牡丹籽油對(duì)去睪丸小鼠骨骼的影響

陳彩玲 鄭曉艷 王可欣 劉翠娟 田佳 鐘燕婷 林瑞 吳鐵 許碧蓮 崔燎，3

(1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；2廣東醫(yī)科大學(xué)·廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心；3廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織定義，骨質(zhì)疏松(OP)是以單位骨量減少及骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，并導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能下降，骨脆性增加、發(fā)生骨折及相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加的一種全身性骨骼疾病〔1〕。隨著年齡的增長(zhǎng)，中老年男性的睪酮水平逐漸降低，發(fā)生睪酮缺乏〔2,3〕。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為老年男性O(shè)P主要與增齡性退化有關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)男性與女性相似，性激素水平在調(diào)節(jié)骨質(zhì)量和骨代謝中起重要作用，睪酮缺乏是老年男性O(shè)P常見的繼發(fā)因素之一，睪丸激素水平與骨折風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)〔4〕。男性性腺功能低下，雄激素不敏感綜合征和接受雄激素剝奪療法的前列腺癌與骨質(zhì)流失和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)〔5〕。臨床研究表明對(duì)雄激素缺乏的男性O(shè)P患者補(bǔ)充雄激素有緩解作用〔6〕，隨著各種雄激素補(bǔ)充劑的出現(xiàn)，如睪丸甾類，睪酮酯，烷基化睪酮，新雄激素制劑的普遍運(yùn)用〔7〕，副作用也越來越明顯，包括前列腺增生和前列腺癌〔8〕。為減少不良反應(yīng)，人們相繼研究開發(fā)選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑,如SARM，NEP28〔9〕，GTx-024〔10〕。

牡丹籽油(PSO)是從牡丹種子中提取的一種新型植物油，含有豐富的不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)：硬脂酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸和α硬亞麻酸，以α麻亞麻酸為主〔11〕，具有較高營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，依據(jù)國家《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》分析和探討PSO的毒理學(xué)作用，PSO無急性毒性、遺傳毒性和亞急性毒性，具有較高的食用安全性，作為功能性食品之一〔12〕。研究表明，PSO能可以降血糖〔13〕、降血脂〔14〕，其中含有的多不飽和脂肪酸具有潛在的抗炎和抗氧化活性〔15〕，對(duì)自由基和體內(nèi)抗氧化能力具有較強(qiáng)的清除作用，可保護(hù)多種生物因素引起的氧化損傷〔16〕，還可對(duì)抗小鼠的衰老模型〔17〕，目前PSO對(duì)去睪丸小鼠骨組織的影響尚未見研究。本研究探討PSO對(duì)去睪丸小鼠骨骼的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)4周齡雄性KM小鼠，體重(26±1)g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002。

1.2藥物與試劑 TU購于浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)：H10970240。PSO購于廣東省廣州市番禺南利油脂制品有限公司，批號(hào)：LS/T3242。生理鹽水，購于廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H19042908。

1.3儀器 PTY-224-423 電子天平( 福州華志科學(xué)儀器有限公司)；858 Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)(美國MST公司) ；Viva Micro CT 40(SCANCO Medical AG) 。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 4周齡小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w后，按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組法，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、去睪丸(ORX)組、TU組、PSO組，每組10只。Sham組進(jìn)行假手術(shù)，其余組均進(jìn)行雙側(cè)睪丸摘除手術(shù)。術(shù)后第2天開始灌胃給藥，Sham和ORX組給予溶劑對(duì)照，TU組給予TU 10.4 mg/kg，PSO組給予牡丹籽油0.1 ml/10 g，給藥1次/d，連續(xù)給藥8 w。

1.5觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1體重的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)開始后，每周稱量小鼠體重1次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。取材前稱體重作為最后的體重。第1次體重和最后的體重差值為體重增長(zhǎng)值(△W)。

1.5.2骨生物力學(xué)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取左側(cè)股骨，去除股骨周圍的肌肉和肌腱，采用Lloyd LR5K Plus 骨生物力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)和分析標(biāo)本的生物力學(xué)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)采用三點(diǎn)彎曲法，步驟如下：將小鼠左側(cè)股骨置于試驗(yàn)機(jī)上，用1 mm直徑的壓頭，加載速度為2 mm/min，跨距為20 mm，股骨加壓至發(fā)生骨折，這可提供屈服點(diǎn)和骨折參數(shù)的測(cè)量，儀器將及時(shí)記錄出每個(gè)時(shí)刻點(diǎn)的載荷和橈度變化值，繪制出載荷-位移曲線，然后讀取最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷，并計(jì)算剛性系數(shù)。

1.5.3Micro-CT的檢測(cè) 將小鼠左側(cè)股骨除盡肌肉和附著組織，放入微型計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)儀，對(duì)股骨干骺端進(jìn)行X射線掃描。viva CT40選擇掃描參數(shù):圖像矩陣為2 048×2 048，整合時(shí)間為200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp，114 μA，8 W。以0°旋轉(zhuǎn)進(jìn)行掃描。掃描完成后，選取距生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域(ROI)行三維重建，以最低閾值為150提取圖像信息。定量分析使用SCANCO Medical AG軟件，分析參數(shù)。參數(shù)如下：連接密度(ConnD)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、體積骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.5.4血清指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠眼球取血于1.5 ml EP管中4℃靜置4 h，3 000 r/min離心10 min取上層血清。按照相應(yīng)試劑盒說明書，測(cè)血清指標(biāo)：超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素(IL)-6、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)體重及△W 與Sham組比較，ORX組ΔW下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與ORX組比較，TU組和POS組ΔW明顯上升(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)體重及ΔW比較

2.2各組骨生物力學(xué)性能的變化 與Sham組相比，ORX組彈性載荷明顯降低(P<0.05)；與ORX組相比，TU組剛性系數(shù)明顯升高(P<0.01)，PSO組最大載荷、彈性載荷和剛性系數(shù)均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3各組股骨骨微結(jié)構(gòu)的變化 與Sham組相比，ORX組Micro-CT參數(shù)中Conn.D.、BV/TV、Tb.N均明顯下降(P<0.01)，而SMI和Tb.Sp明顯增大(P<0.05，P<0.01)；與ORX組比較，TU組Conn.D.、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯增大，而SMI、Tb.Sp均明顯下降(P<0.05，P<0.01)；PSO組Conn.D.、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯增大，SMI、Tb.Sp均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4各組血清生化指標(biāo)檢測(cè) 與Sham組相比，ORX組IL-6、hs-CRP含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與ORX組比較，TU組hs-CRP含量明顯降低(P<0.05)；與ORX組比較，POS組血清SOD含量明顯增加(P<0.01)，MDA、IL-6、Hs-CRP含量有下降趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組股骨遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)及血清生化指標(biāo)比較

3 討 論

在臨床上，雄激素剝奪療法是治療前列腺癌的有效方法，但研究發(fā)現(xiàn)其與骨質(zhì)流失和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)〔18〕，也常常采用唑來膦酸〔19〕、雙膦酸鹽〔20〕等藥物預(yù)防雄激素阻斷引起的骨丟失。在眾多動(dòng)物模型中尋找合適的雄激素缺乏引起的OP模型，發(fā)現(xiàn)睪丸切除術(shù)引起的原發(fā)性腺功能減退是誘導(dǎo)動(dòng)物睪丸激素缺乏的首選方法，且符合臨床雄激素剝奪療法，并且有研究表明去睪丸模型大鼠出現(xiàn)骨礦物質(zhì)密度和含量降低，骨骼的微結(jié)構(gòu)損傷〔21〕。臨床研究數(shù)據(jù)顯示，TU對(duì)雄激素水平下降引起的老年男性O(shè)P的骨量及骨代謝有影響〔22〕，所以本研究采用TU作為陽性藥物對(duì)照。PSO是一種天然植物油脂，成為我國的新資源食用油品種之一，其具有良好的抗氧化作用〔23〕，且具有較高的食用安全性〔12〕。在OP方面尚未見報(bào)道。

本研究ORX組骨量明顯比Sham組少，給予TU后，骨量增多。這是因?yàn)椴G酮由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強(qiáng)度、提升體能等作用，老年男性適當(dāng)補(bǔ)充睪酮有利于維持骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度〔22〕。隨著研究的深入，對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的觀察已成為判斷骨質(zhì)量的常用指標(biāo)〔24〕。SMI反映骨小梁板狀和桿狀的程度，板狀骨小梁和桿狀骨小梁的SMI依次為0和3。出現(xiàn)OP時(shí)，骨小梁從板狀轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀，SMI值增加。在服用睪酮或者PSO的小鼠，骨小梁丟失減少，阻止去睪丸后骨骼的骨小梁網(wǎng)絡(luò)之間連接數(shù)量的減少，骨體積分?jǐn)?shù)增加，這說明這兩個(gè)藥物可以減少這種骨的丟失，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到對(duì)照組的水平。PSO與睪酮的作用一樣，可以骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度明顯增加，并降低了骨小梁分離度，明顯對(duì)抗去睪丸導(dǎo)致的骨量丟失的作用，但與對(duì)照組比較，這種拮抗作用，還是不能達(dá)到對(duì)照組的水平。延長(zhǎng)給藥周期會(huì)是否會(huì)更好的效果，這有待進(jìn)一步的研究。

骨量增加并不一定表示骨的性能提高，需要進(jìn)一步進(jìn)行骨生物力學(xué)評(píng)價(jià)。骨生物力學(xué)特性測(cè)試以實(shí)現(xiàn)模擬真實(shí)受力情況并對(duì)骨骼進(jìn)行力學(xué)特性評(píng)估。斷裂載荷是指骨質(zhì)在發(fā)生骨折前的塑性應(yīng)變量，反映骨材料的可塑性，最大載荷反映了骨所能承受的最大外力，彈性載荷反映了骨在彈性范圍所能承受的最大變形長(zhǎng)度，剛性系數(shù)反映了骨標(biāo)本外在的硬度，PSO明顯增加了骨的最大載荷、彈性載荷和剛性系數(shù)這三種力學(xué)性能，說明了PSO具有明顯的強(qiáng)骨功能，其中，應(yīng)用PSO治療的小鼠骨的彈性載荷比應(yīng)用睪酮治療的小鼠更強(qiáng)，骨組織抗變形能力上升，提示了PSO可以替代睪酮用于預(yù)防由于雄激素減少導(dǎo)致的骨力學(xué)性能下降。

激素的缺乏易引起機(jī)體出現(xiàn)相關(guān)衰老疾病，特別是氧化應(yīng)激方面〔25〕。本研究結(jié)果顯示，SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷，MDA引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物。SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。結(jié)果表明PSO對(duì)機(jī)體具有抗氧化作用〔17〕。另外，血清中相關(guān)炎癥因子IL-6、hs-CRP含量下降，進(jìn)一步說明PSO可能通過抗氧化對(duì)OP起到抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，PSO能改善去睪丸雄性小鼠的骨微觀結(jié)構(gòu)破壞，并增強(qiáng)骨生物力學(xué)性能。由相關(guān)炎癥因子檢測(cè)結(jié)果表明，PSO可以對(duì)抗機(jī)體的氧化作用。OP是常見的老年性疾病，由OP引起的老年性骨折越來越多，而且其術(shù)后恢復(fù)較差。在日常生活中，OP時(shí)常不伴隨相關(guān)疼痛癥狀而且治療OP的藥物價(jià)格相對(duì)昂貴，并未引起人們的關(guān)注。PSO因具有較高的食用安全性，目前已經(jīng)成為公認(rèn)的功能性食品之一，其對(duì)于骨組織的影響尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究成果為PSO在OP藥物進(jìn)一步的開發(fā)以及運(yùn)用方面提供了理論依據(jù)。