LncRNA MCF2L-AS1靶向調(diào)控miR-138-5p對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

徐梅玲 張育珠 申大年

(1青海省第五人民醫(yī)院疼痛科，青海 西寧 810007；2西寧市第一人民醫(yī)院疼痛科；3青海省第五人民醫(yī)院泌尿科)

骨質(zhì)疏松(OP)以骨量減少、骨組織結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣?，隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展，患有OP病例逐漸升高，加重了患者家人及社會(huì)的負(fù)擔(dān)〔1〕。成骨細(xì)胞是骨重建中維持骨量的主要細(xì)胞之一，是骨形成過(guò)程中的重要功能細(xì)胞，其來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化失衡是引發(fā)OP的關(guān)鍵〔2,3〕。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)廣泛參與BMSCs成骨分化進(jìn)程，調(diào)節(jié)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞的增殖與凋亡，在干細(xì)胞的多能分化及骨科相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展起重要的調(diào)控作用〔4〕。MCF2L可增加滑膜成纖維細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔5〕。MCF2L的反義RNA1(MCF2L-AS1)是一種lncRNA，研究報(bào)道MCF2L-AS1通過(guò)使miR-33a海綿化而積極調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)，可促進(jìn)BMSCs的成骨分化〔6〕。但MCF2L-AS1對(duì)BMSCs分子機(jī)制尚不清楚。研究顯示，MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞過(guò)程中has-miR-138-5p減少〔7〕。高脂環(huán)境下BMSCs向成骨細(xì)胞分化減少，miR-138-5p參與調(diào)控高脂環(huán)境下骨代謝和成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性〔8〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究MCF2L-AS1可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-138-5p對(duì)BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1組織來(lái)源 收集手術(shù)切除的正常骨組織和OP患者的疏松骨組織各25例。所選病例資料完整，無(wú)代謝性相關(guān)疾病病史及慢性用藥史。

1.2細(xì)胞與主要藥品 hBMSCs購(gòu)自廣州賽萊拉干細(xì)胞科技公司；成骨分化培養(yǎng)基購(gòu)自德國(guó)PromoCell公司；人BMSCs(hBMSCs)完全培養(yǎng)基購(gòu)自武漢益普生物；熒光定量試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博；CCK-8、凋亡試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自北京索萊寶。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將hBMSCs接種于hBMSCs完全培養(yǎng)基中，在37℃水浴中進(jìn)行復(fù)蘇；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hBMSCs，將其接種于成骨分化培養(yǎng)基中在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，分別收集第0、1、3、7、14天培養(yǎng)細(xì)胞備用。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將si-NC、si-MCF2L-AS1、miR-NC、miR-138-5p、pcDNA-NC、pcDNA-MCF2L-AS1轉(zhuǎn)染至hBMSCs中，記為si-MCF2L-AS1組、si-NC組、miR-138-5p組、miR-NC組、pcDNA-MCF2L-AS1組、pcDNA-NC組；將si-MCF2L-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-138-5p共轉(zhuǎn)染，記為si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組和si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、ALP、RUNX2、OCN表達(dá)水平 提取正常骨組織、OP患者骨組織、誘導(dǎo)分化0、1、3、7、14 d的hBMSCs及各組細(xì)胞的總RNA，合成cDNA，按熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。以GAPDH和U6為作為內(nèi)參，MCF2L-AS1上游引物：5′-TCCAGCTCGTGTCTATG-CAG-3′，下游：5′-CTGCTTCTGCCTCAG-CTTCT-3′；miR-138-5p上游引物：5′-TGCGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3′，下游：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；ALP上游引物：5′-GCCATTGGCACCTGCCTTAC-3′，下游：5′-AGCTCCAGGCATATTTCAGTGTC-3′；RunX2上游引物：5′-CCGGTCTCCTTCCAGGAT-3′，下游：5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′；OCN上游引物：5′-ACCCTCTCTCTGCTCACTCTGCT-3′，下游：5′-GCTGGGGCTCCAAGTCCATT-3′。

1.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加一抗4℃孵育過(guò)夜，加二抗室溫孵育90 min，顯影、成像，檢測(cè)蛋白條帶的灰度值。

1.7CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加10 μl CCK-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(A)。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)混勻，避光孵育10 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的靶向關(guān)系 構(gòu)建含有miR-138-5p結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA MCF2L-AS1野生型及突變型報(bào)告基因載體，hBMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1野生型及突變型載體，按說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p在OP的表達(dá)水平 OP骨組織中LncRNA MCF2L-AS1表達(dá)水平明顯低于正常骨組織，miR-138-5p表達(dá)水平明顯高于正常骨組織(均P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 OP患者中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表達(dá)水平

2.2在hBMSCs分化培養(yǎng)中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表達(dá)水平 與0 d相比，在hBMSCs分化培養(yǎng)1、3、7、14 d時(shí)LncRNA MCF2L-AS1表達(dá)、ALP、RUNX2、OCN表達(dá)水平明顯升高，miR-138-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 在hBMSCs分化培養(yǎng)中LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p及成骨分化相關(guān)因子的表達(dá)水平

2.3低表達(dá)LncRNA MCF2L-AS1對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 與si-NC組相比，si-MCF2L-AS1組Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率明顯升高，LncRNA MCF2L-AS1表達(dá)、ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2、表3。

圖1 低表達(dá)LncRNA MCF2L-AS1對(duì)hBMSCs細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Western印跡檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表3 低表達(dá)LncRNA MCF2L-AS1對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

2.4高表達(dá)miR-138-5p對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 與miR-NC組相比，miR-138-5p組miR-138-5p表達(dá)水平、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率明顯升高，ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖3。

表4 高表達(dá)miR-138-5p對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

圖3 高表達(dá)miR-138-5p對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.5LncRNA MCF2L-AS1靶向miR-138-5p 圖4顯示MCF2L-AS1與miR-138-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC組比較，miR-138-5p降低WT熒光素酶活性(P<0.001)；對(duì)MUT熒光素酶活性無(wú)顯著差異，見(jiàn)表5。pcDNA-MCF2L-AS1組miR-138-5p表達(dá)水平(0.43±0.04)明顯低于pcDNA-NC組(1.00±0.08，P<0.05)，si-MCF2L-AS1組miR-138-5p表達(dá)水平(1.73±0.11)明顯高于si-NC組(0.98±0.09，P<0.05)。

表5 雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖4 miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1結(jié)合位點(diǎn)

2.6低表達(dá)miR-138-5p部分逆轉(zhuǎn)MCF2L-AS1低表達(dá)對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組miR-138-5p表達(dá)水平、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率明顯低于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組，ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞增殖率明顯高于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表6、圖5。

表6 低表達(dá)miR-138-5p 可以部分逆轉(zhuǎn)MCF2L-AS1低表達(dá)對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

1～2：si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組，si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組圖5 低表達(dá)miR-138-5p 和MCF2L-AS1對(duì)hBMSCs細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

OP患者BMSCs成骨分化能力減弱，因此增強(qiáng)BMSCs的成骨分化能力及促進(jìn)BMSCs增殖、抑制凋亡是防治OP的重要途徑之一〔9〕。研究報(bào)道LncRNA影響B(tài)MSCs的成骨分化進(jìn)而影響骨代謝進(jìn)程〔10〕。且已有研究表明LncRNA MCF2L-AS1參與BMSCs的成骨分化〔6〕。本研究結(jié)果表明，LncRNA MCF2L-AS1的確參與了BMSCs的成骨分化過(guò)程，且與OP的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示，ALP、RunX2、OCN表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高。

ALP、RUNX2、OCN均是成骨分化相關(guān)因子，ALP是骨組織分解代謝的一種酶，與鈣化有關(guān)，可反映成骨細(xì)胞分化及功能狀態(tài)〔11〕。RUNX2是成骨細(xì)胞分化及骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，RUNX2能調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞向前成骨細(xì)胞分化〔12〕。OCN由成熟骨細(xì)胞分泌，是骨細(xì)胞成熟標(biāo)志〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低表達(dá)LncRNA MCF2L-AS1可抑制hBMSCs增殖促進(jìn)細(xì)胞、凋亡及抑制成骨分化。

研究報(bào)道在力學(xué)去負(fù)荷條件下miR-138-5p表達(dá)水平明顯升高，成骨細(xì)胞分化能力降低；而 抑制miR-138-5p能有效地逆轉(zhuǎn)力學(xué)去負(fù)荷對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用〔14〕。非病毒寡核苷酸抗miR-138傳遞至間充質(zhì)干細(xì)胞可顯著增強(qiáng)BMSC片的體外成骨分化，上調(diào)成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、OCN和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2表達(dá)〔15〕。miR-138可抑制人去分化軟骨細(xì)胞的成骨分化和礦化作用〔16〕，表明miR-138-5p參與成骨分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。還有研究報(bào)道LOC103691336競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-138-5p從而上調(diào)BMPR2的表達(dá)促進(jìn)鎂介導(dǎo)的成骨分化〔17〕。本實(shí)驗(yàn)提示，MCF2L-AS1可能通過(guò)調(diào)控miR-138-5p影響hBMSCs增殖、凋亡和成骨分化。

綜上，低表達(dá)LncRNA MCF2L-AS1通過(guò)調(diào)控miR-138-5p抑制hBMSCs增殖和成骨分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。低表達(dá)LncRNA MCF2L-AS1可能抑制hBMSCs成骨分化影響OP的發(fā)展。