HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病大鼠的干預(yù)及降血脂作用

杜蕊 李娜 趙彩杰 紀(jì)征 (河北唐山工人醫(yī)院心內(nèi)一科，河北 唐山 063000)

冠心病簡稱為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是一種缺血性心臟病〔1〕。導(dǎo)致冠心病的危險原因有很多除了遺傳因素和年齡等不可控制的因素外，還包括超重、糖尿病、吸煙、肥胖、血脂異常、高血壓等可控的因素，對這些因素進(jìn)行積極防控有助于防治冠心病〔2,3〕。冠心病多發(fā)生在40歲以上成人，并且女性發(fā)病晚于男性，近年來呈年輕化趨勢〔4〕。冠心病早期可無任何癥狀，僅表現(xiàn)為劇烈體育活動或者重體力勞動后，出現(xiàn)心絞痛癥狀，服用擴(kuò)張冠狀動脈藥物或休息后可迅速緩解〔5〕。冠心病典型癥狀為心絞痛、呼吸短促、胸部壓迫等，發(fā)生急性冠脈綜合征時，除了典型的心絞痛之外可能還會伴有突然出現(xiàn)頭暈、惡心、冷汗或消化不良的感覺、活動時頸部疼痛，呼吸短促感覺加劇〔6,7〕。本研究探討羥甲基戊二酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病模型大鼠的干預(yù)效果及降血脂作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取44只清洗級SD健康雄性大鼠(成都達(dá)碩生物科技有限公司)，體重180～230 g，平均(204.2±21.3)g，根據(jù)體重隨機分為分正常組、模型組、阿托伐他汀組、聯(lián)合治療組各11只。在環(huán)境溫度(22±2)℃、濕度(52±2)%條件下進(jìn)行喂養(yǎng)，將飲用水及食物消毒后，自然采光，自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實驗。主要試劑及使用藥物：維生素D注射劑(上海通用藥業(yè)股份有限公司)；垂體后葉素注射液；兔抗大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)抗體(Hyclone公司)。

1.2建模及給藥 建模：選取11只大鼠，不進(jìn)行任何處理作為正常組。其余33只進(jìn)行冠心病模型建立。對大鼠麻醉后將氣管切開插管，采用動物呼吸機進(jìn)行輔助呼吸，褪去大鼠胸部毛，消毒處理后，沿左鎖骨中線切開大鼠胸腔，剪開心包，輕微按壓右側(cè)胸部擠出心臟。對左冠狀動脈前降支中上部位采取結(jié)扎處理，后將心臟復(fù)位關(guān)胸，于大鼠蘇醒后縫合拔管，Ⅱ?qū)碾妶D檢測，當(dāng)ST段下移或者T波改變現(xiàn)象視為建模成功。建模過程中死亡1只，最終建模成功32只，分為模型組10只，阿托伐他汀組11只，聯(lián)合治療組11只。

給藥：阿托伐他汀組、聯(lián)合治療組建模成功后第1天分別給予0.10 mg/ml阿托伐他汀溶液、10 mol/L HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合0.10 mg/ml阿托伐他汀溶液。

1.3標(biāo)本采集 在實驗各組分別治療的第1周后，對所有大鼠禁食不禁水，使用乙醚吸入麻醉，進(jìn)行背部固定，描記Ⅱ?qū)碾妶D，抽取腹部靜脈血10 ml對血脂、心肌酶等指標(biāo)進(jìn)行檢測后，剖開胸腔，戊二醛固定，剝離心臟及置于載玻片上的心尖組織。將一部分心肌組織置于戊二醛、磷酸緩沖液配制液中進(jìn)行固定，另一部分置于液氮中保存待用。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠心肌組織固定24 h后，將大鼠心肌組織從戊二醛、磷酸緩沖液配制液中取出并且進(jìn)行脫水處理，處理后進(jìn)行石蠟包埋、切片、染色。染色后在顯微鏡下觀察。

1.5脂聯(lián)素(APN)表達(dá)量檢測 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測APN表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設(shè)計引物，采用2-ΔΔCt方法計算，內(nèi)參U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 10 min，40℃ 60 min，85℃ 5 min；設(shè)置擴(kuò)增條件：94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s，35個循環(huán)，采用2-ΔΔCt方法計算出需要檢測的APN表達(dá)量。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測肌酸激酶(CK)、AST、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平 取主動脈血5 ml，使用3 000 r/min離心機進(jìn)行離心處理15 min，制備血清。使用ELISA法對CK、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α水平檢測：將血清置于室溫，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋血清和標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；然后用專用的洗滌液將反應(yīng)板清洗3次以后，再加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔終止反應(yīng)，在450 nm波長測定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與CK、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算CK、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α水平。

1.7血流動力學(xué)檢測 使用全自動生化分析儀對血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)進(jìn)行檢測：使用全自動生化分析儀時應(yīng)嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行，避免出現(xiàn)誤差。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1病理圖 正常組心肌細(xì)胞形態(tài)及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見有炎癥細(xì)胞侵入；模型組心肌橫紋、肌束斷裂消失，細(xì)胞膜不完整，炎癥細(xì)胞滲出，大量結(jié)締組織增生；阿托伐他汀組心肌橫紋、肌束少量斷裂消失，炎癥細(xì)胞較少滲出，少量結(jié)締組織增生；聯(lián)合治療組心肌細(xì)胞形態(tài)及間質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于正常，但有少量炎癥細(xì)胞侵入。見圖1。

圖1 各組心肌病理(HE染色,×400)

2.2各組心臟APN、TNF-α、CK及AST表達(dá)量對比 與正常組相比，模型組APN表達(dá)量明顯下降、TNF-α表達(dá)量明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組APN表達(dá)量明顯上升，TNF-α表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組APN表達(dá)量明顯上升，TNF-α表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。與正常組比較，模型組CK、AST水平明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組CK、AST水平明顯下降(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組大鼠CK、AST水平明顯下降(P<0.05)。見表1、表2。

2.3各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯上升，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯下降，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯上升(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯下降，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯上升(P<0.05)。見表1。

表1 各組APN、TNF-α、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)比較

2.4各組血脂指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組TC、TG、LDL-C明顯上升、HDL-C明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-C明顯上升(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-C明顯上升(P<0.05)。見表2。

表2 各組CK、AST及TC、TG、LDL-C、HDL-C比較

3 討 論

冠心病臨床表現(xiàn)主要為出現(xiàn)不同程度的心絞痛，對患者生活及身體健康造成嚴(yán)重影響〔8，9〕。中老年人為冠心病主要發(fā)病人群，近年來受社會發(fā)展、飲食習(xí)慣改變、生活方式等影響，心血管疾病發(fā)病率不斷上升，且部分疾病發(fā)病年齡呈年輕化趨勢〔10〕。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，高血壓、血脂水平異常等均屬于常見冠心病誘因。HMG-CoA還原酶在臨床可以有效治療心血管疾病，也是膽固醇合成酶系中的關(guān)鍵，他汀類藥物通過對他的抑制作用從而使肝臟合成膽固醇受到抑制。阿托伐他汀屬于Ⅱ型他汀類藥物，與Ⅰ型他汀類藥物相比具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)〔11,12〕。

由免疫細(xì)胞合成分泌的內(nèi)源性多肽屬于炎癥因子，可以介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，具有強大生物學(xué)效應(yīng)。目前研究認(rèn)為冠狀動脈硬化的發(fā)生與發(fā)展與炎癥反應(yīng)具有重要作用〔13〕。TNF-α作為一種多種生物學(xué)效應(yīng)的初級炎癥因子，參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。冠狀動脈粥樣硬化與TNF-α之間形成密切相關(guān)〔14〕。APN是大鼠脂肪組織中發(fā)現(xiàn)一種膠原樣細(xì)胞因子。心肌細(xì)胞不僅分泌APN,而且存在APN特異性集合受體，是一種新保護(hù)性抗炎細(xì)胞因子，對動脈粥樣硬化具有抑制作用。通過多種途徑對心血管保護(hù)作用，維護(hù)心血管正常生理功能〔15〕。本研究結(jié)果說明APN、TNF-α與冠心病有著密切關(guān)系。

臨床上通過對CK、AST活性變化監(jiān)測對心肌損傷程度進(jìn)行評估。CK、AST等酶在心肌組織細(xì)胞中廣泛存在，對維持心肌正常生理功能發(fā)揮重要作用。正常情況下，血清CK、AS活性較低，當(dāng)心肌缺血造成代謝紊亂，造成心肌細(xì)胞內(nèi)多種酶釋放進(jìn)入外周血，加重缺血對心肌損傷〔16,17〕。本研究結(jié)果HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，血清CK、AST水平降低，提示有效降低血清CK、AST活力，減輕心肌缺血損傷程度。

冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，而冠心病損傷反應(yīng)學(xué)中脂質(zhì)是必備條件。血清TC、TG、LDL-C升高、HDL-C降低，對動脈內(nèi)皮均可造成損傷，高通透性，加速脂質(zhì)在動脈內(nèi)皮下的沉積，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的形成，進(jìn)而促進(jìn)冠心病形成〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)，血清CK長期增高，使冠心病發(fā)生概率增加，LDL-C水平越高，患有冠狀動脈粥樣硬化風(fēng)險越大〔19〕。本研究結(jié)果顯示，通過HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，對脂類代謝具有明顯調(diào)控作用。

血流流變學(xué)對判斷疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的重要指標(biāo)〔20〕。血液流動減慢說明全血黏度增高，紅細(xì)胞變形能力及減低。受血流變慢影響，紅細(xì)胞聚集增多，導(dǎo)致外周血循環(huán)受阻，心臟缺血，無法得到足夠供養(yǎng)，血液濃縮，加重疾病的發(fā)展。對血液流變改善，降低血液黏度可有效緩解脂質(zhì)沉積、紅細(xì)胞堆積現(xiàn)象，減輕冠心病臨床癥狀〔21〕。本研究結(jié)果顯示，通過HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，對改善冠心病大鼠血液流變學(xué)效果顯著。

綜上，使用HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，有效抑制炎癥因子、減輕心肌損傷、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝降血脂、改善血液流變學(xué)、對冠心病大鼠有著一定的治療效果。