堿性藥物反相高效液相色譜分析的挑戰(zhàn)以及改進(jìn)方法

曹娜,蔣壽劍,李洋*

(1.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,江蘇 南京 210046;2.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司 南京研究院,江蘇 南京 210046))

據(jù)統(tǒng)計(jì),超過(guò)70%的藥物含有堿性官能團(tuán),在生命科學(xué)以及醫(yī)藥領(lǐng)域中,堿性化合物的作用舉足輕重[1-2]。在反相液相色譜分析中,堿性化合物的分析是一個(gè)難題,大家可能經(jīng)常會(huì)碰到類(lèi)似峰形拖尾、峰寬、峰高較矮、檢測(cè)靈敏度較差,而增加進(jìn)樣量會(huì)導(dǎo)致色譜峰拖尾加劇,柱的效果迅速降低,相鄰的成分更容易被拖尾峰包裹等等。另外,在傳統(tǒng)硅膠柱上分離堿性化合物會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重死吸附,這些問(wèn)題給分離分析和純化制備堿性化合物帶來(lái)了諸多困難[3-4]。另外,強(qiáng)極性堿性化合物(胞嘧啶、吡啶)在普通反相材料上保留時(shí)間較短,甚至在死時(shí)間出峰,很難將目標(biāo)分析物與干擾物質(zhì)分離。對(duì)于強(qiáng)極性堿性化合物無(wú)保留情況,通常會(huì)選擇HILIC色譜柱。親水作用色譜(HILIC)是基于樣品中化合物與親水性固定相之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離,是一種補(bǔ)充反相作用色譜的方法,可以有效地分離強(qiáng)極性化合物[5-6]。與反相色譜相比,HILIC在分離極性化合物方面具有更好的選擇性和靈敏度,可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)極性化合物的分離。需要注意的是在HILIC模式中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)重現(xiàn)性和峰形問(wèn)題。重現(xiàn)性問(wèn)題主要是由于色譜柱沒(méi)有達(dá)到足夠的平衡時(shí)間,特別對(duì)于梯度方法;峰形問(wèn)題往往和分析物本身的特點(diǎn)有關(guān)以及不合適的樣品稀釋劑所導(dǎo)致[7]。雖然HILIC對(duì)大極性化合物有好的保留和分離效果,但是很多強(qiáng)極性堿性化合物無(wú)法溶解在高比例的有機(jī)相中,這在很大程度上地限制了HILIC的使用。借鑒分離分析和純化制備多種堿性化合物的經(jīng)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn),主要從流動(dòng)相和固定相兩個(gè)方面改進(jìn)堿性化合物拖尾問(wèn)題,并提出了一些改進(jìn)措施。

1 流動(dòng)相方面

由于硅膠鍵合相容易溶解在堿性介質(zhì)中,因此,大多數(shù)反相高效液相色譜法采用酸性或中性流動(dòng)相條件。堿性化合物在酸性或者在中性流動(dòng)相環(huán)境下,由于解離平衡的關(guān)系,便會(huì)以離子形式存在,帶正電荷。堿性化合物解離越容易,其峰拖尾越嚴(yán)重,主要是由游離的硅羥基與解離后的堿性化合作用生成的二級(jí)效應(yīng)所致。改進(jìn)措施如下:

1.1 改變流動(dòng)相pH值

減少硅醇基與堿性化合物的離子交換作用的方法是選擇低或較高pH值的流動(dòng)[8]。較低的pH值可以降低硅醇基的電離程度,從而減少與堿性化合物之間的離子交換反應(yīng);較高pH值的流動(dòng)相可以抑制堿性化合物的電離程度,從而降低與硅醇基之間的離子交換反應(yīng)。選擇合適的流動(dòng)相需要考慮樣品性質(zhì)和分析目的。如果樣品中含有大量的硅醇基化合物,則選擇低pH值的流動(dòng)相可能更適合。相反,如果樣品中含有大量的堿性化合物,則選擇較高pH值的流動(dòng)相可能更適合。對(duì)堿性化合物來(lái)說(shuō),流動(dòng)相的pH值不僅僅對(duì)峰形,還對(duì)保留因子和選擇性都有很大影響,一般我們建議堿性化合物的流動(dòng)相pH值≤2.5,會(huì)有比較好的峰形。

鹽酸安羅替尼項(xiàng)目中羥胺雜質(zhì)檢測(cè)采用ODS色譜柱,乙腈-磷酸鹽體系(pH值2.9),效果較好。阿托品是一種具有叔胺結(jié)構(gòu)的化合物,它呈堿性。在ODS色譜柱上,阿托品的保留時(shí)間很短。研究人員張國(guó)柱等人[9]在實(shí)驗(yàn)中使用磷酸將三乙胺溶液的pH值調(diào)至7.5,通過(guò)改變阿托品的狀態(tài),增加其在色譜柱上的保留,從而提高阿托品的分離效果。一般當(dāng)流動(dòng)相的pH值高于或低于被分析物的pKa值兩個(gè)pH值單位時(shí),可以改善峰形的尖銳度,可以使得化合物以99%的比例存在于一種形式下。

1.2 加入“掃尾劑”

可以使用添加劑來(lái)調(diào)整流動(dòng)相的酸堿性。例如,可以在酸性條件下加入三乙胺或二乙胺等一些掃尾劑,然后再用酸來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相。在酸性條件下,三乙胺陽(yáng)離子與游離于鍵合相中的硅羥基結(jié)合,使得堿性化合物與硅醇基之間的相互作用被阻斷,從而改善了峰形。然而,當(dāng)面對(duì)比三乙胺更強(qiáng)堿性的化合物時(shí),三乙胺的效果就不那么明顯了。需要注意的是三乙胺的堿性很強(qiáng),當(dāng)加入三乙胺作為掃尾劑改善峰形的時(shí)候,加入三乙胺后的流動(dòng)相pH值可能超出色譜柱pH值的耐受范圍,對(duì)色譜柱造成一定損傷,建議流動(dòng)相中加入三乙胺后再回調(diào)至未加入前的pH值。另外,還需要注意三乙胺在210 nm處有一定得吸收,如果液相分析方法中檢測(cè)波長(zhǎng)在210 nm以下檢測(cè)時(shí)需要謹(jǐn)慎使用。

N-(3-氟-4-((7-((1-羥基環(huán)丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-苯基)-N-(4-氟苯基)環(huán)丙烷-1,1-二甲酰胺,使用ODS色譜柱(如Phenomenex Luna C18,4.6 mm×250 mm,5 μm或類(lèi)似效能的色譜柱),流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液(將1.36 g的磷酸二氫鉀溶解在1 000 mL的水中,然后加入5 mL的三乙胺,再用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.7)條件檢測(cè),效果都較之前不含有三乙胺的流動(dòng)相體系好很多。

1.3 添加離子對(duì)試劑

在化學(xué)實(shí)驗(yàn)中,我們通常使用堿性離子對(duì)試劑。其中比較常見(jiàn)的有高氯酸鹽和烷基磺酸鹽。烷基磺酸鹽包括庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉等。這些試劑在實(shí)驗(yàn)中起到調(diào)節(jié)酸堿度的作用。在酸性環(huán)境中,堿性化合物中的陽(yáng)離子會(huì)與烷基磺酸根陰離子結(jié)合,形成中性的離子對(duì),使堿性化合物變成中性化合物,并增強(qiáng)疏水性,改善堿性化合物保留性和峰形。

腺苷蛋氨酸有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)中采用ODS色譜柱,以甲酸銨溶液(取甲酸銨0.63 g,庚烷磺酸鈉1.4 g,用甲酸調(diào)節(jié)pH值至2.8,加水稀釋至1 000 mL,搖勻)-甲醇(體積比80∶20)為流動(dòng)相;在鹽酸二甲雙胍的檢測(cè)中采用ZORBAX SB-AQ柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),水-乙腈(體積比73∶27)(內(nèi)含10 mmol/L磷酸二氫鈉和5 mmol/L十二烷基磺酸鈉)為流動(dòng)相,增強(qiáng)了ODS柱上目標(biāo)物質(zhì)的保留力,峰形也得到了改善;研究人員史鵬杰等人[10]在流動(dòng)相中加入烷基磺酸鈉類(lèi)離子對(duì)試劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)檳榔中的生物堿分離效果得到明顯改善。

1.4 加入緩沖鹽

使用緩沖鹽的目的主要有兩點(diǎn),其一是使流動(dòng)相維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的pH值條件;其二是使流動(dòng)相具有足夠的離子強(qiáng)度。因此選擇緩沖鹽的類(lèi)型和濃度就非常重要。游離硅羥基被高濃度緩沖鹽中金屬離子“包裹”,并呈正電狀態(tài),使得堿性化合物與固定相的二級(jí)反應(yīng)受阻,從而減小了拖尾和改善了峰形。緩沖鹽的弱酸根(陰離子)作用是維持流動(dòng)相體系在一個(gè)穩(wěn)定的pH值環(huán)境,提高方法重現(xiàn)性。一般建議緩沖鹽濃度比樣品濃度高10倍以上,20～50 mmol/L使流動(dòng)相維持穩(wěn)定體系。

通常含有叔胺基團(tuán)系列化合物采用ODS色譜柱,以乙腈-0.1%甲酸體系為流動(dòng)相,檢測(cè)結(jié)果峰型差,拖尾明顯,流動(dòng)相由乙腈-0.1%甲酸體系改為乙腈-10 mmol/L磷酸氫二銨/50 mmol/L磷酸二氫銨水溶液,峰型改善明顯。

2 固定相方面

C18色譜柱是將十八烷基鏈鍵合在硅膠上而得到的,是反相液相色譜分析方法中應(yīng)用最廣泛的色譜柱[11-13]。但是由于十八烷基碳鏈非常長(zhǎng),所以在鍵合的時(shí)候空間位阻非常大,造成鍵合率不高,這樣會(huì)有很多硅羥基沒(méi)有被鍵合而殘留下來(lái)。在某些反相液相色譜中,當(dāng)殘留的硅羥基被解離時(shí),會(huì)具有陽(yáng)離子交換活性。這種活性通常在分離堿性化合物時(shí)會(huì)導(dǎo)致峰形拖尾并且柱效下降。針對(duì)些問(wèn)題,我們可以考慮以下解決辦法。

2.1 改善ODS鍵合相的封尾技術(shù)

針對(duì)解決堿性化合物拖尾的問(wèn)題,研究人員近年來(lái)致力于改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)組成。為了進(jìn)一步降低游離硅羥基的活性,各色譜柱廠家發(fā)展了一些更為先進(jìn)的制造技術(shù),通過(guò)適當(dāng)?shù)姆馕?、極性基團(tuán)修飾以及進(jìn)一步屏蔽活性硅醇基團(tuán),可以得到理想的峰形。如Agilent公司利用雙封尾技術(shù)開(kāi)發(fā)了ZorbaxExtend C18色譜柱,該色譜柱能夠在堿性條件下有效地屏蔽硅醇基團(tuán)。

分析堿性化合物常用色譜柱有Waters Symmetry Shield RP18、Waters ACQUITY UPLC CSH C18,其中Waters Symmetry Shield RP18是采用內(nèi)嵌極性官能團(tuán)的方式,作用機(jī)理是極性基團(tuán)是親水性的,很容易抓取流動(dòng)相中的水在其表層,從而阻止堿性化合物與硅膠表面殘留硅醇基間的作用,能夠獲得較好的峰形,但pH值2～8耐受范圍有限;Waters ACQUITY UPLC CSH C18是一種帶電雜化色譜柱,通過(guò)利用色譜柱表面的正電荷與堿性化合物溶質(zhì)之間的靜電排斥作用,使堿性化合物不能靠近硅醇基,從而使色譜峰的形態(tài)得到改善。

2.2 使用混合模式固定相

混合模式色譜是一種分離技術(shù),它在一根色譜柱上同時(shí)利用兩種或多種分離機(jī)理來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。這項(xiàng)技術(shù)可以根據(jù)不同樣品的特性來(lái)進(jìn)行分離,從而提高分離的選擇性,多種保留機(jī)理的存在將十分有利于強(qiáng)極性堿性化合物的分離工作[14-19]。有文獻(xiàn)指出付紅靖等人[20]開(kāi)發(fā)了一種具有親水性和強(qiáng)陽(yáng)離子交換功能的毛細(xì)管柱,并研究了這一柱體的保留機(jī)制,成功地分離出兩性化合物肽和微小結(jié)構(gòu)差異的吡啶化合物。Nicola H等[21]制備了在分離高極性堿性化合物樣品時(shí)具有良好的保留性和選擇性,且不會(huì)出現(xiàn)峰形拖尾和過(guò)載現(xiàn)象的反相/陽(yáng)離子交換混合色譜柱;劉會(huì)娟等[22]制備表面帶正電荷的反相/陰離子交換混合色譜柱,同時(shí)考察了該色譜柱對(duì)堿性化合物的分離情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種小分子堿性化合物(二羥丙茶堿、茶堿、3-硝基苯胺、2-硝基苯胺)以及結(jié)構(gòu)中含有強(qiáng)堿性季銨鹽的鹽酸阿米替林都具有良好的峰形,無(wú)拖尾現(xiàn)象,說(shuō)明反相/陰離子交換混合色譜柱中的季銨基團(tuán)對(duì)C18殘留的硅羥基有屏蔽作用;王曉歡[23]通過(guò)在硅膠表面鍵合巰基,進(jìn)一步對(duì)表面用苯磺酸及苯基進(jìn)行改性,制備了一種結(jié)合了反相、親水和陽(yáng)離子交換三種混合模式的固定相,該混合柱同時(shí)具有反相疏水、HILIC親水和離子交換作用,能夠成功用于酸性、中性和堿性化合物的分離。目前商業(yè)化的混合模式色譜柱如C18/Cation,C8/Cation,C18-Amino,C8-Amino等在市場(chǎng)上已有銷(xiāo)售。

3 總結(jié)

本文首先對(duì)堿性化合物拖尾的根源進(jìn)行分析,再分別從固相和流動(dòng)相兩個(gè)方面進(jìn)行探討解決方案。但在實(shí)際工作中,對(duì)某一堿性藥物進(jìn)行分析檢測(cè)時(shí),還需要考慮檢測(cè)目的以及待分析物的極性、溶解性、酸堿性、穩(wěn)定性,是否含有異構(gòu)體等因素,綜合這些因素確定選擇合適的分離方式、固定相、有機(jī)相、水相、檢測(cè)溫度、流速等檢測(cè)條件。

隨著色譜填料種類(lèi)的豐富,特別是混合作用模式填料的出現(xiàn),分離堿化物的固定相選擇性更大。但是從操作使用的通用性和耐用性上,選擇一種經(jīng)過(guò)特殊修飾的ODS色譜柱,結(jié)合變換流動(dòng)相組成,仍是改善堿性化合物分析檢測(cè)的主流選擇,特別是對(duì)水溶性樣品的分析檢測(cè)。