而對(duì)制備所得脂質(zhì)體的保存條件要求較高。光敏劑在高劑量時(shí)在激光照射下具有光毒性，如果不能快速清除，當(dāng)暴露在陽(yáng)光下時(shí)，光毒性還可能長(zhǎng)時(shí)間存在，因此光敏劑的劑量調(diào)整也是需要關(guān)注的重要環(huán)節(jié)。