按揉承山穴對CCI 模型大鼠機械足反射閾值及坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)影響研究

王建珠，鮑云帆，楊小存，田志剛，唐燕定，郝 鋒*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 南京 210093

疼痛是臨床中多種疾病共有的癥狀之一。 2020年，國際疼痛研究學(xué)會（International Association for the Study of Pain, IASP）將疼痛定義修訂為：“疼痛是一種與實際或潛在的組織損傷相關(guān)的不愉快的感覺和情緒情感體驗，或與此相似的經(jīng)歷。 ”[1-2]神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是常見的一種疼痛，由外傷或疾病引起，造成外周神經(jīng)損傷，患者會表現(xiàn)出自發(fā)性疼痛、感覺異常、痛覺過敏等癥狀體征，且疼痛感明顯、持續(xù)時間長[3]，是人類最難治療的疾病之一。 神經(jīng)病理性疼痛作為推拿臨床的常見病種，近年來逐漸成為推拿基礎(chǔ)研究的熱點之一[4-5]，但推拿手法的鎮(zhèn)痛機制仍有待深入研究。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，推拿對坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI）模型大鼠的疼痛有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并改善其后肢步態(tài)，延緩腓腸肌的萎縮[6-7]。神經(jīng)源性肌肉萎縮是常見的肌萎縮原因之一，當(dāng)運動神經(jīng)元或者神經(jīng)纖維損傷時，它們所支配的肌肉就會發(fā)生以萎縮為主的改變[8]。 本研究擬觀察推拿按揉法（下文簡稱按揉法）在承山穴操作對CCI 模型大鼠機械足反射閾值（paw withdrawal threshold, PWT）及坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)的影響，為推拿手法的鎮(zhèn)痛作用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠共24 只，體質(zhì)量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供[實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005]。分籠成對飼養(yǎng)，正常飲水，室溫（22±1） ℃，濕度40%～50%，12 h/12 h晝夜節(jié)律交替。 飼養(yǎng)地點為復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)中心，清潔級。 動物保護及動物使用規(guī)范均按照國際疼痛研究學(xué)會的規(guī)定嚴(yán)格進行。

1.2 主要藥品和儀器

大鼠推拿操作固定裝置（自制）；剃毛器（型號：HP6341/00，美國Philips 公司）；醫(yī)用縫合針（型號：4-0 角針1/2，上海漢康醫(yī)療器械有限公司）；可吸收外科縫線（型號：4-0，山東博達醫(yī)療用品有限公司）；von-Frey 纖毛（型號：NC12775，美國Stolting 公司）；石蠟切片機（型號：RM2415，德國Leica 公司）；切片漂烘溫控儀（型號：QP-B1，安徽電力科學(xué)研究所）；電子光鏡（型號：CX-31，日本Olympus 公司）；無線觸覺力測量指套（型號：Grip 系統(tǒng)，美國Finger TPS公司）。

2 方法

2.1 動物分組

將24 只SD 雄性大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組（N 組）、模型組（M 組）和按揉承山穴組（T組），每組8 只。

2.2 CCI 模型制備

參照CCI 大鼠模型制備方法[9]進行造模，于大鼠右后肢進行造模手術(shù)。 具體操作步驟[10]：（1）使用戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，待大鼠深度麻醉后，剔除大鼠右后肢手術(shù)部位的鼠毛；（2）深度麻醉成功后將大鼠側(cè)臥位，用手術(shù)鑷將大鼠舌頭拉出口腔防止窒息，用聚維酮碘及乙醇對手術(shù)部位皮膚進行消毒；（3）用手術(shù)剪在大鼠右股骨中段后方約1 cm 處，以平行于股骨的方向切開皮膚、暴露肌肉，再用尖頭彎鉗經(jīng)過股二頭肌間隙對肌肉進行鈍性分離，直至可見坐骨神經(jīng)[11]，接著用實驗動物手術(shù)擴張器在切口處打開手術(shù)視野，用玻璃分針將坐骨神經(jīng)和粘連的軟組織輕柔分離；（4）在坐骨神經(jīng)分成三支前的神經(jīng)主干部位游離約7 mm 左右的坐骨神經(jīng)，在離坐骨神經(jīng)分叉處上方約2 mm 處起，用生理鹽水浸泡過12 h 的鉻制羊腸線（規(guī)格為4-0）結(jié)扎坐骨神經(jīng)，結(jié)扎線間隔約1 mm，共扎3 道，結(jié)扎時應(yīng)隨時觀察結(jié)扎線的松緊度，保證坐骨神經(jīng)的血供，結(jié)扎的松緊度以打結(jié)時大鼠后肢肌肉出現(xiàn)輕微抽動并且線結(jié)能在游離出的坐骨神經(jīng)上輕微滑動為宜；（5）結(jié)扎完畢后用生理鹽水進行局部沖洗，逐層縫合手術(shù)部位的肌肉及皮膚，并對模型大鼠用硫酸阿米卡星（10 mg/kg）進行預(yù)防性腹腔注射，防止發(fā)生感染；（6）術(shù)后大鼠用紅外燈保暖處理，直至大鼠恢復(fù)知覺。 術(shù)后模型大鼠成對飼養(yǎng)，自由飲水和進食。

2.3 推拿干預(yù)方法

對CCI 模型大鼠右后肢承山穴行拇指按揉法[12]干預(yù)，10 min/次，1 次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。 手法操作時，操作者右手拇指戴上由美國Finger TPS 公司生產(chǎn)的無線觸覺力指套，按揉法操作的干預(yù)參數(shù)設(shè)定壓力為5 N，頻率為2 Hz。

2.4 各組動物的處理

N 組不作特殊處理；M 組僅進行CCI 模型造模；T 組行CCI 模型造模術(shù)，并于術(shù)后第4 天起對模型大鼠右后肢承山穴行拇指按揉法干預(yù)，方法見“2.3 推拿干預(yù)方法”。

2.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

實驗進行階段，分別于造模前、造模后1 d、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d 觀察各組大鼠PWT。待實驗干預(yù)結(jié)束后，對各組實驗動物取材，將各組大鼠坐骨神經(jīng)行HE 染色后在電子光鏡下觀察神經(jīng)纖維的變化。

2.5.1 PWT 測定 采用von-Frey 方法測試各組大鼠的PWT。 用不同粗細的纖毛刺激大鼠足底，能夠引起大鼠縮爪反應(yīng)的最小纖毛克數(shù)即為PWT[10，13]。將大鼠置于孔徑為正方形（規(guī)格為10 mm×10 mm）的金屬網(wǎng)格平臺，使用透明有機玻璃框架（規(guī)格為20 cm×20 cm×20 cm）將大鼠隔開，框架頂部蓋有預(yù)留直徑1 cm 透氣孔的有機玻璃蓋。正式測試前須將大鼠置于測試環(huán)境中連續(xù)適應(yīng)3 d。 正式測試時，大鼠需靜置于測試籠中30 min 以適應(yīng)環(huán)境，然后再開始測試[10]。測試方法：用1～26 g 不同等級的von-Frey 纖毛進行測試，由低刻等級逐級向高刻等級進行測試，測試時用von-Frey 纖毛刺激大鼠的右后肢足底心，加壓至纖毛彎曲至90°左右，同等壓力持續(xù)5 s，如果大鼠在5 s 內(nèi)出現(xiàn)縮足，記錄相應(yīng)等級克數(shù)為1個“+”，如未縮足，則記錄相應(yīng)等級克數(shù)為1 個“-”；每個von-Frey 纖毛克數(shù)等級測試5 次，每次測試間隔5 min，5 次測試中出現(xiàn)3 次大鼠縮足反應(yīng)（記作3 個“+”號），則停止向高一等級克數(shù)測試， 改為向低一等級克數(shù)重復(fù)測試，確定下一等級不出現(xiàn)3 個“+”號。 PWT 為首個出現(xiàn)3 個“+”的von-Frey 纖毛克數(shù)等級[10，14]。

2.5.2 HE 染色 （1）取材：用25%烏拉坦將大鼠深度麻醉后斷頭處死，并迅速將大鼠置于冰上進行取材。剪開局部皮膚，用手術(shù)剪在大鼠右股骨中段后方約1 cm 處，以平行于股骨的方向切開皮膚、暴露肌肉，再用尖頭彎鉗經(jīng)過股二頭肌間隙對肌肉進行鈍性分離[11]，暴露坐骨神經(jīng)，剝離包裹在坐骨神經(jīng)周圍的軟組織，迅速剪取結(jié)扎部位上方5～10 mm 長度的坐骨神經(jīng)，用生理鹽水沖洗，迅速置于裝有多聚甲醛的1.5 mL EP 管中進行后固定待用[10]。（2）包埋及切片：用石蠟對組織進行包埋，組織切片采用石蠟切片機。（3）HE 染色流程：修蠟塊、切片、展片、貼片、烤片（55～60 ℃）[10]，二甲苯2 min，100%無水乙醇2 min，95%乙醇2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min，Harrys 蘇木素1 min，自來水洗5 min，1%鹽水乙醇液分化30 s（分色），飽和碳酸鋰30 s，自來水2 min，蒸餾水2 min，0.5%伊紅5 min，蒸餾水速洗，95%乙醇2 min×2 次，100%乙醇2 min×2次，石碳酸二甲苯30 s，二甲苯3 min×3 次，中性封固樹膠。

3 結(jié)果

3.1 大鼠右后足PWT

與N 組相比，M 組大鼠的PWT 在造模后1 d出現(xiàn)下降（P＜0.05），3 d、7 d、10 d、14 d、17 d 持續(xù)降低（P＜0.01）并逐漸保持穩(wěn)定，說明CCI 模型大鼠在造模后出現(xiàn)了機械痛覺過敏。

與造模前相比，T 組大鼠的PWT 在造模后1 d出現(xiàn)了明顯下降，在3 d 達到最低（P＜0.01），說明CCI 模型大鼠造模成功。 從第4 天起行按揉承山穴操作干預(yù)，至14 d，PWT 與造模前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（7 d，P＜0.01；10 d、14 d，P＜0.05）；至17 d 與造模前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

與N 組相比，T 組大鼠的PWT 在CCI 造模術(shù)后有明顯降低（1 d、3 d、7 d，P＜0.01；14 d，P＜0.05），10 d 及17 d 的PWT 與N 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠右后足PWT 變化（±s，n=8，g）

表1 各組大鼠右后足PWT 變化（±s，n=8，g）

注：與N 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與造模前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別N 組M 組T 組造模前17.1±5.7 16.4±3.9 15.8±4.5造模后1 d 18.5±6.4 9.0±3.5*8.6±3.6**##造模后3 d 16.5±5.2 6.8±1.5**7.1±4.4**##造模后7 d 17.1±5.7 7.3±2.1**8.8±4.5**##造模后10 d 16.5±6.3 6.0±1.9**9.9±2.5#造模后14 d 17.8±5.1 6.0±1.1**10.1±2.2*#造模后17 d 16.4±3.9 6.5±2.1**12.0±3.3

圖1 各組大鼠右后足PWT 變化

3.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)HE 染色結(jié)果

坐骨神經(jīng)切片HE 染色觀察可見：N 組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面完整，神經(jīng)纖維排列緊密，神經(jīng)纖維外膜、神經(jīng)束膜及神經(jīng)內(nèi)膜完整，神經(jīng)外膜較疏松且可見血管，神經(jīng)突起被髓鞘包繞，髓鞘完整，未見脫髓鞘樣改變；M 組大鼠坐骨神經(jīng)外膜及神經(jīng)束膜增厚明顯，結(jié)構(gòu)相對完整，神經(jīng)內(nèi)膜疏松碎裂，內(nèi)可見血管，部分神經(jīng)纖維呈脫髓鞘樣改變，髓鞘腫脹、分裂；T 組大鼠坐骨神經(jīng)外膜及神經(jīng)束膜增厚明顯，結(jié)構(gòu)相對完整，神經(jīng)外膜較致密，外可見結(jié)締組織包裹，神經(jīng)內(nèi)膜及外膜內(nèi)均可見血管，神經(jīng)內(nèi)膜較疏松，可見裂隙，部分神經(jīng)纖維呈脫髓鞘樣改變，部分髓鞘空泡狀，可見髓鞘完整的正常形態(tài)神經(jīng)纖維。 詳見圖2～3。

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)HE 染色結(jié)果（×100）

圖3 各組大鼠坐骨神經(jīng)HE 染色結(jié)果（×400）

4 討論

頸肩腰腿痛是中醫(yī)推拿科常見病種，全球頸肩腰腿痛發(fā)病率占疼痛疾病的50%～60%[15]，其中相當(dāng)部分患者屬于神經(jīng)病理性疼痛，諸如頸椎間盤突出癥、腰椎間盤突出癥、外周神經(jīng)干或神經(jīng)分支卡壓綜合征等[16]。 古籍中早有推拿鎮(zhèn)痛的理論記載，如《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》中載有：“按其經(jīng)絡(luò)，以通郁閉之氣，摩其壅聚，以散瘀結(jié)之腫”，說明推拿是行氣止痛、消散瘀滯的要法[17-18]。 雖然臨床中推拿干預(yù)神經(jīng)病理性疼痛有很好的鎮(zhèn)痛效果，但目前研究還存在不足，推拿手法鎮(zhèn)痛機制尚未明確。

目前，神經(jīng)病理性疼痛研究的動物模型中，CCI模型是最常用的動物模型[19]。 承山穴為臨床治療腰腿痛穴位處方中出現(xiàn)頻次排名第五的腧穴[20]，承山穴作為針灸處方中的主穴，出現(xiàn)的頻率也較高[21]。WU 等[22]通過解剖研究發(fā)現(xiàn)，承山穴和坐骨神經(jīng)之間通過感覺和運動通路相關(guān)聯(lián)，雖然承山穴和坐骨神經(jīng)相關(guān)的感覺和運動神經(jīng)源在標(biāo)記數(shù)量上有所不同，但它們卻分布在相同的脊柱節(jié)段和中樞靶區(qū)。而曹乾安等[23]通過力敏腧穴探查發(fā)現(xiàn)，承山穴是腰痛患者的力敏穴位之一，承山穴的力敏閾值也隨治療過程中病情的緩解而逐漸升高。 胡濤濤[24]在其實驗研究中認為，神經(jīng)功能恢復(fù)、再生神經(jīng)纖維密度、再生神經(jīng)髓鞘形成、腓腸肌恢復(fù)率等是坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的重要指標(biāo)。 基于以上研究基礎(chǔ)，本研究團隊認為，神經(jīng)解剖學(xué)的連接可能是承山穴治療坐骨神經(jīng)疾病作用機制的重要環(huán)節(jié)，推拿按揉承山穴有助于CCI 大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)，從而達到鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠在CCI 造模后1 d其PWT 即出現(xiàn)了降低，直至實驗結(jié)束，說明造模后大鼠出現(xiàn)了明顯的痛覺過敏現(xiàn)象。 按揉承山穴組大鼠的PWT 在造模后的1 d 和3 d 出現(xiàn)了明顯的下降，說明CCI 模型造模成功，術(shù)后第4 天起推拿按揉法介入，從術(shù)后7 d 開始，按揉承山穴組大鼠的PWT 有升高趨勢，尤其是10 d 和17 d 的PWT 接近正常水平，說明按揉承山穴對CCI 模型大鼠有顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。坐骨神經(jīng)HE 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠的坐骨神經(jīng)脫髓鞘明顯，而按揉承山穴組大鼠坐骨神經(jīng)外膜及神經(jīng)束膜較空白組有所增厚，結(jié)構(gòu)相對完整，神經(jīng)外膜較致密，外可見結(jié)締組織包裹，內(nèi)含豐富血供，神經(jīng)內(nèi)膜較疏松，可見裂隙及部分神經(jīng)纖維呈脫髓鞘樣改變，部分髓鞘空泡狀，可間見結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)纖維，說明按揉承山穴對坐骨神經(jīng)的損傷起到了良性的作用。 本實驗研究結(jié)果表明，按揉承山穴有明確的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且對損傷的坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)產(chǎn)生了一定的良性影響，其鎮(zhèn)痛機制可能與延緩周圍神經(jīng)損傷及神經(jīng)損傷脫髓鞘后髓鞘再生有關(guān)。本實驗為推拿手法鎮(zhèn)痛提供了一定的理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)，按揉承山穴鎮(zhèn)痛作用與神經(jīng)損傷修復(fù)之間的關(guān)系還有待進一步深入研究。