合歡花水提物對抑郁癥大鼠行為學(xué)及海馬神經(jīng)元損傷的影響研究*

胡婧楠，廖曼，何濤

（河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1.中醫(yī)臨床研究基地辦公室，2.藥學(xué)部，3.麻醉科，河北 石家莊 050011）

抑郁癥是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為情緒持久低落，患者常伴有思維遲鈍、記憶力減退、食欲下降、睡眠質(zhì)量差等，若長期不干預(yù)，可能會使患者產(chǎn)生自虐、自殺的行為，對自身及其家庭帶來嚴(yán)重影響[1]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究顯示，神經(jīng)元細(xì)胞損傷是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵。目前，臨床多采用西藥治療抑郁癥，如氟西汀，但西藥價格貴、不良反應(yīng)多，因此，探尋新的有效藥物對抑郁癥的治療有較大臨床意義[2]。近年來，抗抑郁中藥成為臨床研究熱點(diǎn)。合歡花具有開胃、解郁、理氣、安神等功能，可用于憂郁失眠、胸悶納呆等癥，目前已有研究用合歡花干預(yù)抑郁癥[3]。崔妍等[4]的研究顯示，合歡花水提物對焦慮抑郁大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚未明確。酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus Kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路是一條與細(xì)胞增殖、分化及凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]。既往研究顯示，抑制JAK2/STAT3 通路活化對抑郁癥大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)作用[6]。目前關(guān)于合歡花水提物通過JAK2/STAT3 通路對抑郁癥改善作用的研究尚不全面，因此，本研究擬基于JAK2/STAT3 通路探究合歡花水提物對抑郁癥大鼠行為學(xué)及海馬神經(jīng)元損傷的影響，以期為臨床治療抑郁癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器

50 只SPF 級SD 雄性大鼠，8 周齡，體重180～250 g，平均（217±31）g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2021-002，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（冀）2018-008]。合歡花干燥藥材（安徽亳州德億利藥業(yè)有限公司），氟西?。▏帨?zhǔn)字H20064844，蘇州中化藥品工業(yè)有限公司），原位末端標(biāo)記染色（TdT-mediate ddUTP nick and labeling,TUNEL）試劑盒（貨號：CDLG-3559，武漢純度生物科技有限公司），兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗（上海研卉生物科技有限公司）。超速離心機(jī)（型號：Optima?XPN，貝克曼庫爾特生物科技有限公司），光學(xué)顯微鏡（型號：BD-SW50，深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 合歡花水提物制備

500 g 合歡花加2 500 mL 水煎煮30 min，將濾液過濾，藥渣用2 000 mL 水煎煮30 min 過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至1 g/mL，高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模型復(fù)制、分組及給藥方式

50 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組，每組10 只。模型組、合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組大鼠參照文獻(xiàn)[7]的慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）法復(fù)制抑郁模型：大鼠單只單籠飼養(yǎng)，每天從夾尾3 min、斷食（1 d）、斷水（1 d）、束縛3 h、晝夜顛倒（1 d）、低溫游泳（10℃，5 min）、電擊（足底，30 V，5 s，間歇5 s，共300 s）中隨機(jī)選擇一種進(jìn)行刺激，連續(xù)刺激21 d。21 d 后觀察到大鼠出現(xiàn)明顯食欲或體重下降，即抑郁模型復(fù)制成功。經(jīng)觀察，所有大鼠模型均復(fù)制成功（40 只）。每天應(yīng)激刺激前1 h，合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組大鼠分別給予0.15 g/kg、0.90 g/kg 合歡花水提物及1.8 mg/kg 氟西汀溶液灌胃（1 次/d，連續(xù)21 d），而對照組、模型組同時間給予等量生理鹽水灌胃處理[8]。

1.4 大鼠行為學(xué)改變實(shí)驗(yàn)

1.4.1 敞箱實(shí)驗(yàn) 模型復(fù)制前1 d、模型復(fù)制第22 天，將單只大鼠置于長、寬、高為125 cm×125 cm×40 cm 光潔敞箱中央，底面用白線劃分為25 個等邊方格（25 cm×25 cm），內(nèi)面涂黑漆，敞箱中央放一昏暗燈光。實(shí)驗(yàn)開始將大鼠置于中央格，水平穿越格數(shù)為其得分，穿越1 格為1 分；兩前腿離地或爬墻壁記為垂直運(yùn)動，1 次為1 分。記錄大鼠5 min 內(nèi)水平穿越格數(shù)、垂直運(yùn)動得分。

1.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 模型復(fù)制前3 d 對大鼠進(jìn)行含糖飲水訓(xùn)練，每只大鼠分別給予1%蔗糖水1 瓶、純水1 瓶，分別稱取放置前及放置60 min 后水的質(zhì)量，計(jì)算糖水偏愛值，糖水偏愛值=糖水消耗量/兩瓶水消耗量。記錄模型復(fù)制前1 d、模型復(fù)制第22 天的糖水偏愛值。

1.5 標(biāo)本采集

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠以10%水合氯醛麻醉，迅速處死并取出雙側(cè)海馬組織，左側(cè)組織固定于4%多聚甲醛，用于HE 染色及TUNEL 檢測；右側(cè)組織PBS 溶液沖洗，保存于液氮中用于蛋白表達(dá)檢測。

1.6 HE染色觀察各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化

取各組大鼠固定的海馬組織，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明處理、石蠟包埋后，制成6 μm 切片，加入HE 染液進(jìn)行染色，沖洗、封片，光學(xué)顯微鏡拍照、觀察（觀察范圍取海馬組織CA1 區(qū)）。

1.7 TUNEL檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

取各組大鼠剩余海馬組織切片，常規(guī)脫蠟、水化，PBS 洗滌2 遍，加入TUNEL 反應(yīng)混合溶液，37℃孵育1 h。光學(xué)顯微鏡觀察、拍照，細(xì)胞核呈棕色或棕褐色為凋亡細(xì)胞；每張玻片隨機(jī)選5 個視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)、海馬神經(jīng)元細(xì)胞總數(shù)，取平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/海馬神經(jīng)元細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 Western blotting 測定各組大鼠海馬組織中JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá)

取各組大鼠海馬組織并制備組織勻漿，加入細(xì)胞裂解液裂解海馬組織細(xì)胞，4℃下1 500 r/min離心15 min，取上清液用于蛋白總量測定，電泳分離JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 及β-actin 蛋白條帶，濕膜法轉(zhuǎn)膜，并先后加入相應(yīng)的兔抗大鼠一抗（稀釋比1∶500）、山羊抗兔二抗（稀釋比1∶1 000）分別孵育后采用顯影試劑盒，最終定影并采用iBright CL750 成像系統(tǒng)檢測各蛋白灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

各組大鼠模型復(fù)制前1 d、模型復(fù)制第22 天的水平穿越格數(shù)得分、垂直運(yùn)動得分、糖水偏愛值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)的水平穿越格數(shù)得分、垂直運(yùn)動得分、糖水偏愛值有差異（F=17.266、19.687 和21.654，P=0.003、0.000 和0.000）；②各組的水平穿越格數(shù)得分、垂直運(yùn)動得分、糖水偏愛值有差異（F=26.578、36.654 和40.845，均P=0.000）；③各組的水平穿越格數(shù)得分、垂直運(yùn)動得分、糖水偏愛值變化趨勢有差異（F=33.644、38.578 和18.578，均P=0.000）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與合歡花水提物低劑量組比較，P ＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化比較

對照組大鼠海馬組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、排列整齊、具有完整細(xì)胞形態(tài)，染色質(zhì)均勻分布，核膜及核仁完整、清晰；模型組大鼠海馬組織呈現(xiàn)彌散性損傷，大量神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，周圍空間擴(kuò)大，間質(zhì)腫脹，炎癥細(xì)胞聚集，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜減少和卷曲；合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組大鼠上述病理變化有所改善，且合歡花水提物高劑量組及氟西汀組大鼠上述病理改善較為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化（HE染色×200）

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞AI比較

對照組、模型組、合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞AI 分別為（3.87±0.58）%、（19.63±2.95）%、（13.32±1.98）%、（8.56±1.29）%、（8.78±1.32）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=108.028，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞AI 較對照組升高（P＜0.05），合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞AI 較模型組均降低（P＜0.05），與合歡花水提物低劑量組比較，合歡花水提物高劑量組和氟西汀組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞AI 均降低（P＜0.05），且合歡花水提物高劑量組與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色×200）

2.4 各組大鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)比較

各組大鼠海馬組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，模型組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量較對照組上調(diào)（P＜0.05）；合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量較模型組降低（P＜0.05）；合歡花水提物高劑量組、氟西汀組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量較合歡花水提物低劑量組降低（P＜0.05）；合歡花水提物高劑量組與氟西汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3 和表2。

圖3 各組大鼠海馬組織JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠海馬組織JAK2/STAT3通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠海馬組織JAK2/STAT3通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與合歡花水提物低劑量組比較，P ＜0.05。

3 討論

抑郁癥是以顯著且持久的情緒低落及心境改變?yōu)橹饕卣鞯纳窠?jīng)系統(tǒng)疾病。隨著社會競爭的加劇，人們在生活、學(xué)習(xí)及工作中承受的壓力越來越大，抑郁癥的發(fā)病率也越來越高[9]。西藥治療抑郁癥副作用多，患者長期服用會產(chǎn)生一定依賴性。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥屬“郁證”范疇，由肝氣郁結(jié)，五臟不和，耗氣傷陰所致，疏肝理氣是治療抑郁癥的宗旨[10]。基礎(chǔ)研究已證實(shí)，合歡花對抑郁癥具有明顯的療效，但其作用機(jī)制尚未闡明[11]。目前認(rèn)為抑郁癥患者的神經(jīng)元受損，無法有效地調(diào)控情緒，JAK2/STAT3 通路與神經(jīng)元細(xì)胞損傷關(guān)系密切，因此推測，合歡花可能通過JAK2/STAT3 通路發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究模型組、合歡花水提物低、高劑量組及氟西汀組大鼠與對照組大鼠比較，水平穿越格數(shù)得分、垂直運(yùn)動得分、糖水偏愛值降低，海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞AI 升高，表明大鼠抑郁癥模型復(fù)制成功。當(dāng)合歡花水提取物干預(yù)后，大鼠的水平穿越格數(shù)得分、垂直運(yùn)動得分、糖水偏愛值均升高，海馬神經(jīng)元細(xì)胞AI 降低，且高劑量組上述指標(biāo)均高于低劑量組，說明合歡花水提物能夠改善大鼠抑郁行為，抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。氟西汀是臨床常用的抗抑郁藥物，本研究以氟西汀作為陽性對照，進(jìn)一步說明合歡花水提物對抑郁癥大鼠的改善效果。本研究中高劑量的合歡花水提取物與氟西汀作用效果差異不明顯。神經(jīng)細(xì)胞損傷是抑郁癥發(fā)生的病理基礎(chǔ)[12]。施學(xué)麗等[13]研究結(jié)果顯示，合歡花總黃酮能夠抑制抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對抑郁癥發(fā)揮保護(hù)作用，與本研究結(jié)果一致。研究顯示，JAK2/STAT3 通路與神經(jīng)元細(xì)胞損傷關(guān)系密切[14]。于曉嵐等[15]研究結(jié)果顯示，抑制JAK2/STAT3 通路活化能夠抑制腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦組織。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，表明抑郁癥能夠激活JAK2/STAT3 通路，當(dāng)合歡花水提取物干預(yù)后，大鼠海馬組織中JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，提示合歡花水提物可能通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，進(jìn)而改善大鼠抑郁樣行為及抑制抑郁癥神經(jīng)細(xì)胞元凋亡，其中高劑量的合歡花水提物效果明顯，與氟西汀組差異不明顯。分析其原因，抑郁癥能夠促使JAK2 被激活并發(fā)生磷酸化反應(yīng)生成p-JAK2，p-JAK2 能夠招募下游信號因子STAT3 并促使STAT3 發(fā)生磷酸化反應(yīng)生成p-STAT3，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)凋亡基因如半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白 酶-3（Caspase-3）[16]。氟西汀對于JAK2/STAT3 通路同樣具有一定的作用，進(jìn)一步證實(shí)了合歡花水提物通過JAK2/STAT3 通路對抑郁癥大鼠的改善作用。

綜上所述，合歡花水提物能夠調(diào)節(jié)大鼠的抑郁行為，抑制大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而改善抑郁，其作用可能與抑制JAK2/STAT3 通路有關(guān)。然而本研究并未能闡明合歡花水提物對JAK2/STAT3通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進(jìn)行深入闡述。