鎘脅迫下水稻OsPT1的表達(dá)及功能分析

姜南 石楊 趙志慧 李斌 趙熠輝 楊俊彪 閆家銘 靳雨璠 陳稷 黃進(jìn)

（1.成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，成都 610059；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

鎘（cadmium，Cd）具有高毒性且不可被生物通過(guò)代謝途徑降解［1］，過(guò)度積累會(huì)抑制水稻光合作用及呼吸作用等生理過(guò)程，導(dǎo)致水稻（Oryza sativa）的株高、根長(zhǎng)、生物量及產(chǎn)量等明顯降低［2-3］。同時(shí)，Cd 具有高遷移性，不僅易被水稻吸收，還會(huì)通過(guò)食物鏈富集于人體，對(duì)人的健康造成損害［4-5］。培育低Cd 積累的水稻品種，減少大米中Cd 的含量，已成為當(dāng)前應(yīng)對(duì)Cd 污染危害主流的研究趨勢(shì)之一［6-8］。研究水稻Cd 吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因及功能為水稻應(yīng)對(duì)Cd 脅迫的機(jī)制及培育低積累Cd 的水稻品種具有重要的借鑒意義［9］。

研究表明，植物可通過(guò)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將重金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外或隔離在液泡及質(zhì)外體中，以降低重金屬對(duì)植物的毒害［10-14］。在這一過(guò)程中，部分依賴于H+偶聯(lián)的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAX（cation/H+exchanger）可依賴跨膜H+質(zhì)子梯度，將Mn2+、Cd2+等游離金屬離子逆濃度梯度地轉(zhuǎn)運(yùn)并隔離在液泡中［15］；而Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1（Na+/H+antiporter）則可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜上H+濃度，將Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外［16］，這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均可藉此增強(qiáng)植物對(duì)Cd 脅迫的耐受性。OsPT1 蛋白（phosphate transporter 1）作為水稻H2PO4-/H+共運(yùn)體Pht1 蛋白家族中的一員，是一種定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們通過(guò)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜上H+濃度梯度參與水稻對(duì)外界磷酸鹽和重金屬砷（As）的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，過(guò)表達(dá)OsPT1水稻在根和葉片中積累了更多的磷酸鹽和As，當(dāng)OsPT1突變后，水稻地上部分As 的積累量顯著降低，表明OsPT1不但參與水稻對(duì)外源磷酸鹽吸收積累，還可能在水稻應(yīng)對(duì)As 脅迫的過(guò)程中發(fā)揮作用［18-20］。而水稻Pht1 家族其他成員（如OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT8 等）也參與水稻對(duì)磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，其中，OsPT4 和OsPT8 還參與對(duì)As 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［21-24］。在對(duì)馬鈴薯StPT7的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其野生型、過(guò)表達(dá)和突變體植株對(duì)干旱脅迫的耐受性依次降低，表明Pht1 蛋白還影響植物的干旱脅迫耐受性［25］。亞麻薺Pht1 家族成員響應(yīng)多種逆境脅迫，其中就包括Cd［26］。

OsPT1 可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜上H+濃度介導(dǎo)水稻Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)，但當(dāng)前研究對(duì)OsPT1 是否在重金屬Cd轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用尚未闡明。前期利用生物信息學(xué)篩選到多個(gè)水稻Cd 響應(yīng)基因，其中包括OsPT1。

本研究以水稻、酵母為材料，克隆OsPT1并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母，驗(yàn)證OsPT1在Cd 脅迫下的功能。利用RT-qPCR 檢測(cè)OsPT1在Cd 脅迫下的表達(dá)情況，為OsPT1的Cd 響應(yīng)功能研究及低積累Cd 的水稻品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子消毒后，置于37℃150 r/min 催芽2 d。隨后種植于1/2 MS 植物培養(yǎng)基（pH=5.8），30℃光照培養(yǎng)5 d。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且株高相近的幼苗，分別種植于含0（對(duì)照）和100 μmol/L CdCl2的1/2 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別在1、6 和12 h 時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取8 株幼苗，對(duì)地上部分和根部分別取樣，立即置于液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 水稻總RNA 提取及cDNA 反轉(zhuǎn)錄 將水稻組織樣品研磨成粉末，利用植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（默飛世爾科技公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 水稻OsPT1的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)OsPT1登錄號(hào)（Locus ID：LOC_Os03g05620），從Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/）網(wǎng)站下載CDS 序列。設(shè)計(jì)OsPT1引物（上游引物OsPT1-F：5'-ATGGCGGGAGGGCAGCTCAACG-3'；下游引物OsPT1-R：5'-TTACTTCGGGTAGGCCGCCTCC-3'）。PCR 反應(yīng)體系為引物各1 μL、模板1 μL、金牌Mix 酶44.5 μL、DMSO 2.5 μL，補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物回收純化后，與pGADT7表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送樣測(cè)序。

1.2.3OsPT1表達(dá)分析 cDNA 稀釋10 倍后作為模板，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)OsPT1的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系為cDNA 3 μL、上下游引物（表1）各1 μL、2×ChamQ Universal SYBR 5 μL。RT-qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。以u(píng)biquitin為內(nèi)參基因，每個(gè)處理3 次重復(fù)，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Quantitative real-time PCR primer sequence

1.2.4OsPT1在酵母中的功能分析 使用聚乙二醇（PEG）-乙酸鋰轉(zhuǎn)化法［27］將pGADT7-OsPT1表達(dá)載體與pGADT7空載體（作為陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)化到Cd敏感型酵母菌株Δycf BY4741（Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 YDR135c::kanMX4）中。在亮氨酸缺陷型（SD-Leu）酵母固體培養(yǎng)基上選擇酵母單克隆，接種于SD-Leu 液體培養(yǎng)基中，30℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。之后用新鮮的SD-Leu 液體培養(yǎng)基稀釋10 倍后再活化培養(yǎng)2 h，將菌液培養(yǎng)至OD600=0.4-0.8，離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌水調(diào)OD600=1。隨后，將5 μL 經(jīng)梯度稀釋的酵母細(xì)胞液（OD600為1.0、0.1、0.01和0.001）點(diǎn)樣到含有2%葡萄糖和25 μmol/L CdCl2的SD-Leu 固體培養(yǎng)基表面，30℃培養(yǎng)3 d，拍照采集數(shù)據(jù)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)分析OsPT1的理化性質(zhì)。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 分析OsPT1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用PHYRE2 Protein Fold Recognition Server（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index，對(duì)OsPT1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)NetPhos v3.1（http://www.cbs.dtu.dk/se rvices/NetPhos/）預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)ProtComp（http://linux1.softberry.com/berry.phtm l?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白的亞細(xì)胞定位。使用NCBI 中的BLAST 功能，找到不同物種中OsPT1 蛋白的同源序列，并通過(guò)軟件MEGA7.0 使用NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 OsPT1的克隆

以水稻cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條約1 600 bp 條帶（圖1-A），與重組載體酶切后的產(chǎn)物大小相近（圖1-B）。經(jīng)測(cè)序，獲得的序列與通過(guò)Rice Genome Annotation Project 網(wǎng)站查詢得到的OsPT1（LOC_Os03g05620）CDS 序列比對(duì)一致，表明成功克隆目的基因。

圖1 OsPT1 的PCR 擴(kuò)增及pGADT7-OsPT1 重組載體的酶切驗(yàn)證Fig.1 PCR amplification of OsPT1 gene and endonuclease digestion of the recombinant vector pGADT7-OsPT1

2.2 OsPT1的生物信息學(xué)分析

2.2.1 OsPT1 的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ExPASy 網(wǎng)站分析OsPT1 的理化性質(zhì)（表2），OsPT1 蛋白分子質(zhì)量為57.46 kD，蛋白分子式為C2656H4021N667O710S25。其編碼氨基酸組成（表3）如下，Ala（A）有67 個(gè)，所占比例最高，為12.7%，Cys（C）有6 個(gè)，所占比例最低，為1.1%。OsPT1帶負(fù)電殘基總數(shù)（Asp+Glu）34 個(gè)，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）38 個(gè)，理論等電點(diǎn)為8.57，不穩(wěn)定指數(shù)為31.09，說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定的弱堿性蛋白。由于此蛋白親和性（GRAVY）平均水平為0.361，而從蛋白的親和性分析（圖2）可以看出，處于正值的蛋白比例明顯大于負(fù)值部分，說(shuō)明此蛋白為疏水性蛋白。

圖2 OsPT1 蛋白親疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of OsPT1 protein

表2 OsPT1 蛋白的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of OsPT1 protein

表3 OsPT1 蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of OsPT1 protein

2.2.2 OsPT1 的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 運(yùn)用SOPMA網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-A），發(fā)現(xiàn)α-螺旋有260 個(gè)氨基酸，占49.34%；延伸鏈有71個(gè)氨基酸，占13.47%；β-轉(zhuǎn)角有24 個(gè)氨基酸，占4.55%；無(wú)規(guī)則卷曲有172 個(gè)氨基酸，占32.64%。使用PHYRE2 網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-B），蛋白質(zhì)中含有大量丙氨酸（Ala），而α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。

圖3 OsPT1 蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary and tertiary structure prediction of OsPT1 protein

2.2.3 OsPT1 蛋白的亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)分析 使用在線工具ProtComp 分析OsPT1 蛋白的亞細(xì)胞定位，OsPT1 蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜上。蛋白質(zhì)的磷酸化可介導(dǎo)蛋白活性，對(duì)生物體內(nèi)很多生理過(guò)程都具有重要的調(diào)控作用。利用在線軟件Net Phos 3.1 分析OsPT1 潛在的磷酸化位點(diǎn)（圖4）發(fā)現(xiàn)，OsPT1 存在34 處潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括14 處潛在的絲氨酸（S）磷酸化位點(diǎn)，14 處潛在的蘇氨酸（T）磷酸化位點(diǎn)，6 處潛在的酪氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)對(duì)OsPT1 蛋白行使功能有著重要意義。

圖4 OsPT1 蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.4 potential phosphorylation sites analysis of OsPT1 protein

2.2.4 OsPT1 的系統(tǒng)進(jìn)化分析 為了研究OsPT1 蛋白在不同物種的進(jìn)化關(guān)系，運(yùn)用NCBI Blast 查詢與OsPT1 蛋白同源性最高的其他物種的蛋白序列，利用MEGA7.0 軟件鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖5）。目的基因編碼的蛋白在雙子葉植物和單子葉植物間分為2 支，與高粱（Sorghum bicolor）的親緣關(guān)系最近。

圖5 PT1 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PT1 proteins

2.2.5OsPT1順式作用元件分析 運(yùn)用PlantCARE網(wǎng)站分析OsPT1上游2 000 bp 啟動(dòng)子區(qū)序列，通過(guò)TBtools 對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。結(jié)果（圖6）顯示，OsPT1上游2 000 bp 啟動(dòng)子區(qū)含有對(duì)光響應(yīng)作用元件CAG-motif、G-Box、AE-box、ACE、GT1-motif、TCT-motif，對(duì)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif，厭氧環(huán)境響應(yīng)元件ARE，對(duì)水楊酸響應(yīng)的元件TCA-element，對(duì)逆境響應(yīng)的元件TC-rich repeats。

圖6 OsPT1 的順式作用元件分析Fig.6 Cis-acting elements analysis of OsPT1 gene

2.3 OsPT1響應(yīng)Cd脅迫的表達(dá)模式

在不同時(shí)間Cd 脅迫下，運(yùn)用RT-qPCR 分析OsPT1水稻幼苗不同組織中的表達(dá)情況，并使用GraphPad Prism 9 軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在Cd處理濃度100 μmol/L 時(shí)，OsPT1在水稻地上部分的相對(duì)表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)。在處理1、6 和12 h 后，OsPT1在植物地上部分的轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)至處理前的1.31、1.34 和2.46 倍（圖7-A）。而在根中，處理時(shí)間為1 和6 h 時(shí)，OsPT1的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了1.28和1.14 倍；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到12 h 時(shí)，OsPT1的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，約為0.62 倍（圖7-B）。OsPT1相對(duì)表達(dá)量的變化表明其能夠響應(yīng)Cd 脅迫。

圖7 OsPT1 響應(yīng)Cd 脅迫表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of OsPT1 under Cd stress treatment

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母的Cd耐受性分析

將轉(zhuǎn)基因酵母與空載體酵母經(jīng)25 μmol/L Cd 處理3 d 后，與對(duì)照組（0 μmol/L Cd）相比，轉(zhuǎn)入目的基因的酵母在含25 μmol/L Cd 的SD-Leu 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活性較空載體酵母弱（圖8），表明OsPT1在一定程度上降低了酵母細(xì)胞對(duì)Cd 的耐受性。

圖8 OsPT1 對(duì)酵母Cd 敏感性的影響Fig.8 Effects of OsPT1 on the sensibility of Cd in yeast

3 討論

水稻在進(jìn)化和發(fā)育過(guò)程中，形成了一套應(yīng)對(duì)Cd脅迫的調(diào)控機(jī)制，這些調(diào)控機(jī)制的發(fā)揮依賴各種已知和未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［28-29］。OsPT1 作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸鹽及重金屬As 方面具有重要作用。除此之外，OsPT1 對(duì)水稻莖和根毛的伸長(zhǎng)及分蘗等生長(zhǎng)發(fā)育也具有調(diào)控作用［18］。但對(duì)于其在重金屬Cd 脅迫下的功能未知。

本研究通過(guò)對(duì)OsPT1的順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因上游啟動(dòng)子區(qū)含有與光、厭氧、茉莉酸甲酯等環(huán)境和激素相關(guān)的元件，同時(shí)還含有防御與應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)元件，推測(cè)其可能參與多種非生物脅迫［30］，并受到激素的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，蘋(píng)果酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdALMT14 具有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，可被磷酸化修飾以減少蘋(píng)果對(duì)Cd 的吸收［31］。本研究對(duì)OsPT1 磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其含有14 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)OsPT1 依賴這些位點(diǎn)的磷酸化修飾來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)活性，發(fā)揮生物學(xué)功能，介導(dǎo)對(duì)Cd 的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)，但尚未有相關(guān)研究進(jìn)行報(bào)道。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示OsPT1 與禾本科植物高粱SbPT1、玉米（Zea mays）ZmPT1、大麥（Hordeum vulgare）HvPT1 及小麥（Triticum aestivum）TaPT1親緣關(guān)系較近，表明同一科物種的PT1 蛋白同源性更高。雖無(wú)這些蛋白在響應(yīng)重金屬脅迫過(guò)程中功能的相關(guān)報(bào)道，但對(duì)與OsPT1 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtPT1 研究發(fā)現(xiàn)，AtPT1 也參與對(duì)As 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［32］，表明在植物中PT1 功能較為保守。

為進(jìn)一步探究OsPT1響應(yīng)Cd 脅迫的表達(dá)特性及功能，本研究通過(guò)RT-qPCR 分析了在100 μmol/L濃度Cd 處理下OsPT1的相對(duì)表達(dá)量，并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因酵母研究OsPT1對(duì)酵母Cd 敏感性的影響。RTqPCR 分析發(fā)現(xiàn)，在Cd 處理1 h 和6 h 后，OsPT1在水稻所有組織中的表達(dá)量均上調(diào)，推測(cè)該基因可能參與水稻應(yīng)對(duì)Cd 脅迫的調(diào)控機(jī)制。前人研究發(fā)現(xiàn)，OsPT1的表達(dá)與其功能相適應(yīng)［33］，在添加As 后能顯著誘導(dǎo)OsPT1在根中的表達(dá)、降低在地上部分的表達(dá)，同時(shí)根中As 積累量顯著高于地上部分［19,21］。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cd 處理后12 h，OsPT1在根中表達(dá)上調(diào)、在地上部分表達(dá)下調(diào)，與As 處理不同的表達(dá)模式也暗示OsPT1在水稻應(yīng)對(duì)Cd 脅迫中所發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制與As 不同，進(jìn)一步推測(cè)OsPT1在水稻早期參與地上部分對(duì)Cd 的再分配，而在根部參與減少水稻對(duì)Cd 的吸收。此外，有研究表明，磷在植物中可通過(guò)提高Cd 脅迫下抗氧化酶的活性以增強(qiáng)植株對(duì)Cd 的耐受性［34］，OsPT1的表達(dá)在地上部上升，預(yù)示著在Cd 處理下水稻在地上部分積累了更多的磷，可能據(jù)此緩解Cd 的毒性；在Cd 處理后1 h 和6 h根中OsPT1的表達(dá)量無(wú)顯著變化，但在處理后12 h表達(dá)量卻下調(diào)，預(yù)示著水稻對(duì)磷酸鹽的吸收減少，這可能是Cd 導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢的原因之一。前人研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)OsPT1基因的磷吸收缺陷型酵母能夠恢復(fù)其生長(zhǎng)活性，表明OsPT1 在酵母中也發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)磷的功能［18］。而在本研究中，表達(dá)OsPT1的酵母對(duì)Cd 的耐受性有所減弱，可能預(yù)示著OsPT1 也具有轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 的功能，通過(guò)將Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，降低了酵母菌株的生長(zhǎng)活性。此外，最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)酵母補(bǔ)充磷酸鹽的過(guò)程中，Cd 對(duì)酵母的毒性顯著增強(qiáng)，且該研究認(rèn)為這一結(jié)果可能由于產(chǎn)生了更多的活性氧造成的［35］。而本研究中轉(zhuǎn)OsPT1的酵母顯示出對(duì)Cd 的耐受性減弱，也可能由于OsPT1 轉(zhuǎn)運(yùn)了更多的磷酸鹽至酵母細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致活性氧含量上升從而降低了酵母對(duì)Cd 的耐受性。目前已有多項(xiàng)研究表明，在施加外源磷的條件下，水稻植株積累了更多的Cd［36-38］，預(yù)示著水稻對(duì)Cd 與磷的轉(zhuǎn)運(yùn)存在著協(xié)同作用，然而造成該現(xiàn)象的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果表明，OsPT1可能參與水稻對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)機(jī)制，結(jié)合前人研究推測(cè)OsPT1 不僅參與對(duì)外源磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)也在水稻吸收Cd 的過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。然而，這些機(jī)制均有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究對(duì)OsPT1響應(yīng)重金屬Cd 脅迫的功能進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并分析了Cd 脅迫下該基因的表達(dá)模式和功能，初步推測(cè)該基因可能在水稻抵御重金屬脅迫過(guò)程中發(fā)揮某種調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供參考，同時(shí)本研究也提出有關(guān)磷、Cd 共存時(shí)對(duì)水稻生長(zhǎng)影響的新見(jiàn)解。但對(duì)于OsPT1在這些過(guò)程中具體的調(diào)控作用尚不明確，因此后續(xù)可通過(guò)構(gòu)建水稻OsPT1的突變體植株和過(guò)表達(dá)植株，在Cd 脅迫處理下對(duì)水稻的表型特征及重金屬抵御相關(guān)的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，以進(jìn)一步明確OsPT1在應(yīng)對(duì)重金屬過(guò)程中的功能機(jī)制。

4 結(jié)論

克隆獲得OsPT1，其CDS 序列全長(zhǎng)為1 584 bp，共編碼527 個(gè)氨基酸。OsPT1 蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，與高粱SbPT1 親緣關(guān)系最近，分子量為57.46 kD，等電點(diǎn)為8.57，是一個(gè)穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)，含有許多與光、厭氧、茉莉酸甲酯等環(huán)境和激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件；含有34 處潛在的磷酸化位點(diǎn)；OsPT1可一定程度降低酵母細(xì)胞對(duì)Cd 的耐受性。