溫度對馬口魚幼魚耗氧率、窒息點及抗氧化能力的影響

張 凱，王偉瑜，趙麗悅，熊洛梅，梅葉涵，黃可欣，劉芳玲，于 瑾，鄭善堅

( 1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，浙江 金華 321004； 3.龍游縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，浙江 衢州 324000 )

魚類作為一種水生生物，其正常生命活動均需要水的參與，溫度與氧氣作為水體的重要監(jiān)測指標，直接影響魚類生存、生長和繁殖，因此具有重要的研究意義。溫度的高低決定著魚體內(nèi)各種酶的活性，對魚類的新陳代謝起著決定性的作用，在適宜的溫度范圍內(nèi)，魚類的代謝水平與溫度正相關；當溫度超出適宜范圍，會影響其體內(nèi)代謝水平和抗氧化水平，進而減弱魚體清除自由基的能力，造成魚類機體損傷[1-2]。同時，大量研究表明，低氧環(huán)境也嚴重抑制魚類基礎生理代謝，導致魚類生長緩慢，機體免疫力下降，造成魚類死亡[3-4]。

馬口魚(Opsariichthysbidens)屬鯉形目鯉科馬口魚屬[5-6]，是亞洲分布較廣的小型鯉科魚類之一[7]，該魚在中國長江、黃河等各流域中均廣泛分布，在越南、朝鮮半島的河流中也有發(fā)現(xiàn)。馬口魚喜歡棲息于山間溪流中，尤其是水流較急的淺灘。由于馬口魚生性兇猛，以小魚、昆蟲為食，曾威脅淡水漁業(yè)資源，但隨著水環(huán)境的污染，加之人為的過度捕撈，其自然資源數(shù)量也急劇減少。迄今為止，為保護這一魚類資源，國內(nèi)外學者進行了馬口魚生物學特征[5]、遺傳特征[6]、人工馴化和培育[8-15]等相關研究，為馬口魚人工繁育技術的發(fā)展和完善提供了大量理論基礎。目前，很多研究集中在馬口魚遺傳育種、胚胎發(fā)育和組織結構等方面，而對幼魚期的基礎生理研究較少。為此，筆者探討不同溫度和溶解氧水平對不同規(guī)格馬口魚幼魚耗氧率、窒息點和抗氧化指標的影響，以期為馬口魚的幼魚期養(yǎng)殖生產(chǎn)管理提供更完善的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用馬口魚幼魚(1000尾)由浙江漁老大農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，試驗前暫養(yǎng)于100 L的養(yǎng)殖桶中，水溫(24±1) ℃，每日8：00、18：00各投喂1次飼料(粗蛋白40%)，暫養(yǎng)期間，每日換水1次，日換水量為50%。

1.2 試驗方法

1.2.1 耗氧率、窒息點的測定

本試驗采用靜水呼吸室法，在5 L呼吸瓶(圖1)中進行，試驗用水為經(jīng)曝氣12 h[溶解氧質(zhì)量濃度(8.61±0.50) mg/L]的自來水。試驗前1 d停止投喂，使幼魚腸胃完全排空。將馬口魚幼魚根據(jù)體質(zhì)量分為(4.91±0.55) g和(1.22±0.31) g 2種規(guī)格，每個呼吸瓶放入10尾馬口魚幼魚，設20、24、28 ℃ 3個溫度梯度，每個溫度設3個平行組和1個空白對照組。馬口魚幼魚放入呼吸瓶后，置于控溫水槽中逐步調(diào)溫至試驗溫度后適應2 h，隨后用液體石蠟密封。

圖1 試驗裝置結構

分別在試驗前和試驗開始后2 h采用虹吸法取各呼吸室上、中、下層水樣于溶解氧瓶中，固定后測定其溶解氧質(zhì)量濃度，并求平均值。以計算不同溫度下2種規(guī)格馬口魚幼魚的耗氧率。測量馬口魚幼魚窒息點(試驗魚半數(shù)死亡)時的溶解氧質(zhì)量濃度[16-17]，認定死亡的標準為幼魚靜臥瓶底，鰓蓋停止運動[18]。溶解氧質(zhì)量濃度測定采用碘量法(GB 17378.4—2007)。耗氧率的計算方法參照文獻[22,28]的方法：

ρ=c×V1×8×1000÷V2

式中，c為Na2SO4標準液的濃度(mol/L)，8為1/2氧的摩爾質(zhì)量(g/mol)，V1為消耗的Na2SO4標準液的量(mL)，V2為滴定時吸取的水樣體積(mL)，ROC為耗氧率[mg/(g·h)]，ρ1、ρ2分別為初、末溶解氧質(zhì)量濃度(mg/L)，m為試驗時魚的質(zhì)量(g)，t為試驗進行的時間(h)。

1.2.2 抗氧化指標的測定

分別于試驗開始前[溶解氧質(zhì)量濃度(8.61±0.50) mg/L]和低氧狀態(tài)[溶解氧質(zhì)量濃度(2.31±0.41) mg/L]時，在各呼吸瓶中隨機選取3尾幼魚進行麻醉和解剖，取其肝臟用于抗氧化指標的測定。本試驗所測抗氧化指標包括總抗氧化能力、超氧化物歧化酶和丙二醛。所用試劑盒為南京建成生物工程研究所的試劑盒。

1.3 試驗數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 26和Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析檢驗不同溫度和規(guī)格對馬口魚幼魚耗氧率、窒息點及抗氧化指標影響的顯著性，組間差異的顯著性采用LSD多重比較檢驗，顯著水平為0.05，本試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 馬口魚幼魚的耗氧率

試驗結果表明：在20、24、28 ℃ 3個溫度梯度下(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的耗氧率隨溫度的升高而升高，20 ℃時低至(0.185±0.057) mg/(g·h)，顯著低于24 ℃和28 ℃時的耗氧率(P<0.05)，但24 ℃和28 ℃時的耗氧率差異不顯著(P<0.05)；而(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的耗氧率隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢，24 ℃時的耗氧率(0.550±0.022) mg/(g·h)顯著高于20、28 ℃溫度下的耗氧率(P<0.05)，且20、28 ℃時的耗氧率也存在顯著差異(P<0.05)；同時也發(fā)現(xiàn)，除28 ℃下，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚耗氧率顯著高于(1.22±0.31) g幼魚(P>0.05)(表1)。將2種規(guī)格馬口魚幼魚與本試驗室測定馬口魚成魚耗氧率(未發(fā)表)相比發(fā)現(xiàn)(圖2)，成魚耗氧率顯著低于幼魚耗氧率(P<0.05)。

表1 不同溫度下2種規(guī)格馬口魚幼魚的耗氧率及窒息點

圖2 不同溫度下3種規(guī)格馬口魚的耗氧率

2.2 馬口魚幼魚窒息點及行為狀態(tài)

隨著溶解氧質(zhì)量濃度的降低，幼魚呼吸頻率明顯有加快的趨勢，運動頻率逐漸降低，聚集在呼吸瓶底。隨著溶解氧質(zhì)量濃度的進一步下降，幼魚開始出現(xiàn)浮頭狀態(tài)，呼吸頻率進一步加快，部分幼魚失去平衡，沉入瓶底，隨后又快速游至水面。當呼吸瓶中溶解氧質(zhì)量濃度達到窒息點時，幼魚靜臥瓶底，無呼吸，鰓和嘴張開，且部分鰓發(fā)紫，胸鰭向外伸展。測定其窒息點時的溶解氧質(zhì)量濃度發(fā)現(xiàn)：(4.91±0.55) g馬口魚幼魚在24和28 ℃時的窒息點差異不顯著(P>0.05)，20 ℃的窒息點[(1.125±0.009) mg/L]顯著低于24和28 ℃的(P<0.05)；(1.22±0.31) g馬口魚幼魚在20、24、28 ℃水溫條件下的窒息點存在顯著差異(P<0.05)，表現(xiàn)為24 ℃>28 ℃>20 ℃；2種規(guī)格馬口魚幼魚的窒息點在20 ℃和24 ℃下差異不顯著(P>0.05)，28 ℃時(4.91±0.55) g幼魚窒息點顯著高于(1.22±0.31) g幼魚(P<0.05)(表1)。在24 ℃下，將(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的耗氧率與北方須鰍(Barbatulabarbatulanuda)、赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)、刀鱭(Coilianasus)和中華胭脂魚(Chinesesucker)進行對比，發(fā)現(xiàn)馬口魚耗氧率高于相近體質(zhì)量的北方須鰍、赤眼鱒和中華胭脂魚，但窒息點顯著低于刀鱭這類對低氧耐受能力差的經(jīng)濟魚類(表2)。

表2 幾種魚類幼魚窒息點的比較

2.3 低氧對馬口魚幼魚的抗氧化影響

通過測定不同溫度下馬口魚幼魚在正常溶解氧[(8.61±0.50) mg/L]和低溶解氧[(2.31±0.41) mg/L]狀態(tài)下肝臟的抗氧化指標發(fā)現(xiàn)，無論在正常溶解氧狀態(tài)還是低溶解氧狀態(tài)，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚在20、24、28 ℃時的超氧化物歧化酶活性隨著溫度的升高而升高，20 ℃時的超氧化物歧化酶活性均顯著低于24、28 ℃時(P<0.05)，24、28 ℃時(4.91±0.55) g幼魚的超氧化物歧化酶活性雖有上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)(表3、表4)。20 ℃時(1.22±0.31) g幼魚的超氧化物歧化酶活性同樣顯著低于24、28 ℃時(P<0.05)，24、28 ℃時(1.22±0.31) g幼魚的超氧化物歧化酶活性無顯著差異(P>0.05)。

正常溶解氧下，馬口魚幼魚20 ℃和24 ℃時丙二醛含量無顯著差異，但28 ℃時(1.22±0.31) g幼魚丙二醛含量顯著高于(4.91±0.55) g幼魚；低氧狀態(tài)下，除28 ℃下的(1.22±0.31) g幼魚，其他幼魚丙二醛含量高于正常溶解氧下的含量。

低氧狀態(tài)下，2種規(guī)格馬口魚幼魚在20 ℃時的總抗氧化能力無顯著性差異(P>0.05)，在24、28 ℃時，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的總抗氧化能力約為(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的2倍(表3、表4)。將低氧和正常溶解氧狀態(tài)下的總抗氧化能力對比發(fā)現(xiàn)，低氧狀態(tài)下總抗氧化能力顯著高于正常溶解氧(P<0.05)；比較2種規(guī)格幼魚的總抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，(4.91±0.55) g幼魚顯著高于(1.22±0.31) g幼魚(P<0.05)。

表3 正常溶解氧[(8.61±0.50) mg/L]環(huán)境下2種規(guī)格馬口魚幼魚的抗氧化指標

表4 低氧[(2.31±0.41) mg/L]環(huán)境下2種規(guī)格馬口魚幼魚的抗氧化指標

3 討 論

3.1 水溫對不同規(guī)格馬口魚耗氧率的影響

溫度是影響魚類呼吸代謝的主要因素之一[18-24]。在20 ℃和24 ℃溫度下，馬口魚幼魚的耗氧率隨溫度升高而顯著升高，當溫度達到28 ℃時，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚耗氧率顯著降低，而(1.22±0.31) g馬口魚耗氧率有升高的趨勢，但差異不顯著。這說明高溫對馬口魚的呼吸代謝有一定的抑制效果，與段嬌陽等[25-27]的研究結果基本一致。魚類是一種變溫動物，體溫隨水溫的變化而變化，水溫的升高提高了魚體內(nèi)的酶活性，使其代謝旺盛，耗氧率也隨之增加；但當水溫超出適宜范圍時，其新陳代謝被抑制，耗氧率也隨之降低[18]。本試驗結果顯示，相同溫度下不同規(guī)格的馬口魚幼魚耗氧率也存在顯著差異，在20 ℃和24 ℃溫度下，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚耗氧率顯著高于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚，與何亞等[28-30]的研究結果存在一定差異。在已有的研究中，普遍認為魚的耗氧率隨體質(zhì)量的增加而降低，主要是因為幼魚生長迅速，基礎代謝高，需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)來維持自身的能量消耗，相比于成魚，幼魚臟體比例更高，耗氧率高，隨著幼魚生長，其基礎代謝降低，臟體比例逐漸減小，耗氧率也隨之降低，因此，幼魚的耗氧率相對較高[31]。經(jīng)與本實驗室測定的馬口魚成魚耗氧率相比發(fā)現(xiàn)，成魚耗氧率顯著小于幼魚耗氧率，但本試驗中(4.91±0.55) g幼魚耗氧率高于(1.22±0.31) g幼魚，這可能與其生長代謝水平有關。本試驗所用2種規(guī)格的馬口魚為同一批次人工繁育的幼魚，是在人工飼養(yǎng)期間出現(xiàn)的大小分化，其表現(xiàn)出的對耗氧率的差異可能與其性別差異有關。唐英[32]在對馬口魚的研究中發(fā)現(xiàn)，同規(guī)格馬口魚雄性的生長速度高于雌性。馬口魚是典型的雌、雄異形魚類，其成魚階段雄魚與雌魚體型存在顯著差異[13,33]，但幼魚期雌、雄個體在外部形態(tài)上差異小，性染色體分化程度較低，且性別分化也易受環(huán)境影響，導致性表型與遺傳基礎不一致的現(xiàn)象[34]，因此對馬口魚幼魚期雌雄性別分化和生長性能之間的關系的研究造成了一定的阻力。同一批幼魚在相同的養(yǎng)殖環(huán)境下出現(xiàn)不同的規(guī)格，表明其生長性能有一定的差異，進而表現(xiàn)出幼魚耗氧率的差異。

3.2 水溫對不同規(guī)格馬口魚窒息點的影響

魚類窒息點是反映其代謝水平的重要依據(jù)[35]。窒息點反映了魚類對低氧環(huán)境的耐受能力，尤其是在水產(chǎn)養(yǎng)殖、運輸操作過程中具有重要的指導意義[36]。本試驗結果表明，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的窒息點隨溫度的升高而升高，這與徐林通等[27,29,37-38]在其他經(jīng)濟魚類的研究中的結果相似，而(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的窒息點有隨溫度升高而升高的趨勢，但28 ℃時出現(xiàn)了下降。在20 ℃時，2種規(guī)格的馬口魚幼魚的窒息點較低，表明馬口魚幼魚在低溫的情況下對低氧的耐受能力強。(4.91±0.55) g馬口魚幼魚在24 ℃和28 ℃條件下，其窒息點無顯著差異，而(1.22±0.31) g馬口魚幼魚在28 ℃下窒息點顯著降低，說明28 ℃對于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的呼吸代謝有顯著抑制效果，由此可見，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚對于高溫的耐受能力高于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚。由于本試驗溫度梯度設置范圍較大且只有3個梯度，因此具體低溫耐受范圍還需進一步探究。馬口魚是一種溪流型經(jīng)濟魚類，棲息在流動性較大和清澈的水域中，對水質(zhì)的要求較其他魚類幼魚要高，因此在養(yǎng)殖過程中應充分做好溶解氧管理，以避免幼魚期因缺氧導致死亡率劇增。

3.3 低氧脅迫下不同水溫對馬口魚抗氧化指標的影響

魚類抗氧化指標與溫度之間具有相關性，因此被廣泛用于評價魚類新陳代謝的能力和生理健康程度[43-44]?；钚匝跏钦{(diào)控魚類正常生命活動的重要因素，在正常的情況下會保持動態(tài)平衡，但在環(huán)境因子(溫度、溶解氧質(zhì)量濃度等)的脅迫下，魚體內(nèi)的活性氧平衡被打破，對魚體造成氧化壓力[45]。在低氧環(huán)境下，魚體內(nèi)的黃嘌呤脫氫酶可轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，線粒體電子傳遞鏈載體失活，導致活性氧含量增加[46-47]。為應對活性氧的失調(diào)，魚類形成了抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等一系列抗氧化酶。丙二醛是脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量可間接反映機體的活性氧自由基和脂質(zhì)的過氧化水平，從而間接反映出細胞受損傷的程度，該指標多用于水生態(tài)毒理學的研究[48-49]?？偪寡趸芰κ墙暄芯堪l(fā)現(xiàn)的用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，代表和反映機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態(tài)[45]。在低氧環(huán)境下[溶解氧質(zhì)量濃度(2.31±0.41) mg/L]，馬口魚幼魚的超氧化物歧化酶活性隨溫度的升高而升高，但在28 ℃時，(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的超氧化物歧化酶活性有降低的趨勢，表明高溫對(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的抗氧化能力有一定的抑制效果，且(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的超氧化物歧化酶活性顯著高于(1.22±0.31) g的馬口魚幼魚，表明(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的抗氧化能力強于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚；與正常溶解氧[(8.61±0.50) mg/L]相比，低氧環(huán)境下馬口魚的超氧化物歧化酶活性明顯較高，表現(xiàn)出了馬口魚機體對于低氧環(huán)境的適應。在低氧狀態(tài)20 ℃下，(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的丙二醛含量顯著高于(4.91±0.55) g馬口魚幼魚，表明其在低氧脅迫下，(1.22±0.31) g馬口魚幼魚更容易受到低氧環(huán)境的損傷；低氧情況下幼魚的丙二醛含量顯著高于正常溶解氧水平下的含量，表現(xiàn)出在低氧環(huán)境下，幼魚更易受到損傷。在20 ℃和28 ℃低氧環(huán)境下(4.91±0.55) g馬口魚幼魚總抗氧化能力和正常溶解氧環(huán)境的總抗氧化能力無顯著差異；而24 ℃時，低氧環(huán)境下的(4.91±0.55) g馬口魚幼魚總抗氧化能力顯著高于正常溶解氧，此時，低氧下的(4.91±0.55) g馬口魚幼魚抗氧化能力更強，對環(huán)境的耐受能力也更強。將2種規(guī)格幼魚的總抗氧化能力進行對比，發(fā)現(xiàn)(4.91±0.55) g馬口魚幼魚總抗氧化能力高于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚，說明(4.91±0.55) g馬口魚幼魚抗氧化系統(tǒng)強于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚。

4 結 論

與其他魚類相似，馬口魚幼魚的耗氧率和窒息點隨溫度升高呈先升后降趨勢，不同的是馬口魚窒息點較高，且在低氧和溫度脅迫下易受到損傷。因此，養(yǎng)殖過程中應重點關注養(yǎng)殖環(huán)境的適宜性，以期在較高的存活率下，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟價值。