基于Src/VEGF 軸探究補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制

胡玉蝶，王曉麗，焦方敏，楊 爭，袁 博，胡金輝*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

乳腺癌是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病[1-2]，其主要死亡原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，骨骼是該病最常見的轉(zhuǎn)移部位，發(fā)生率高達(dá)70%～85%[3-4]，臨床癥狀多為局部或全身疼痛、病理性骨折、高鈣血癥等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[5]。 目前，西醫(yī)主要治療方法有骨改良藥物的應(yīng)用、抗腫瘤治療、手術(shù)治療、鎮(zhèn)痛治療等，但毒副作用較多且療效有限[6]。 近年來，中醫(yī)藥基于辨證論治、因人制宜的特點(diǎn)，在防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中取得良好療效，臨床上越來越多的患者選擇中西醫(yī)結(jié)合療法防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移[7]。補(bǔ)腎活血湯出自《傷科大成》，乃治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移臨床常用方[8-9]，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)，并行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，旨在揭示補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的內(nèi)在分子機(jī)制，為其臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞

15 只健康BALB/c 6～8 周齡雌性裸鼠，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度為50%～70%，許可證號：SYCK(湘)2020-0038。乳腺癌4T1-luc 細(xì)胞株（批號：CL-0007）購自普諾賽公司，本實(shí)驗(yàn)已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會，批準(zhǔn)編號：LL2021041404。

1.2 主要藥品與試劑

Src 抗體（批號：ab109381）、MMP1 抗體（批號：ab52631）均購自英國Abcam 公司；VEGF 抗體（批號：13687-1-AP）、內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin）（批號：66009-1-Ig）、NFATc1 抗體 （批號：66963-1-Ig）、HRP goat anti-rabbit IgG（批號：SA00001-2）、HRP goat anti-mouse IgG（批號：SA00001-1）均購自美國proteintech 公司。

補(bǔ)腎活血湯藥物組成：熟地黃12 g（批號：2106031）、杜仲15 g（批號：21050406）、枸杞子15 g（批號：HH21050701）、補(bǔ)骨脂15 g（批號：HY21051901）、菟絲子15 g（批號：CK21042906）、當(dāng)歸尾12 g（批號：TH2105702）、沒藥6 g（批號：21051901）、山茱萸15 g（批號：SX21052806）、紅花6 g（批號：SX21051301）、獨(dú)活15 g（批號：TH21052606）、肉蓯蓉15 g（批號：2105245），均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，張裕民主任藥師鑒定為正品，藥品質(zhì)量均符合《中華人民共和國藥典》（2020 年版）規(guī)定[38]。

1.3 主要儀器

煎藥壺（一壺百飲有限公司，型號：FTS-10A）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（中天儀器科技有限公司， 型號：RE-2000A）；搖床（其林貝爾公司，型號：TS-1）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（勤翔公司，型號:ChemiScope6100）；小動物標(biāo)本Micro-CT 成像系統(tǒng)（美國GE 公司，型號：Super Nova CT）；醫(yī)用診斷X 射線儀器（威圖科技有限公司，型號：E7242X）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 補(bǔ)腎活血湯中藥成分收集及作用靶點(diǎn)預(yù)測 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，檢索補(bǔ)腎活血湯11 味中藥成分信息，以口服生物利用度(OB)≥30%、藥物類藥性(DL)≥0.18 為濾過條件，篩定活性成分；利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.Ncbi.Nlm.nih.gov/)獲取各活性成分的SDF 結(jié)構(gòu)式或SMILES 碼并導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstarge tpredi-ction.ch/)收集補(bǔ)腎活血湯的潛在作用靶點(diǎn)。

2.1.2 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.Genecards.org/)中以“Bone metastasis of breast cancer”為檢索詞檢索，獲得乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病治療靶點(diǎn)。

2.1.3 補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移潛在靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)與補(bǔ)腎活血湯潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩軟件工作平臺（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），獲取補(bǔ)腎活血湯活性成分治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

將補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，限定物種為Homo sapiens；Required score 為0.900；FDR Sstringency 為high，獲得PPI 相關(guān)信息。 利用Cytoscape 3.9.0 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化， 并對其行Degree、Be tweenness、Closeness 算法拓?fù)浞治?，獲取補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移核心靶點(diǎn)。

2.1.4 GO、KEGG 富集分析 運(yùn)用WebGestalt(http://www. webgestalt.org/)數(shù)據(jù)庫，ORA 算法，導(dǎo)入拓?fù)浞治霭悬c(diǎn)，GO、KEGG 富集分析，獲取BP、CC、MF 及KEGG 富集分析數(shù)據(jù)，權(quán)重分析后繪制火山圖。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 補(bǔ)腎活血湯中藥制備 補(bǔ)腎活血湯單付劑量141 g，取3 付，根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范〔2009〕》煎煮。 第一次加8 倍量水（3384 mL）浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱過濾；余藥渣再加6 倍量水煎煮30 min，過濾，合并2 次水煎液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（70 ℃，-0.1 MPa）濃縮至約116 mL，分裝，備用。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌4T1-luc 細(xì)胞復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天換液。造模時取對數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS 配制成濃度為5×106個/μL細(xì)胞懸液，保存至冰上備用，全程無菌操作。

2.2.3 動物分組 健康Balb/c 6～8 周齡裸鼠共15只，每籠5 只。 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，確認(rèn)無烈性傳染病且已適應(yīng)新環(huán)境后根據(jù)體質(zhì)量將其標(biāo)號，采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為3 組，分別為對照組、模型組、補(bǔ)腎活血湯組，每組5 只。

2.2.4 選用脛骨骨髓腔內(nèi)注射乳腺癌細(xì)胞建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型 裸鼠造模前用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.4 mL/20 g）。 麻醉完畢后固定于操作臺，75%酒精消毒左側(cè)后肢皮膚，屈曲膝關(guān)節(jié)呈90°，確定脛骨平臺位置。模型組、補(bǔ)腎活血湯組組裸鼠均用26G 顯微注射器針頭從脛骨近端向脛骨遠(yuǎn)端斜下緩慢旋轉(zhuǎn)刺入骨髓腔，針尖有落空感并部位固定，用顯微注射器吸取10 μL 4T1-luc 細(xì)胞懸液，緩慢注入骨髓腔，注射完畢后針頭在脛骨內(nèi)停留1 min，隨后退針局部壓迫，對照組裸鼠用上述方法向骨髓腔內(nèi)注射10 μL PBS。 最后將裸鼠均放置于37 ℃恒溫板上，蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。

2.2.5 給藥方法 造模5 d 后，補(bǔ)腎活血湯組裸鼠每天補(bǔ)腎活血湯中藥液灌胃1 次（0.01 mL/g）（給藥劑量為36.67 g/（kg·d）；對照組、模型組以生理鹽水灌胃（0.01 mL/g）。 連續(xù)給藥14 d。

2.2.6 檢測指標(biāo)與方法 （1）裸鼠體質(zhì)量監(jiān)測：造模第1 天、干預(yù)第4、7、11、14 天各稱量體質(zhì)量1 次。

（2）腫瘤組織HE 染色形態(tài)學(xué)觀察：4%甲醛溶液固定脛骨組織144 h，脫鈣，脫水后石蠟包埋，切片，60 ℃烤片12 h，脫蠟至水，將切片置二甲苯中20 min，重復(fù)3 次，乙醇梯度脫水，蘇木素染色，蒸餾水沖洗，PBS 返藍(lán)，伊紅染復(fù)染，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，取出后置于二甲苯10 min，2 次，封片，顯微鏡下觀察。

（3）裸鼠脛骨微CT 檢測：將裸鼠左后肢固定在微CT 載物臺上，設(shè)定360°掃描角度、10 μm 分辨率，獲取連續(xù)的平面CT 圖像并進(jìn)行三維重建，分析脛骨骨破壞面積百分比（脛骨骨破壞面積百分比=脛骨骨破壞面積÷脛骨總面積）。

（4）裸鼠脛骨X 線檢測：藥物干預(yù)結(jié)束后將裸鼠眼眶取血處死，分離患側(cè)后肢置于X 線成像系統(tǒng)中拍照觀察。

（5）脛骨組織TRAP 染色：4%甲醛溶液固定脛骨組織，脫鈣，脫水，石蠟包埋，切片，60 ℃烤片1～2 h，再將切片置于二甲苯中，梯度酒精脫水。 TRAP孵育液37 ℃避光浸染70 min、流水沖洗，蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗，PBS 返藍(lán)，梯度酒精脫水。取出后置于二甲苯中，封片、鏡下觀察，陽性細(xì)胞為酒紅色。

（6）Western blot 檢測：取新鮮脛骨組織0.025 g，加250 μL RIPA 裂解液并反復(fù)研磨組織，冰上裂解，4 ℃離心，檢測上清蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次一抗（Src 抗體，1∶10 000 稀釋、VEGF 抗體，1∶500 稀釋；MMP1 抗體，1∶1000 稀釋；β-actin 單克隆抗體，1∶5000 稀釋）、二抗（HRP goat anti-mouse IgG，1∶5000 稀 釋；HRP goat anti-rabbit IgG，1∶6000 稀釋）與膜一起各孵育90 min。 使用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色曝光。 Image Lab Software 軟件測定光密度，以目標(biāo)蛋白與β-actin 條帶比值表示相對表達(dá)量。

（7）免疫組化檢測：甲醛溶液固定脛骨組織，脫鈣，石蠟包埋，切片，脫蠟至水，熱修復(fù)抗原，室溫加1%高 碘 酸，PBS 沖 洗 后 滴 加 一 抗（Src、VEGF、MMP1、NFATc1 均1∶100 稀釋） 4 ℃過夜，PBS 沖洗，滴加二抗（抗兔-IgG 抗體-HRP 多聚體）37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，PBS 返藍(lán)，酒精脫水。置于二甲苯后封片、鏡下觀察。陽性染色為棕黃色或褐色，Image J 軟件分析圖像平均光密度(Average IOD）。

2.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料滿足正態(tài)分布，則用“±s”表示，方差齊性時用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法；不滿足方差齊性時采用多個獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布時，采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1.1 補(bǔ)腎活血湯有效成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集活性成分，其中熟地黃2 個、杜仲28 個、枸杞子45 個、補(bǔ)骨脂42 個、菟絲子11 個、當(dāng)歸尾2 個、沒藥45 個、山茱萸20 個、紅花25 個、獨(dú)活9 個、肉蓯蓉6 個。 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取上述成分SDF 結(jié)構(gòu)式或SMILES 碼，導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測補(bǔ)腎活血湯潛在作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)值且保留唯一值，共得1443 個補(bǔ)腎活血湯藥物潛在靶點(diǎn)。

3.1.2 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫，獲得乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)共6973 個。

3.1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選結(jié)果及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)6973 個與補(bǔ)腎活血湯潛在靶點(diǎn)1443 個取交集，并繪制韋恩圖（圖1 A），得藥物與疾病的共同靶點(diǎn)949 個（如MMP7、EP300 等）。運(yùn)用Cytoscape軟件對PPI 相關(guān)信息網(wǎng)絡(luò)可視化（圖2）；同時對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Degree、Closeness、Between ness算法拓?fù)浞治?，并行可視化（圖1B 和圖1D）。 PPI網(wǎng)絡(luò)中，有933 個節(jié)點(diǎn)（16 個無交集靶點(diǎn)不納入統(tǒng)計），4525 條邊，富集P 值＜1.0e-16。運(yùn)用Degree、Closeness、Betweenness 算法拓?fù)浞治龅贸鯬PI 網(wǎng)絡(luò)中排名前十的核心靶點(diǎn)（見表1），整合后收集到核心靶點(diǎn)共15 個（如SRC、TP53 等）。

圖1 共同靶點(diǎn)韋恩圖、拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

表1 前10 位Degree、Closeness、Betweenness 算法拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

3.1.4 拓?fù)浞治霭悬c(diǎn)GO 與KEGG 富集分析 BP

共富集605 個生物進(jìn)程，整合FDR、ratio 與P 值結(jié)果并進(jìn)行權(quán)重分析，繪制火山圖(圖3A)，主要富集于正向調(diào)節(jié)防御反應(yīng)、類固醇激素的反應(yīng)、共價染色質(zhì)修飾等生物進(jìn)程。CC 共富集52 個細(xì)胞組分，整合FDR、ratio 與P 值結(jié)果并進(jìn)行權(quán)重分析，繪制火山圖(圖3B)，主要富集于受體復(fù)合物、膜區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分。 MF 共富集117 個細(xì)胞功能，整合FDR、ratio 與P 值結(jié)果并進(jìn)行權(quán)重分析，繪制火山圖(圖3C)，主要富集于蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、類固醇激素受體活性、蛋白異源二聚體活性等細(xì)胞功能。 KEGG 共富集179 個信號通路，整合FDR、ratio 與P 值結(jié)果并進(jìn)行權(quán)重分析，繪制火山圖(圖3D)，主要富集于MAPK 信號通路、cAMP 信號通路、細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路。

圖3 GO、KEGG 富集分析火山圖

3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1 體質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果 造模第1 天，各組裸鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)第14 天，模型組體質(zhì)量較對照組明顯下降（P＜0.01），與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯組體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組裸鼠體質(zhì)量比較（±s,g）

表2 各組裸鼠體質(zhì)量比較（±s,g）

注：與對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與造模第一天比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組補(bǔ)腎活血湯組n 55 5造模第1 天18.53±0.31 18.55±0.46 18.32±0.56干預(yù)第14 天20.79±0.69#16.98±0.24△△#19.15±0.42△△**#

3.2.2 脛骨組織HE 染色結(jié)果 對照組骨組織完整，骨小梁排列規(guī)整，骨皮質(zhì)未見明顯缺失，骨髓腔內(nèi)細(xì)胞散在分布無聚集，無明顯炎性浸潤。 與對照組相比，模型組、補(bǔ)腎活血湯組細(xì)胞增生顯著，有明顯骨轉(zhuǎn)移征象，均可見不同程度骨質(zhì)破壞、腫瘤細(xì)胞浸潤、骨髓腔細(xì)胞呈簇狀或片狀聚集分布、核大深染、炎性浸潤、細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則。與模型組相比，補(bǔ)腎活血湯組腫瘤細(xì)胞浸潤、骨皮質(zhì)毛燥等情況明顯好轉(zhuǎn)。 詳見圖4。

圖4 脛骨組織HE 染色（×200）

3.2.3 裸鼠脛骨微CT 檢查結(jié)果 由微CT 攝圖（圖5A）及脛骨骨破壞面積百分比分析（圖5B）可見，對照組骨密度正常，未見明顯骨缺損；與對照組比較，模型組骨破壞面積比顯著增加（P＜0.01）、骨密度下降，有明顯“蝕骨”征，尤以造模時注射4T1-luc 細(xì)胞處為甚；與模型組相比，補(bǔ)腎活血湯組骨破壞面積比明顯降低（P＜0.05）。

3.2.4 裸鼠脛骨X 線檢查結(jié)果 由各組裸鼠X 線檢測照片可見（圖5C），對照組裸鼠脛骨骨質(zhì)連接完整，未見骨缺損；與對照組相比，模型組、補(bǔ)腎活血湯組可見不同程度骨皮質(zhì)毛糙欠規(guī)則欠連續(xù)、密度降低、關(guān)節(jié)變形，其中模型組骨破壞程度最明顯；與模型組相比，補(bǔ)腎活血湯組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨缺損程度明顯好轉(zhuǎn)。

圖5 脛骨微CT、X 線檢測及骨破壞面積百分比

3.2.5 脛骨組織切片Trap 染色結(jié)果 各組切片可見數(shù)量不等的紅染Trap（+）細(xì)胞（圖6）。與對照組相比，模型組骨基質(zhì)邊緣Trap（+）細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），多個細(xì)胞核聚集明顯；與模型組相比，補(bǔ)腎活血湯組Trap（+）細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）且形態(tài)變小，無明顯核聚集，紅染變淡。

圖6 脛骨組織Trap 染色（400×）及Trap 染色陽性細(xì)胞數(shù)目柱狀圖

3.2.6 脛骨組 織中SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表達(dá)結(jié)果 免疫組化法（圖7、表3）與Western blot 法（圖8）兩種檢測方法顯示，模型組SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 基因表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05）；與模型組相比較，補(bǔ)腎活血湯組SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 基因表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

圖7 免疫組化法檢測各組SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表達(dá)水平(×400)

圖8 Western blot 法檢測各組SRC、VEGF、MMP1 蛋白表達(dá)水平

4 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是由腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)灶基膜，侵犯周圍基質(zhì)與脈管系統(tǒng)，到達(dá)轉(zhuǎn)移組織或靶器官，并從循環(huán)系統(tǒng)中逃逸出來定植于此，形成轉(zhuǎn)移灶[10]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移多為溶骨性病變，主要是腫瘤細(xì)胞與骨細(xì)胞之間相互串?dāng)_產(chǎn)生的結(jié)果[11]。正常情況下骨形成與骨吸收處于平衡狀態(tài)[12]，骨轉(zhuǎn)移發(fā)生時，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和生長因子如甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone-related peptide, PTHrP）、IL-6 等刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生核因子κB 配體受體激活因子（receptor or activator of NF-κB ligand, RANKL），RANKL 促進(jìn)破骨細(xì)胞形成進(jìn)而產(chǎn)生溶骨效應(yīng)[13]；反過來，骨吸收過程中釋放的生長因子又促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，如血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子等，形成了一個“惡性循環(huán)”[14]，可見，破骨細(xì)胞的骨吸收作用是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的一個重要環(huán)節(jié)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病屬于“骨瘤”“骨蝕”“脛陰疽”等范疇[15]，腎主骨生髓，腎虛精虧，骨髓不充則利于癌邪侵犯骨骼。 《靈樞·本藏》中記載：“血和則經(jīng)脈流行，營復(fù)陰陽，筋骨勁強(qiáng)，關(guān)節(jié)清利矣。 ”血液往來流利是骨骼強(qiáng)健的保證。 補(bǔ)腎活血湯[16]由熟地黃、杜仲、枸杞子、補(bǔ)骨脂、菟絲子、當(dāng)歸尾、沒藥、山茱萸、紅花、獨(dú)活、肉蓯蓉組成，全方共奏補(bǔ)腎活血、通絡(luò)止痛的功效。現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)腎活血湯能改善骨質(zhì)丟失、骨折，抑制破骨細(xì)胞活化[17-19]，方中紅花、補(bǔ)骨脂、枸杞子、沒藥等多種中藥均具有抗腫瘤活性[20-24]，該方在治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中頗有療效[8-9]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，挖掘補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，并對所得結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 共獲得補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的活性成分235 個、潛在靶點(diǎn)949 個、相關(guān)通路179 個。 拓?fù)渌惴ǚ治龊Y定15 個核心靶點(diǎn)（Src、TP53 等）。 其中Degree、Closeness 度值排名第一的核心靶點(diǎn)均為Src，說明其可能是補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點(diǎn)，選其為驗(yàn)證對象。 Src 是Src 家族激酶中的核心家族成員[25]，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等過程[26]，亦對破骨細(xì)胞的調(diào)控至關(guān)重要，抑制Src 活性會抑制破骨細(xì)胞形成，阻止破骨細(xì)胞前體從成骨細(xì)胞層遷移到骨表面，阻止再吸收坑的形成[27]。 VEGF是Src 重要的下游靶點(diǎn)[28-29]，VEGF 誘導(dǎo)可以提高裸鼠骨髓破骨細(xì)胞前體的存活率、分化能力和骨吸收活性[30]，因此，Src/VEGF 信號通路在骨轉(zhuǎn)移疾病中發(fā)揮重要作用。 MMP1 與NFATc1 是該通路下游靶基因[31-32]，MMP1 與原發(fā)灶上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[33]；且沉默MMP1 顯著減少骨轉(zhuǎn)移灶中破骨細(xì)胞數(shù)量[34-35]。 NFATc1 是調(diào)控破骨細(xì)胞的終末開關(guān)，抑制RANKL、異位表達(dá)NFATc1 的破骨細(xì)胞前體仍可分化為破骨細(xì)胞；破壞小鼠造血細(xì)胞中NFATc1 表達(dá)將誘導(dǎo)小鼠骨量增加和破骨細(xì)胞減少[36-37]。

實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，模型組裸鼠體質(zhì)量減輕（P＜0.01）；脛骨組織切片可見大量腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤；脛骨骨破壞面積百分比顯著增加（P＜0.01）；破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.01）；脛骨組織SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。 與模型組相比，補(bǔ)腎活血湯組裸鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01）；腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤情況好轉(zhuǎn)；脛骨骨破壞面積百分比降低（P＜0.05）；破骨細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）；SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。 因此，補(bǔ)腎活血湯可能通過抑制Src/VEGF 軸及下游MMP1、NFATc1表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，本研究通過對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，明確了補(bǔ)腎活血湯可能通過下調(diào)Src/VEGF軸及其下游MMP1、NFATc1 基因的表達(dá)發(fā)揮抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疾病進(jìn)展的作用。