基于IL-6/STAT3通路探討血塞通對血栓閉塞性脈管炎大鼠的保護作用

杜建青 汪立 吳忠隱 張弘 (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院血管外科，河北 承德 067000)

血栓閉塞性脈管炎(TAO)是一種炎癥性血管疾病，主要影響四肢中的中小型血管，其主要病理生理改變?yōu)橹車苎装Y和閉塞，臨床輕癥表現(xiàn)為四肢受損，重癥可出現(xiàn)肢體潰瘍，迫使患者截肢，但其傳統(tǒng)治療效果并不理想〔1〕。血塞通主要成分是五加科人參屬植物三七提取物，用于心腦血管疾病的治療，具有抑制血小板凝聚、降低血液黏稠度、抑制血栓形成的作用，聯(lián)合低分子肝素能明顯改善大隱靜脈曲張高位結扎剝脫術患者術后血液高凝狀態(tài)，有效減少深靜脈血栓形成〔2〕，還可通過下調信號轉導及轉錄激活因子(STAT)3信號通路，抑制缺血性腦卒中大鼠神經元細胞凋亡〔3〕。STAT3信號通路可參與細胞增殖、分化、免疫調節(jié)等多種重要的生物學進程，白細胞介素(IL)-6為其上游因子，而IL-6表達的增加可進一步激活Janus激酶(JAK)2/STAT3信號通路〔4〕。另外，抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)活性，可降低血管炎大鼠人臍靜脈內皮細胞和血管組織中炎性因子的表達，減輕大鼠肢體損傷〔5〕。但血塞通是否調控IL-6/STAT3通路對TAO大鼠起保護作用，目前尚未有報道。本研究采用月桂酸鈉注射法構建TAO大鼠模型，使用血塞通和STAT3激活劑Colivelin干預該模型，旨在從IL-6/STAT3通路揭示血塞通對TAO大鼠的保護作用，為血塞通在臨床上對TAO的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠(75只，雄性，體重200～220 g)購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(渝)2018-0003，符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規(guī)定。按照3R原則給予實驗動物人道的關懷照顧。

1.1.2實驗藥物 血塞通(批準文號：國藥準字Z53021486)購自云南維和藥業(yè)股份有限公司；Colivelin(STAT3激活劑，在體外和體內增加STAT3的磷酸化，規(guī)格：1 mg，產品編號：sc-361153)，購自MCE公司。

1.1.3主要試劑和儀器 大鼠血栓形成素(TX)B2、6-酮-前列腺素(6-Keto-PG)F1α、纖維蛋白原(Fg)、一氧化氮(NO)、內皮素(ET)-1和血管內皮生長因子(VEGF) ，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、JAK2、STAT3和磷酸化(p)-STAT3鼠抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司；酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司。

1.2方法

1.2.1TAO大鼠模型的建立及分組 采用月桂酸鈉注射法〔6〕構建TAO大鼠模型：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，仰臥位固定于手術臺上，剔除左下肢股內側毛發(fā)，2%碘伏消毒皮膚，于腹股溝中點至膝內側縱行長為1.5～2.0 cm切口，依次分離皮下組織，游離股動脈，使用動脈夾夾閉股動脈近心端，阻斷血流，于動脈夾下方遠心端注入0.2 ml 10 mg/ml月桂酸鈉溶液(假手術組注射0.2 ml生理鹽水)，當血管明顯充盈，略顯白色但無明顯腫脹時，輕柔取針。注射15 min后松開動脈夾，檢查確保無活動性出血后，即可縫合皮膚，各組大鼠術后均腹腔注射青霉素預防感染。造模完成當日，大鼠患肢足爪處變蒼白，甚至青紫，次日患肢足趾變黑，有形成壞疽和木乃伊化的趨勢則證明造模成功〔7〕。將造模成功的60只大鼠使用隨機數(shù)字表法分為模型組、血塞通組(灌胃50 mg/kg〔8〕)、Colivelin組(STAT3激活劑Colivelin〔9〕，1 mg/kg，腹腔注射)、血塞通+Colivelin組(灌胃50 mg/kg血塞通同時腹腔注射1 mg/kg STAT3激活劑Colivelin)，每組15只，另取15只大鼠為假手術組。假手術組和模型組大鼠給予等劑量生理鹽水，各組每天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.2.2觀察并評價大鼠基本情況和病變程度 末次給藥結束后，觀察大鼠患肢處皮膚顏色、有無腫脹、壞疽及壞疽程度。根據(jù)大鼠患肢情況，將病變程度分為以下級別：0級表現(xiàn)為正常，Ⅰ級表現(xiàn)為僅趾甲部出現(xiàn)病變，Ⅱ級表現(xiàn)為僅趾部出現(xiàn)病變，Ⅲ級表現(xiàn)為足爪部出現(xiàn)病變，Ⅳ級表現(xiàn)為膝關節(jié)以下出現(xiàn)病變，Ⅴ級表現(xiàn)為病變發(fā)展到膝關節(jié)以上，觀察統(tǒng)計各組大鼠出現(xiàn)上述不同級別病變的只數(shù)。

1.2.3HE染色觀察各組大鼠股動脈組織病理學變化 上述1.2.2觀察實驗結束后，各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉實施安樂死，股動脈取血約5 ml，分離血清后置于4℃冰箱中，用于后續(xù)ELISA檢測。取各組大鼠患肢處注射月桂酸鈉以下部位的股動脈組織(包括動脈和靜脈主干)，其中5只大鼠該部位組織迅速置于4%多聚甲醛中固定(剩余10只大鼠該部位迅速置于-80℃冰箱，用于后續(xù)ELISA，另取所有大鼠患處肌肉組織迅速置于-80℃冰箱，用于后續(xù)Western印跡檢測)，然后高濃度到低濃度乙醇脫水、二甲苯透明，最后進行石蠟包埋，采用切片機做常規(guī)病理切片，按照HE染色試劑盒說明書進行染色后，置于光學顯微鏡下觀察各組股動脈組織病理學變化。

1.2.4ELISA法檢測各組血栓形成因子及內皮功能相關因子含量 取出上述1.2.3中置于4℃冰箱的各組大鼠血清及-80℃冰箱中的股動脈組織，分別采用TXB2、6-Keto-PGF1α、Fg、NO、ET-1和VEGF ELISA試劑盒，嚴格按照說明書操作步驟分別檢測各自含量。

1.2.5Western印跡檢測各組IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平 取上述1.2.3中置于-80℃冰箱中的各組患側肌肉組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。取50 g蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉膜、抗體封閉、1∶1 000濃度稀釋后的IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3和p-STAT3鼠抗4℃過夜孵育、置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶2 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內參，分析各組蛋白表達水平。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠基本情況和病變程度比較 假手術組大鼠基本正常，無明顯病變，15只均為0級；模型組大鼠患肢足爪或蒼白或青紫或暗灰，有跛行或曳行現(xiàn)象，病變程度多處于Ⅳ級(9只)，Ⅴ級2只，Ⅲ級4只。與模型組相比，血塞通組大鼠上述病變明顯減輕，病變程度多為Ⅰ級(9只)，0級5只，Ⅱ級1只；Colivelin組上述病變情況明顯加重，病變程度多為Ⅴ級(8只)，Ⅳ級5只，Ⅲ級2只。血塞通+Colivelin組大鼠病變程度(Ⅳ級7只，Ⅲ級5只，Ⅱ級2只，Ⅴ級1只)較血塞通組加重，較Colivelin組減輕。

2.2各組股動脈組織病理學變化比較 假手術組股動脈組織血管形態(tài)完整，無明顯病理現(xiàn)象；模型組股動脈組織血管有大量血栓形成，內皮細胞脫落嚴重。與模型組相比，血塞通組股動脈組織血管及內皮細胞病理現(xiàn)象明顯減輕；Colivelin組股動脈組織血管及內皮細胞病理現(xiàn)象明顯加重。血塞通+Colivelin組股動脈組織病理現(xiàn)象較血塞通組加重，較Colivelin組減輕。見圖1。

圖1 各組股動脈組織病理變化(HE染色，×100)

2.3各組血清中血栓形成因子含量比較 與假手術組相比，模型組血清中TXB2和Fg含量顯著升高，6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，血塞通組血清中TXB2和Fg含量顯著降低，6-Keto-PGF1α含量顯著升高(P<0.05)；與血塞通組相比，血塞通+Colivelin組血清中TXB2和Fg含量顯著升高，6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P<0.05)；與Colivelin組相比，血塞通+Colivelin組大鼠血清中TXB2和Fg含量顯著降低，6-Keto-PGF1α含量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中血栓形成因子含量、IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達水平及STAT3磷酸化水平比較

2.4各組股動脈組織中內皮功能相關因子含量比較 與假手術組相比，模型組股動脈組織中NO含量顯著降低，ET-1和VEGF含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，血塞通組股動脈組織內中NO含量顯著升高，ET-1和VEGF含量顯著降低(P<0.05)；Colivelin組股動脈組織中NO含量顯著降低，ET-1和VEGF含量顯著升高(P<0.05)。與血塞通組相比，血塞通+Colivelin組股動脈組織中NO含量顯著降低，ET-1和VEGF含量顯著升高(P<0.05)；與Colivelin組相比，血塞通+Colivelin組股動脈組織中NO含量顯著升高，ET-1和VEGF含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組內皮功能相關因子含量比較

2.5各組患側肌肉中IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達水平及STAT3磷酸化水平比較 與假手術組相比，模型組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達及STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，血塞通組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達及STAT3磷酸化水平顯著降低(P<0.05)，Colivelin組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達及STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。與血塞通組相比，血塞通+Colivelin組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達及STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。與Colivelin組相比，血塞通+Colivelin組IL-6、TNF-α和JAK2蛋白表達及STAT3磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。見表1和圖2。

1～5：假手術組、模型組、血塞通組、Colirelin組、血塞通+Colivelin組圖2 各組IL-6、TNF-α、JAK2、STAT3、p-STAT3水平表達

3 討 論

TAO是一種影響四肢小血管的非動脈粥樣硬化炎癥性疾病，病變主要累及四肢及遠端中小動靜脈，病理表現(xiàn)為出現(xiàn)大量浸潤性血栓、炎癥反應及內皮功能障礙，臨床表現(xiàn)為患肢缺血、疼痛、發(fā)涼，麻木等〔10〕。

隨著對中醫(yī)藥的不斷研究，人們發(fā)現(xiàn)以三七皂苷為主要成分的血塞通具有活血祛瘀，通脈活絡，增加腦血流量的作用。Zhao等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)血塞通注射液可用于治療心腦血管疾病，具有保護心血管，減輕心肌缺血/再灌注損傷的作用。在常規(guī)治療的基礎上加用注射用血塞通可減少大腦中動脈粥樣硬化性引起的微血栓，可降低缺血性事件發(fā)生率，且未產生不良反應的發(fā)生〔12〕。而塞通分散片已被臨床證實是治療心腦血管疾病的有效藥物〔13〕。多種炎癥性血瘀患者體內Fg、TXB2和ET-1含量顯著增加，6-Keto-PGF1α表達量顯著降低〔14，15〕，抑制ET水平，提高NO水平，可緩解血管內皮細胞功能障礙〔16〕。Zhang等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)降低股動脈中TXB2、ET-1和TNF-α表達，增加6-Keto-PGF1α的表達，可改善TAO大鼠股動脈病理特征。提示血塞通可緩解TAO大鼠內皮血管功能障礙，對TAO大鼠起保護作用，但其中的機制尚需進一步研究。

STAT3為一類由750～800個氨基酸組成的DNA結合蛋白，可介導細胞的惡性轉化，參與腫瘤的增殖、分化、血管生成、侵襲轉移和免疫逃避等生理功能的調控。Liu等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)激活IL-6/JAK2/STAT3通路可誘發(fā)小鼠漿細胞乳腺炎，Wei等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)IL-6/STAT3通路的激活可通過引起血管內皮細胞功能障礙參與TAO的發(fā)病機制，而抑制IL-6/STAT3信號通路可減輕炎癥損傷〔20〕。本研究提示，血塞通可能通過抑制IL-6/STAT3通路，對TAO大鼠起保護作用。本研究提示，血塞通對TAO大鼠的保護作用可被STAT3激活劑Colivelin逆轉，進一步揭示血塞通可能通過抑制IL-6/STAT3通路，保護TAO大鼠。

綜上所述，血塞通可通過抑制IL-6/STAT3通路，緩解TAO大鼠血管內皮功能障礙，減輕炎癥反應，對TAO大鼠起保護作用。然而TAO病理過程可能涉及其他機制，因此血塞通的具體作用機制仍有待進一步完善。