非水毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定消毒劑、個(gè)人護(hù)理品及藥膏中三氯生、三氯卡班和對(duì)氯間二甲苯酚

江若可,丁曉靜*(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100069;2.北京市疾病預(yù)防控制中心,北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100013)

隨著社會(huì)的發(fā)展,人們利用消毒劑和抗/抑菌劑預(yù)防傳染病的意識(shí)越來(lái)越強(qiáng),該類產(chǎn)品的產(chǎn)量及種類迅速增多,消毒和抗/抑菌效果主要通過(guò)添加抗/抑菌類消毒有效成分實(shí)現(xiàn)[1]。我國(guó)消毒劑原料有效成分清單[2]列舉的85種成分中,對(duì)氯間二甲苯酚(p-chloro-m-xylenol,PCMX)、三氯生(triclosan,TCS)和三氯卡班(triclocarban,TCC)這3種成分(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)作為高效、廣譜的消毒有效成分被允許應(yīng)用于消毒產(chǎn)品中,同時(shí)也允許用于個(gè)人護(hù)理用品如化妝品[3]中,TCS還可用于藥膏[4]中。清單[2]中還推薦了每種有效成分的使用范圍?；瘖y品中TCS和TCC的最大允許使用量分別為0.3%和0.2%[3]。國(guó)標(biāo)[5]還規(guī)定消毒產(chǎn)品標(biāo)簽中有效成分應(yīng)標(biāo)注其含量范圍,并分別制定了這3種有效成分測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[6,7],以方便監(jiān)督抽檢和消毒效果評(píng)價(jià)。

圖1 三氯生、對(duì)氯間二甲苯酚、三氯卡班的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of triclosan (TCS),p-chloro-m-xylenol (PCMX) and triclocarban (TCC)

近年來(lái),我國(guó)已經(jīng)把消毒產(chǎn)品評(píng)審注冊(cè)改革為安全評(píng)價(jià)備案,產(chǎn)品質(zhì)量的保證主要依靠市場(chǎng)監(jiān)管[8],而有效成分的含量檢測(cè)是常用的監(jiān)督手段之一。但部分消毒產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)含量及檢測(cè)含量均超過(guò)規(guī)定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[9]。按目前國(guó)標(biāo)方法對(duì)上述3種消毒有效成分進(jìn)行檢測(cè)時(shí),經(jīng)常出現(xiàn)測(cè)定結(jié)果與標(biāo)識(shí)含量不符的現(xiàn)象,故迫切需要應(yīng)用毛細(xì)管電泳建立與國(guó)標(biāo)方法原理完全不同的新方法,從而確證國(guó)標(biāo)方法的結(jié)果。此外,國(guó)標(biāo)方法需使用3種色譜條件且消耗大量對(duì)操作者和環(huán)境不友好的有機(jī)試劑,因此有必要建立一種色譜條件下能同時(shí)分析這3種消毒有效成分，且有機(jī)試劑消耗更少的分析方法。

本實(shí)驗(yàn)室曾以膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)模式實(shí)現(xiàn)了PCMX和TCS的同時(shí)分析[10]。有研究表明:對(duì)于溶解性不好的目標(biāo)物,與其使用大量的表面活性劑,不如使用非水毛細(xì)管電泳法(nonaqueous capillary electrophoresis,NACE),可能會(huì)獲得類似甚至更好的分離效果[11]。鑒于TCC不溶于水,若實(shí)現(xiàn)上述3種消毒有效成分的同時(shí)分析,只能考慮使用非水毛細(xì)管電泳模式[12]。NACE分析抗抑郁藥物[13]和手性藥物[14]已有報(bào)道。Buglione等[15]研究了電解質(zhì)及有機(jī)溶劑對(duì)NACE-非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)消毒有效成分季銨鹽的影響,但未用于實(shí)際樣品的測(cè)定。Ma等[16]建立了NACE分析個(gè)人護(hù)理品中TCS的方法,但未見(jiàn)個(gè)人護(hù)理品及消毒產(chǎn)品中TCS、TCC、PCMX同時(shí)測(cè)定的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。盡管還未見(jiàn)將以上3種消毒有效成分復(fù)配在一起的個(gè)人護(hù)理品、消毒產(chǎn)品及藥膏,但已有產(chǎn)品標(biāo)識(shí)其同時(shí)含TCS和PCMX,故本文建立了同時(shí)分析以上3種消毒有效成分的NACE新方法,并將該研究所建新方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的高效液相色譜法(HPLC)以及本實(shí)驗(yàn)室以前建立的MEKC法相比較。NACE法極大地減少了有機(jī)溶劑的使用,能夠準(zhǔn)確測(cè)定31件樣品中上述3種消毒有效成分,且樣品前處理簡(jiǎn)單,非常適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

PA 800 plus型毛細(xì)管電泳儀(配有二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Beckman Coulter公司);Waters 2695-2996型液相色譜儀(配有二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司);內(nèi)徑50 μm未涂層熔融石英毛細(xì)管(河北永年瑞灃色譜器件有限公司);Milli-Elix/RiOs型超純水器(美國(guó)Millipore公司);Vortex-Genie 2渦旋混合器(美國(guó)Scientific Industries公司);SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Mettler Toledo XPE 105電子天平(分度值:1 mg,瑞士梅特勒-托利多公司)。Kromasil 100-5-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,瑞典AkzoNobel公司)。

氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純)購(gòu)自北京化工廠;十水合四硼酸鈉(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚乙二醇8000(PEG 8000)和聚乙二醇10000(PEG 10000)均購(gòu)自上海化學(xué)試劑總廠;十二烷基三甲基溴化銨(DTAB,純度>99.0%)、十四烷基三甲基氯化銨(TTAC,純度>99.0%)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,純度>99.0%)均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。三氯卡班(純度>98.0%)購(gòu)自上海阿拉丁公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、聚乙二醇20000(PEG 20000)、三氯生(純度>97.0%)和對(duì)氯間二甲苯酚(純度>99.0%)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

樣品:共31件,其中1～10號(hào)標(biāo)示含TCS(7種消毒洗手液、1種消毒凝膠、1種抑菌乳膏和1種藥膏);11～18號(hào)標(biāo)示含TCC(1種消毒洗手液、1種嬰兒皂、2種嬰兒爽身粉和4種乳霜);19～31號(hào)標(biāo)示含PCMX(5種消毒洗手液、8種消毒液);20號(hào)樣品同時(shí)含PCMX和TCS兩種成分。消毒劑空白樣品由生產(chǎn)廠家提供,其余樣品均購(gòu)于淘寶和京東電商平臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1溶液配制

TCS、TCC和PCMX標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:分別準(zhǔn)確稱取TCS 100.0 mg、TCC 40.0 mg、PCMX 100.0 mg,分別置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解、稀釋、定容,渦旋混勻,制得質(zhì)量濃度分別為10 g/L TCS、4 g/L TCC和10 g/L PCMX的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

TCS、TCC、PCMX混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確吸取3種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用樣品介質(zhì)(含5 g/L聚乙二醇20000的甲醇-乙腈(50∶50,v/v))稀釋得到質(zhì)量濃度均為1 g/L的3種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

TCS、TCC、PCMX混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制:分別準(zhǔn)確吸取適量3種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用樣品介質(zhì)稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為:1、10、20、40、60、80和100 mg/L。

1.2.2樣品前處理

非固體樣品:一般吸取不少于0.2 mL液體樣品或稱量不少于0.2 g凝膠樣品,置于10 mL塑料離心管中,用樣品介質(zhì)稀釋5或10倍,渦旋混勻,超聲20 min,冷卻后,根據(jù)實(shí)際樣品中目標(biāo)物的標(biāo)示含量,稀釋至約20 mg/L，進(jìn)樣。

固體樣品:嬰兒皂樣品棄去表層(0.2 cm厚),由潔凈手術(shù)刀片刮成碎屑進(jìn)行稱量;痱子粉、爽身粉和其他膏狀樣品:直接稱取不少于0.2 g樣品,置于10 mL塑料離心管中,用樣品介質(zhì)稀釋5或10倍,渦旋混勻(對(duì)于難溶膏體可在離心管中加入2顆直徑約5 mm干凈玻璃珠輔助混勻溶解),超聲20 min,冷卻后,根據(jù)實(shí)際樣品中目標(biāo)物的標(biāo)示含量,稀釋至約20 mg/L，進(jìn)樣。

1.2.3非水毛細(xì)管電泳條件

未涂層熔融石英毛細(xì)管(50.0 μm×20 cm,總長(zhǎng)度30.2 cm);分離電壓:-12 kV;檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm;進(jìn)樣時(shí)間:4 s;進(jìn)樣壓力:3.448 kPa;分離溫度:25 ℃;分離緩沖溶液:含14 mmol/L硼砂、2 g/L PEG 20000和0.5 mmol/L DTAB的甲醇溶液。

新裝毛細(xì)管分別用1 mol/L NaOH沖洗60 min,超純水沖洗2 min,分離緩沖溶液沖洗5 min,兩次運(yùn)行之間每次進(jìn)樣前僅用分離緩沖溶液沖洗5 min,保證校正峰面積和遷移時(shí)間的重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用毛細(xì)管電泳儀配備的二極管陣列檢測(cè)器對(duì)TCS、TCC和PCMX 3種消毒有效成分進(jìn)行掃描,TCS在198 nm和280 nm處獲得最大吸收峰;TCC在200 nm和264 nm處獲得最大吸收峰;PCMX在220 nm和280 nm處獲得最大吸收峰。3種消毒有效成分在214 nm均可獲得較高靈敏度(見(jiàn)圖2),為實(shí)現(xiàn)3者的同時(shí)測(cè)定,盡可能獲得高靈敏度同時(shí)避免基質(zhì)干擾,因此選擇214 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)3種消毒有效成分檢測(cè)靈敏度的影響Fig.2 Effects of detection wavelengths on the detection sensitivity of the three disinfection components

2.2 分離緩沖液及其濃度的選擇

2.2.1分離緩沖溶液中有機(jī)溶劑及鹽種類的選擇

NACE最常用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙腈或兩者的混合溶液[17]。甲醇因與弱酸鹽如乙酸鹽和硼酸鹽兼容性好,而成為本研究的首選。硼酸在水溶液中的pKa為9.24[18],在甲醇中一般會(huì)增加2～3個(gè)pKa單位,使TCS和PCMX中的羥基解離而帶負(fù)電,故本研究選用硼砂,并對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。

NACE可增加分離的選擇性[19],所選用純甲醇的電導(dǎo)率僅為1.3 μS/cm[20],需加入無(wú)機(jī)鹽增加其導(dǎo)電性。保持分離緩沖溶液中2 g/L PEG 20000和0.5 mmol/L DTAB的含量不變,研究了6、8、10、12、14及16 mmol/L硼砂對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分分離的影響(如圖3所示)。隨著硼砂濃度的增加,TCS與TCC的分離度逐漸減小,TCC與PCMX的分離度逐漸增加,PCMX與其后系統(tǒng)峰的分離度逐漸增加,遷移時(shí)間逐漸縮短,當(dāng)硼砂濃度大于14 mmol/L時(shí),工作電流增加,焦耳熱也相應(yīng)增加,毛細(xì)管內(nèi)的甲醇溶液沸點(diǎn)低(65 ℃)而易沸騰,導(dǎo)致工作電流中斷,無(wú)法運(yùn)行分離程序。此外,各峰分離度基本不再增加。為保證分離度且分離時(shí)間盡量短,靈敏度較高且較穩(wěn)定,優(yōu)化得到最佳硼砂濃度為14 mmol/L。

圖3 硼砂濃度對(duì)3種消毒有效成分分離的影響Fig.3 Effects of Na2B4O7 concentrations on the separation of the three disinfection components Running buffer:2 g/L PEG 20000 and 0.5 mmol/L DTAB in methanol;sample solution:5 g/L PEG 20000 in methanol-acetonitrile (50∶50,v/v).

2.2.2分離緩沖溶液中電滲流反轉(zhuǎn)劑及濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)初期,參考文獻(xiàn)[16]的分離條件,以含14 mmol/L硼砂的甲醇為分離緩沖溶液,甲醇的解離常數(shù)pKauto為16.91[21],甲醇與硼砂的聯(lián)合作用,使得毛細(xì)管內(nèi)壁帶負(fù)電,導(dǎo)致TCS和PCMX的酚羥基解離也帶負(fù)電。對(duì)未涂層石英毛細(xì)管,當(dāng)分離緩沖溶液pH>6時(shí),電滲流(electro-osmotic flow,EOF)大于目標(biāo)物的淌度,故無(wú)論待分析物是否帶電,均能遷移到檢測(cè)窗口而被檢測(cè)[22]。然而帶負(fù)電的TCS和PCMX與EOF的運(yùn)動(dòng)方向相反,無(wú)法在合理的30 min內(nèi)遷移到檢測(cè)窗口。當(dāng)施加正向電壓進(jìn)樣分離時(shí),未觀察到任何峰,將電極反向進(jìn)行加壓分離,則出現(xiàn)3個(gè)峰,出峰順序?yàn)門CS、TCC、PCMX。然而該條件出峰的重復(fù)性并不理想。

圖4 電滲流反轉(zhuǎn)劑對(duì)3種消毒有效成分的影響Fig.4 Effects of electro-osmotic flow (EOF) modifier on the separation of the three disinfection components CTAB:hexadecyl trimethyl ammonium bromide;TTAC:tetradecyl trimethyl ammonium bromide;DTAB:dodecyl trimethyl ammonium bromide. Running buffer:0.5 mmol/L EOF modifier,14 mmol/L sodium tetraborate and 2 g/L PEG 20000 in methanol.

0.5 mmol/L CTAB足以使EOF反轉(zhuǎn)且得到穩(wěn)定EOF[23],故往僅含14 mmol/L硼砂和2 g/L PEG 20000的甲醇分離緩沖溶液中加入0.5 mmol/L CTAB,出峰的重復(fù)性得到極大改善,NACE中CTAB的銨陽(yáng)離子依然優(yōu)先吸附到管壁上,導(dǎo)致EOF發(fā)生反轉(zhuǎn)并得到穩(wěn)定EOF,與文獻(xiàn)[24]報(bào)道相一致。從CTAB的實(shí)驗(yàn)效果得到啟發(fā),保持14 mmol/L硼砂和2 g/L PEG 20000不變,嘗試并考察了使用其他兩種表面活性劑TTAC和DTAB并與CTAB實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行比較,分別研究了濃度均為0.5 mmol/L的CTAB、TTAC和DTAB對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒劑有效成分分離的影響(如圖4所示),3種表面活性劑烷基鏈長(zhǎng)為CTAB>TTAC>DTAB,隨烷基鏈長(zhǎng)的減小,3種消毒劑有效成分的靈敏度、分離度和遷移時(shí)間皆有所變化,使用DTAB作為EOF反轉(zhuǎn)劑時(shí)雖然靈敏度略低,但分離度尚可,遷移時(shí)間最短,足以滿足定量要求,本研究最終選擇DTAB作為最佳EOF反轉(zhuǎn)劑。

保持14 mmol/L硼砂和2 g/L PEG 20000不變,分別研究了0.3、0.5和0.7 mmol/L DTAB對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分分離的影響(見(jiàn)圖5):當(dāng)DTAB濃度為0.5 mmol/L時(shí)靈敏度最高,分離度最大,遷移時(shí)間最短。綜合考慮,DTAB最佳濃度為0.5 mmol/L。

圖5 DTAB濃度對(duì)3種消毒有效成分分離的影響Fig.5 Effects of the concentrations of DTAB on the separation of three disinfection components Running buffer:14 mmol/L sodium tetraborate and 2 g/L PEG 20000 in methanol.

2.2.3分離緩沖溶液中PEG相對(duì)分子質(zhì)量及濃度的選擇

TCS和PCMX為酚類物質(zhì),極易吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁,PEG類高分子聚合物已被證明具有良好的親水性和抑制吸附的能力[25]。當(dāng)分離緩沖溶液中僅含14 mmol/L硼砂和0.5 mmol/L DTAB的甲醇溶液時(shí),各峰遷移時(shí)間的重復(fù)性不好。有文獻(xiàn)報(bào)道PEG 20000涂層的毛細(xì)管可提高NACE中遷移時(shí)間的重復(fù)性[26]。本研究將PEG 20000作為動(dòng)態(tài)涂層,以期獲得與涂層管一樣的抑制吸附的效果。保持14 mmol/L硼砂和0.5 mmol/L DTAB不變,分別研究了2 g/L相對(duì)分子質(zhì)量分別為8 000、10 000和20 000的PEG對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分分離的影響(如圖6所示):隨著PEG相對(duì)分子質(zhì)量的增加,靈敏度和分離度先逐漸減少,然后又逐漸增加,遷移時(shí)間逐漸減少。綜合考慮,最終選擇PEG 20000作為吸附抑制劑。

圖6 PEG相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)3種消毒有效成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的影響Fig.6 Effects of polyethylene glycol (PEG) relative molecular mass on the separation of the three disinfection components Running buffer:14 mmol/L sodium tetraborate and 0.5 mmol/L DTAB in methanol.

保持14 mmol/L硼砂和0.5 mmol/L DTAB不變,分別研究了PEG 20000不同質(zhì)量濃度(2、5和8 g/L)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分分離的影響(見(jiàn)圖7):隨著PEG 20000質(zhì)量濃度的增加,靈敏度下降,分離度逐漸減少,遷移時(shí)間逐漸增加。綜合考慮,2 g/L PEG 20000為最佳選擇。

2.3 分離電壓的選擇

本實(shí)驗(yàn)所用分離緩沖液中硼砂最佳濃度為14 mmol/L,限制了過(guò)高電壓的使用。保持石英毛細(xì)管長(zhǎng)和內(nèi)徑不變,比較了-8、-10、-12、-14和-16 kV分離電壓對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分分離的影響:隨著分離電壓的增加,遷移時(shí)間縮短、峰高增加,但過(guò)高的電壓使工作電流增加,產(chǎn)生過(guò)多的焦耳熱,易造成工作電流中斷。當(dāng)電壓為-12 kV時(shí),電流僅為12 μA,且較為穩(wěn)定,結(jié)合靈敏度、分離度、重復(fù)性考慮,-12 kV為最佳選擇。

2.4 樣品介質(zhì)的選擇

樣品介質(zhì)在準(zhǔn)確定量中發(fā)揮極為重要的作用:合適的樣品介質(zhì)既可增加分離及定量的重復(fù)性,還可增加樣品的溶解度和檢測(cè)靈敏度。鑒于TCC不溶于水,欲實(shí)現(xiàn)上述3種消毒有效成分的同時(shí)分離,必須解決TCC的溶解性問(wèn)題。

2.4.1樣品介質(zhì)中有機(jī)溶劑的選擇

TCS與TCC的正辛醇/水分配系數(shù)(logKow)分別為4.8和4.9,屬于親脂性較強(qiáng)的化合物[27]。TCC不溶于水,但溶于烷醇酰胺、脂肪醇聚氧乙烯醚等非離子表面活性劑[16]。但這些溶劑均為不常用有機(jī)溶劑,故實(shí)驗(yàn)初期首選常用的甲醇、乙醇和乙腈溶解這3種消毒有效成分。PCMX和TCS均易溶解在這3種常用有機(jī)溶劑中,可配制成10 g/L儲(chǔ)備液,室溫放置無(wú)析出。TCC在甲醇中的溶解性最好,可配制成4 g/L儲(chǔ)備液,室溫放置無(wú)析出,將4 g/L TCC通過(guò)稀釋制備成100 mg/L或10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí),只要樣品介質(zhì)中含有水,則導(dǎo)致TCC析出,欲實(shí)現(xiàn)3種消毒有效成分的同時(shí)分離,標(biāo)準(zhǔn)工作液必須用純有機(jī)溶劑稀釋。

有機(jī)溶劑組成是影響遷移時(shí)間、靈敏度和峰形的關(guān)鍵因素之一,當(dāng)使用分離緩沖液作為樣品介質(zhì)時(shí),樣品介質(zhì)與分離緩沖液之間無(wú)電導(dǎo)差異,導(dǎo)致峰展寬[16],不利于準(zhǔn)確定量。往樣品介質(zhì)中添加一定比例的乙腈,測(cè)試了4個(gè)不同體積比的甲醇和乙腈(80∶20、60∶40、50∶50和40∶60)對(duì)3種消毒有效成分分離的影響:當(dāng)100%甲醇時(shí),3種消毒有效成分峰形和靈敏度均不佳,使用100%乙腈時(shí),峰形雖有所改善,但靈敏度較低;80∶20的比例易導(dǎo)致造成電流異?；蛑袛?60∶40的比例則導(dǎo)致各峰靈敏度降低;40∶60比例使3種消毒有效成分無(wú)法完全分離,僅得到TCS和TCC這兩種有效成分的峰;50∶50比例時(shí),則3種消毒有效成分峰形和靈敏度好,遷移時(shí)間短。故甲醇與乙腈的最佳體積比為50∶50。

圖8 樣品介質(zhì)中PEG 20000質(zhì)量濃度對(duì)3種消毒有效成分分離的影響Fig.8 Effects of the mass concentration of PEG 20000 in the sample medium on the separation of the three disinfection components Running buffer:14 mmol/L sodium tetraborate,2 g/L PEG 20000 and 0.5 mmol/L DTAB in methanol.

2.4.2樣品介質(zhì)中PEG 20000含量的優(yōu)化

受分離緩沖液中添加PEG 20000以抑制3種消毒有效成分在管壁吸附的啟發(fā),在樣品介質(zhì)中添加PEG 20000也將使3種消毒有效成分在管內(nèi)壁的吸附降低,各峰靈敏度增加,實(shí)驗(yàn)條件更加穩(wěn)定,定量重復(fù)性更好。研究了0、2、5及10 g/L PEG 20000對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分分離的影響(如圖8所示):當(dāng)PEG 20000質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí),靈敏度最高,分離度尚可,遷移時(shí)間較短,綜合考慮,5 g/L PEG 20000為最佳選擇。

綜上,經(jīng)過(guò)對(duì)各關(guān)鍵因素的優(yōu)化,得到最佳電泳條件,在此最佳條件下對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3種消毒有效成分進(jìn)行分離(見(jiàn)圖9):按《美國(guó)藥典》方法計(jì)算各峰的理論塔板數(shù)(單次計(jì)算)分別為55 431、42 145、34 516;分離度(單次計(jì)算)分別為10.323、7.342,遠(yuǎn)高于基線分離時(shí)的1.5的分離度,故該法可以對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析。

圖9 最佳電泳條件下3種消毒有效成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖Fig.9 Electrophoregram of the three disinfection components in the mixed standard solution under the optimized electrophoretic conditions

表1 3種消毒有效成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the three disinfection components

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在上述最佳電泳條件下,將TCS、TCC和PCMX的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用樣品介質(zhì)逐級(jí)稀釋,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為1、10、20、40、60、80和100 mg/L,依次進(jìn)樣分析,外標(biāo)法定量,校正峰面積(Y,峰面積除以遷移時(shí)間)與質(zhì)量濃度(X,mg/L)具有良好線性關(guān)系。線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD,信噪比為3)及定量限(LOQ,信噪比為10)見(jiàn)表1。

2.5.2儀器精密度

分別在4.00、40.0和80.0 mg/L 3個(gè)水平下進(jìn)行儀器精密度試驗(yàn),將配制好的低、中、高3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳NACE條件下分別連續(xù)進(jìn)樣7次進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算遷移時(shí)間和校正峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),遷移時(shí)間重復(fù)性小于1.5%,校正峰面積重復(fù)性小于5%。

2.5.3方法精密度

取20 mL僅含有PCMX的實(shí)際樣品中分別加入60 mg TCS和100 mg TCC,制成均含3種消毒有效成分的樣品,進(jìn)行方法精密度實(shí)驗(yàn),考察方法的適用性。平行制備7份樣品,根據(jù)1.2.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理。在最佳NACE條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算測(cè)定3種消毒有效成分含量的RSD,考察方法的日內(nèi)精密度;按照上述方法對(duì)此自制樣品連續(xù)測(cè)定7天,每日平行測(cè)定3次,計(jì)算測(cè)定3種消毒有效成分含量的RSD,考察方法的日間精密度,TCS、TCC、PCMX含量的日內(nèi)精密度分別為1.7%、1.3%和2.3%,日間精密度分別為3.3%、4.0%和2.2%。

2.5.4加標(biāo)回收率

對(duì)空白消毒劑樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平為4.00、40.0和80.0 mg/L,每個(gè)加標(biāo)水平平行處理7份,3種消毒有效成分的加標(biāo)回收率見(jiàn)表2。

表2 3種消毒有效成分在低、中、高3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率(n=7)Table 2 Recoveries of the three disinfection components spiked at three levels (n=7)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

按1.2.2節(jié)所述樣品前處理方法,對(duì)1～31號(hào)消毒樣品進(jìn)行NACE測(cè)定,每件樣品平行處理3份。用本實(shí)驗(yàn)室之前建立的MEKC法[10]對(duì)含TCS、PCMX的23件樣品進(jìn)行測(cè)定,并分別參照國(guó)標(biāo)方法GB/T 27947-2020和GB/T 34856-2017對(duì)1～31號(hào)樣品中的PCMX和TCS[6]、TCC[7]進(jìn)行測(cè)定,并進(jìn)行了部分條件優(yōu)化。3種消毒有效成分的分離測(cè)定均使用同一根色譜柱。流動(dòng)相均為甲醇-水,比例分別為70∶30、80∶20和75∶25(v/v)。流速均為1.0 mL/min;進(jìn)樣量均為10 μL;柱溫均為30 ℃。PCMX及TCS的檢測(cè)波長(zhǎng)均為280 nm;TCC檢測(cè)波長(zhǎng)為264 nm。3種方法的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25對(duì)TCS和PCMX的3種方法、TCC兩種方法的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,P分別為0.817和0.974,3種或2種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異,證明了所建NACE方法的準(zhǔn)確性。其中1號(hào)樣品因存在較明顯的基質(zhì)干擾,無(wú)法用MEKC進(jìn)行準(zhǔn)確定量,而NACE對(duì)31件樣品分析中均未見(jiàn)干擾,證明NACE的選擇性高于HPLC和MEKC,利于得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

表3 實(shí)際樣品中3種消毒有效成分的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determined results of three disinfection components in real samples

3 結(jié)論

本研究建立了消毒劑、個(gè)人護(hù)理品及藥膏中TCS、TCC和PCMX同時(shí)分析的NACE新方法,對(duì)分離緩沖溶液及樣品介質(zhì)進(jìn)行了充分優(yōu)化。該法選擇性好,樣品前處理簡(jiǎn)單,僅需稀釋即可直接進(jìn)樣,得到的電泳圖無(wú)干擾。與國(guó)標(biāo)方法相比,極大地減少了有機(jī)溶劑的消耗和檢測(cè)成本,是國(guó)標(biāo)方法的有益補(bǔ)充,希望將來(lái)能納入國(guó)標(biāo)方法,發(fā)揮更大作用。此外,檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)識(shí)含量不符的情況依然存在,給消毒安全帶來(lái)隱患,需加強(qiáng)消毒產(chǎn)品的監(jiān)管。