菲咯啉與1?萘甲酸配體共同構(gòu)筑的多核Ca、雙核Mn配合物的合成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

楊婷英 郭 丹 胡宇瓊 易思佳 谷淑琪 賀 霞 朱小明 張復(fù)興

(衡陽師范學院化學與材料科學學院，金屬有機新材料湖南省高校重點實驗室，功能金屬有機化合物湖南省重點實驗室，湘江上游重金屬污染監(jiān)測與治理湖南省工程研究中心，衡陽 421008)

金屬配合物因其種類多樣、結(jié)構(gòu)新穎、功能性強，在生物制藥、催化、吸附和發(fā)光材料等眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，從而成為近年來合成化學、藥物化學和材料化學關(guān)注的熱點之一[1?5]。在藥物化學研究中，自從發(fā)現(xiàn)順鉑對腫瘤細胞表現(xiàn)出強烈的抑制作用[6]，各種金屬如鉑[7?8]、釕[9]、錫[10?11]及其他稀土[12]和過渡金屬[13]等抗腫瘤配合物被合成和報道。然而，研究發(fā)現(xiàn)金屬抗腫瘤配合物或多或少存在耐藥性、毒副作用、水溶性差和作用機理尚不明確等問題，因此，設(shè)計、合成高效、低毒新型金屬抗腫瘤藥物及對其作用機制的研究仍然是當前科研工作者面臨的挑戰(zhàn)和機遇[14?16]。

菲咯啉(Phen)及其衍生物具有較好的空間平面性、廣譜的生物活性，同時其分子結(jié)構(gòu)中2個N原子與金屬配位形成的金屬配合物顯示出良好生物活性、光譜性能等，因而成為近年來的研究熱點[17?19]。利用菲咯啉衍生物與金屬形成的配合物的DNA親和力、光物理和氧化還原特性，可以更深入地研究其與DNA相互作用機制，推動金屬抗腫瘤藥物的發(fā)展[20]。主族元素鈣是人體必需的常量元素之一，在運動、生殖、免疫、神經(jīng)活動等一系列重要生命活動中發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。在傳統(tǒng)的金屬配合物研究領(lǐng)域中，鈣配合物的藥理活性研究與過渡金屬配合物相比明顯偏少。同時，作為配合物的生物活性中心，Ca2+的低毒性和生物安全性是最大優(yōu)勢，具有“安全的輕金屬”和“生命必需常量元素”這樣的顯著特征[21]。過渡金屬錳是正常機體必需的微量元素之一，其作為酶的激活劑和必需輔助因子具有許多重要作用，尤其對線粒體氧化還原和細胞凋亡至關(guān)重要[22]，與DNA、RNA核糖體結(jié)合也會導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯失調(diào)[23]。

基于此，我們以剛性平面均較好的Phen和1?萘甲酸(HNap)為配體分別與一水合醋酸鈣和醋酸錳反應(yīng)，合成了新型Ca、Mn配合物，通過紅外光譜、元素分析、熱重-差熱分析及X射線單晶衍射等技術(shù)對配合物進行了表征及結(jié)構(gòu)分析，研究了配合物發(fā)光性能，探討了配合物與小牛胸腺DNA(ct?DNA)之間的作用形式和作用機理，此外，通過MTT法測試了配合物的體外抗癌活性，為新型金屬抗腫瘤藥物的設(shè)計及應(yīng)用提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器有IR Prestige?21型紅外光譜儀(日本島津公司)、PE?2400型元素分析儀(美國PE公司)、Bruker SMART APEX Ⅱ型單晶衍射儀(德國Bruker公司)、TGA Q50型熱重分析儀(美國TGA儀器公司)、RF?5301PC 型熒光分光光度計(日本島津)、UV?Vis 8500型紫外可見分光光度計(日本島津)、PHS?3C型酸度計(上海彭順科學儀器有限公司)。

溴化乙錠(EB)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自阿拉丁試劑公司，ct?DNA 為 Sigma?Aldrich公司產(chǎn)品，其他試劑均為市售分析純試劑，水為超純水。Tris?HCl緩沖溶液 pH 值為 7.40，cTris=0.01 mol·L-1。ct?DNA純度通過比較260和280 nm處的吸光度來確定(純DNA的A260/A280=1.8，比值大于1.9時表明有RNA污染；小于1.6時表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)，濃度根據(jù)ε260=6 600 L·mol-1·cm-1確定[12]。EB 溶液通過稱取適量EB固體，用pH=7.40的Tris?HCl(0.01 mol·L-1)緩沖溶液配制。

1.2 配合物的合成

配合物的合成路線如圖1所示。具體合成步驟：在50 mL圓底燒瓶中，依次加入Phen(1 mmol)、HNap(2 mmol)、一水合醋酸鈣(1 mmol)或醋酸錳(1 mmol)，以及30 mL乙醇，攪拌回流8 h。冷卻后，過濾，靜置結(jié)晶得到配合物[Ca(Phen)(Nap)2]n(1)或[Mn2(Phen)2(Nap)4(H2O)](2)。

圖1 配合物的合成線路Fig.1 Synthesis routes of the complexes

配合物1：無色透明晶體，產(chǎn)率82%。元素分析實測值(計算值，% )：C 71.93(72.58)，H 3.98(3.94)，N 5.08(4.98)。 IR 主 要 吸收 峰 (KBr，cm-1)：3 422(m)，3 048(m)，3 007(w)，2 951(w)，1 942(w)，1 636(m)，1 597(s)，1 578(s)，1 557(s)，1 514(m)，1 456(m)，1 423(m)，1 373(s)，1 254(m)，1 211(w)，1 148(m)，1 098(m)，1 028(m)，955(m)，862(s)，845(s)，789(s)，731(m)，652(m)，584(m)，509(w)，473(w)，419(w)。

配合物2：棕黃色透明晶體，產(chǎn)率81%。元素分析實測值(計算值，% )：C 69.72(69.63)，H 4.03(3.95)，N 4.71(4.78)。IR 主要吸收峰(KBr，cm-1)：3 428(w)，3 049(m)，3 013(w)，2 708(w)，1 942(w)，1 601(s)，1 589(s)，1 506(m)，1 456(m)，1 425(m)，1 398(m)，1 371(m)，1 344(m)，1 252(m)，1 217(m)，1 144(m)，1 101(m)，1 011(m)，982(w)，847(s)，797(s)，756(s)，725(s)，652(s)，584(m)，530(m)，511(m)，473(w)，420(m)。

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測定

分別選取尺寸為0.28 mm×0.20 mm×0.13 mm(1)和 0.17 mm×0.15 mm×0.14 mm(2)的晶體，在 Bruker SMART APEX Ⅱ型單晶衍射儀上，采用經(jīng)石墨單色化的MoKα射線(λ=0.071 073 nm)，于296(2)K，以φ?ω掃描方式收集數(shù)據(jù)。全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和經(jīng)驗吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)由直接法解出，除水上的氫原子外，其余氫原子均為理論加氫。水上的氫原子通過差值Fourier合成得到。對氫原子和非氫原子分別采用各向同性和各向異性熱參數(shù)進行全矩陣最小二乘法修正。全部結(jié)構(gòu)分析計算工作采用SHEXTL?97程序系統(tǒng)完成。配合物1和2的晶體學數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)精修參數(shù)列于表1。

表1 配合物晶體學數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographlic date of the complexes

續(xù)表1

CCDC：1409882，1；1409878，2。

1.4 配合物與ct?DNA作用

用 Tris?HCl緩沖液配制一系列試樣：30 μmol·L-1的 ct?DNA 和 3 μmol·L-1的 EB，以及不同濃度的配合物。儀器條件：狹縫寬度dex=3 nm，dem=5.0 nm；激發(fā)波長260 nm；發(fā)射波長535～720 nm。測定其熒光發(fā)射光譜。

用 Tris?HCl緩沖液配制一系列試樣：32 μmol·L-1的配合物以及不同濃度的ct?DNA。分別以緩沖液或相應(yīng)濃度的DNA作空白，在紫外可見光譜儀的雙光路系統(tǒng)中，在210～300 nm范圍內(nèi)測定配合物的紫外吸收光譜。

1.5 配合物的體外抗癌活性測試

采用四氮唑鹽還原法(MTT法)分別測定配合物和順鉑對人肺癌細胞(NCI?H460)、人乳腺癌細胞(MCF ?7)、人 肝 癌 細 胞 (HepG2)和 人 肝 臟 細 胞(HL7702)增殖的抑制活性。實驗分為藥物試驗組(分別加入不同濃度的測試藥)、對照組(只加培養(yǎng)液和細胞，不加測試藥)和空白組(只加培養(yǎng)液，不加細胞和測試藥)。取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，加入適量的Trypsin消化，使貼壁細胞脫落，用含10% 胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液在含5% (體積分數(shù))CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃下培養(yǎng)。取96孔板，將測試藥液(0.04～10 μmol·L-1)按濃度梯度分別加入各孔中，每個濃度設(shè)2個平行孔，于前述培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)72 h，然后每孔加40 μL MTT(用D?Hanks緩沖液配成4 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，移去上清液，每孔加二甲基亞砜150 μL，振蕩5 min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解，利用Ap22 Speedy全自動酶免分析系統(tǒng)在570 nm波長處檢測各孔的光密度。對照藥物(卡鉑)的活性按照配合物的活性測試方法測定。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析，通過存活率數(shù)據(jù)相對于藥物濃度的非線性回歸分析(曲線擬合)，用S形劑量響應(yīng)(變量)方程確定半抑制濃度(IC50)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

與配體Hnap的紅外譜圖相比，在配合物1、2的紅外譜圖中，HNap的C=O伸縮振動的尖銳吸收峰(1 674 cm-1)和O—H伸縮振動的彌散吸收峰(2 623～3 100 cm-1)均消失，而配合物1在1 557、1 373 cm-1和配合物2在1 601、1 371、1 589、1 425 cm-1均出現(xiàn)了新的尖銳吸收峰，分別歸屬于Nap-上COO-基團的反對稱伸縮振動(νas)和對稱伸縮振動(νs)特征吸收峰，其峰值差Δν分別為184 cm-1(1)和230、164 cm-1(2)，說明HNap的羧酸基團脫去氫質(zhì)子，以羧基氧原子與Ca離子發(fā)生了雙齒橋聯(lián)配位，與Mn存在雙齒橋聯(lián)配位和單齒橋聯(lián)配位2種配位形式[24]。中性配體Phen的特征吸收峰中，C=N的伸縮振動峰(1 560 cm-1)和C—H面外彎曲振動峰(854、739 cm-1)分別紅移至 1 514、845、731 cm-1(1)和 1 506、847、725 cm-1(2)，表明Phen中的2個氮原子同時參與配位[25]。這些結(jié)果與X射線單晶衍射測定的晶體結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

2.2 晶體結(jié)構(gòu)分析

配合物1、2的主要鍵長和鍵角見表2。配合物的分子結(jié)構(gòu)如圖2和3所示。由圖2可見，配合物1分子中的 Ca1與O1、O2、O3、O4和 Phen配體中的N1、N2配位形成八面體。其中O1、O3、N1、N2原子共同組成了八面體的赤道平面。其中Ca1與位于平面上方與下方軸向位置O2、O4形成的鍵Ca1—O2、Ca1—O4鍵長分別為0.234 5(2)、0.234 8(2)nm。赤道平面上的4個配位原子與金屬中心離子Ca1形成的 化學鍵分 別為 Ca1—N1、Ca1—N2、Ca1—O1、Ca1—O3，其鍵長分別為 0.252 5(2)、0.251 0(2)、0.226 8(2)、0.224 9(2)nm。由軸向位置 O2—Ca1—O4鍵角為163.70(9)°，可知分子是以Ca1為中心形成了一個扭曲的八面體構(gòu)型。有趣的是分子中通過Nap-的羧基氧橋聯(lián)作用形成了八元環(huán)，八元環(huán)與八元環(huán)之間通過Ca離子的連接形成了一維鏈狀結(jié)構(gòu)，如圖3所示。

表2 配合物的主要鍵長(nm)和鍵角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complexes

圖2 配合物1和2的橢球率10% 的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Molecular structure of complexes 1 and 2 with 10% probability ellipsoids

圖3 配合物1的一維鏈狀結(jié)構(gòu)Fig.3 One?dimensional chain structure of complex 1

由圖2可知，配合物2為一個雙核錳配合物結(jié)構(gòu)。Mn1與Mn2分別與來自Nap-中的3個氧原子、水分子中1個氧原子和Phen的2個氮原子配位，形成了六配位八面體構(gòu)型，其中O7、O9、N1、N2與O2、O9、N3、N4分別組成了以Mn1和Mn2為中心的八面體的赤道位置。Mn1與位于平面上方與下方軸向位置O1、O5形成的鍵Mn1—O1和Mn1—O5鍵長分別為0.216 11(13)、0.217 88(13)nm；Mn2與位于平面上方與下方軸向位置O3、O7形成的鍵Mn2—O3、Mn2—O7鍵長分別為0.213 40(13)、0.222 59(13)nm。軸向位置鍵角N1—Mn1—O9和O3—Mn2—O7分別為 153.86(5)°和 160.14(5)°，均小于 180°。由上述可知，Mn1與Mn2的配位環(huán)境基本相同，只是鍵長和鍵角稍微有所區(qū)別，均是以Mn1和Mn2為中心形成了扭曲的八面體構(gòu)型。

在配合物1、2結(jié)構(gòu)中，都是以中心鈣離子與中心錳離子形成了六配位扭曲的八面體構(gòu)型，其中均等于1∶1∶2，不同的是配合物1為多核鈣一維鏈狀結(jié)構(gòu)，而配合物2形成的是單分子雙核錳結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的不同可能是由于中心金屬離子的半徑、核外電子數(shù)不同等。在配合物1中，Phen為雙齒配體，Nap-為雙齒橋聯(lián)配體，Nap-與鈣離子通過橋式配位形成了一維鏈狀配合物；而在配合物2中，中心錳離子不僅與配體Nap-和Phen配位，還與1個水分子配位，其中Phen為雙齒配體，一個Nap-為雙齒橋聯(lián)配體，另外一個Nap-和水分子為單齒橋聯(lián)配體，這3種配體的共同作用形成了單分子雙核錳的結(jié)構(gòu)。

2.3 配合物的激發(fā)波長和發(fā)射波長分析

為了檢測配合物的發(fā)光特性，以甲醇為溶劑配制溶液，在室溫下測試了配合物的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，如圖4所示。配合物1和2分別在334和326 nm最大激發(fā)波長下，在362和384 nm出現(xiàn)了最大發(fā)射峰，斯托克斯位移(最大吸收峰與最大發(fā)射峰之間的波長差)分別為28和58 nm，其中配合物2的斯托克斯位移大于大多數(shù)熒光染料如熒光素、羅丹明、噁嗪和花青素等(一般小于30 nm)[26]。小的斯托克斯位移導(dǎo)致激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的嚴重串擾，造成成像時信噪比低和嚴重的熒光自猝滅現(xiàn)象，限制了其在生物成像中的應(yīng)用，而大的斯托克斯位移可有效減少散射光和激發(fā)光對發(fā)射光譜的影響，更適合生物成像[27]。另外，配合物1和2的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均具有很好的鏡像關(guān)系，這是由于吸收與發(fā)射光子時電子躍遷在激發(fā)態(tài)不同振動能級與基態(tài)不同能級時，躍遷幾率相似，因此產(chǎn)生如圖4的鏡像關(guān)系[28]。

圖4 配合物1和2的熒光激發(fā)光譜和光譜Fig.4 Fluorescence excitation and emission spectra of complexes 1 and 2

2.4 配合物的熱穩(wěn)定性分析

為了研究配合物的熱穩(wěn)定性，在氮氣保護和加熱速度20℃·min-1的條件下，在40～760℃和40～600℃范圍分別對配合物1和2進行了熱重(TG)分析，測得配合物1和2的TG曲線如圖5所示，配合物1的最大失重溫區(qū)為270～720℃，失重歸屬于Phen、Nap-的離去，失重率為89.89% ；2的失重溫區(qū)為160～190℃和310～510℃，失重分別歸屬于與Mn配位的水分子和Phen、Nap-的離去，失重率分別為2.02% 和84.52%。假定1和2殘余物對應(yīng)的是CaO和MnO，其質(zhì)量分數(shù)理論計算值分別為9.97% 和12.10%，實測值分別為10.11% 和13.46%，實測值與計算值基本吻合。結(jié)果表明，配合物1和2分別在270和160℃以下可以穩(wěn)定存在。

圖5 配合物1和2的TG曲線Fig.5 TG curves of complexes 1 and 2

2.5 體外抗腫瘤活性

配合物1、2的體外抗癌活性測試結(jié)果(表3)表明，配合物 1 和 2 對人癌細胞 NCI?H460、MCF?7、HepG2增殖均有較高的抑制活性，且其活性均分別明顯高于臨床使用的卡鉑，也高于其對人正常細胞HL7702的抑制活性。與配合物1相比，配合物2對NCI?H460、MCF?7、HepG2具有更好的抑制活性，其IC50分別為(2.77±0.03)μmol·L-1、(3.07±1.15)μmol·L-1和(3.73±1.34)μmol·L-1，然而，配合物2對人正常細胞HL7702也有較好的抑制率，其IC50為(3.86±0.12)μmol·L-1。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，配合物2的抗腫瘤活性大于配合物1的抗腫瘤活性，可能原因是相比于一維鏈狀多鈣核配位聚合物1，雙核錳單分子結(jié)構(gòu)的配合物2更容易嵌入到DNA的雙螺旋鏈中，改變和破壞了DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤細胞增殖[29]，其更深入的作用機制有待進一步研究。

表3 配合物1、2和卡鉑對腫瘤細胞和正常細胞的IC50Table 3 IC50of complexes 1,2 and carboplatin on tumor cells and normal cells μmmol·L-1

2.6 配合物與ct?DNA相互作用

圖6為不同濃度的配合物1、2對EB?DNA復(fù)合體系熒光光譜的影響。從圖上可以看出，隨著配合物1、2濃度的增加，EB?DNA復(fù)合物體系的熒光逐漸猝滅，說明配合物1、2與DNA作用后，與EB競爭DNA的結(jié)合位點使EB從DNA分子中游離出來，由此可進一步說明它們與DNA發(fā)生了作用；并且從猝滅程度上來看，配合物2使復(fù)合體系熒光強度的下降趨勢更大，初步說明它與DNA的作用更強。根據(jù) Stern?Volmer校正方程：I0/I=1+(KSV+K)ccomplex+KSVKccomplex2，由曲線擬合推斷出配合物與EB?DNA復(fù)合體系的作用屬于動態(tài)和靜態(tài)聯(lián)合猝滅[30]。表明配合物1或2既可以與DNA分子中的磷酸基團靜電結(jié)合，使DNA分子軸向收縮，把EB從DNA分子的堿基對中擠出；又可以與DNA分子中的堿基基團配位結(jié)合，取代DNA分子堿基對中的EB。這2種作用都導(dǎo)致EB?DNA體系熒光的猝滅[31]。

圖6 配合物1、2對EB?DNA體系熒光光譜的影響Fig.6 Effects of complexes 1,2 on the fluorescence spectra of EB?DNA system

為了準確表達配合物與ct?DNA相互作用的強度，在一定濃度的配合物1、2溶液中加入不同濃度的DNA，測定溶液的紫外吸收光譜，結(jié)果如圖7所示。當配合物與DNA發(fā)生作用時，配合物的紫外可見光譜會表現(xiàn)出紅移及減色，且紅移及減色的強度與配合物同DNA的作用強度相關(guān)。由圖7可知，隨著DNA濃度的增大，配合物1和2的紫外光譜的減色效應(yīng)增強，在0～94 μmol·L-1濃度區(qū)間減少率分別為5.61% 和12.93%，配合物2的減色效應(yīng)大于配合物1；同時，配合物1沒有紅移現(xiàn)象，而配合物2紅移效應(yīng)比較明顯，紅移2.0 nm。減色效應(yīng)和紅移數(shù)據(jù)均表明配合物2與DNA的作用大于配合物1與DNA的作用。為了定量研究配合物1和2與DNA的結(jié)合強度，由方程cDNA/(εa-εf)=cDNA/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)]作圖[29](其中εa、εf、εb分別為任意DNA濃度下溶液的摩爾消光系數(shù)、自由配合物的摩爾消光系數(shù)、配合物被DNA完全結(jié)合時的摩爾消光系數(shù))，求出配合物1、2與DNA的結(jié)合常數(shù)(Kb)分別為5.83×103和6.43×103L·mol-1，2的結(jié)合常數(shù)略大于1，與文獻報道的結(jié)合常數(shù)大小相近，均在同一數(shù)量級，這一結(jié)果表明配合物與DNA之間均能發(fā)生中等強度的相互作用[32]。2種配合物的結(jié)合常數(shù)與經(jīng)典溝面結(jié)合試劑DAPI的DNA結(jié)合常數(shù)(8.90×103L·mol-1)相當[33]。表明配合物1、2與DNA的結(jié)合模式可能是通過靜電作用與DNA骨架發(fā)生溝面結(jié)合，而配合物2與DNA的溝面結(jié)合強度大于配合物1，可能是由于配合物2的空間位阻小于配合物1，因而配合物2更容易緊湊地進入DNA的溝槽[34]。

圖7 不同濃度ct?DNA存在下配合物1、2的紫外吸收光譜Fig.7 UV absorption spectra of complexes 1,2 in the presence of ct?DNA with different concentrations

3 結(jié) 論

利用菲咯啉(Phen)和1?萘甲酸(HNap)為配體分別與一水合醋酸鈣和醋酸錳反應(yīng)，合成了一維鏈狀多核鈣聚合物[Ca(Phen)(Nap)2]n(1)和雙核錳單分子配合物[Mn2(Phen)2(Nap)4(H2O)](2)。在配合物1、2結(jié)構(gòu)中，金屬離子、Phen、Nap-的物質(zhì)的量之比均為1∶1∶2，中心鈣離子和中心錳離子均形成六配位扭曲的八面體構(gòu)型。熱重分析顯示配合物1和2具有較好的熱穩(wěn)定性，分別在270和160℃以下可以穩(wěn)定存在。配合物的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜存在很好的鏡面關(guān)系。體外抗癌活性測試顯示配合物對癌細胞NCI?H460、HepG2、MCF?7均有較好的抑制活性，且高于卡鉑；利用紫外吸收光譜、熒光分光光度法研究了配合物與小牛胸腺DNA的相互作用，結(jié)果表明配合物1、2均以靜電作用與DNA發(fā)生溝面結(jié)合。