淹水脅迫對開花期小麥生理生化特征的影響

申長衛(wèi),吳婷婷,陳新茹,宋艷艷,周值樂,歐行奇

（1.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

小麥在世界上分布很廣泛,從北極圈附近直至南美洲大陸的南部之間的廣大地區(qū)都有種植.我國是世界上最大小麥生產(chǎn)國,全國各地都種植小麥,其中尤以河南、山東兩省種植最多.小麥在生長過程中往往受到各種自然災(zāi)害的影響,其中澇害是全球許多國家所面臨的重大自然災(zāi)害之一.據(jù)統(tǒng)計,世界范圍內(nèi)受澇漬災(zāi)害影響的耕地面積大約占耕地總面積的12%[1].在中國,澇漬地主要集中在長江中下游地區(qū)及黃淮海平原地區(qū),占全國總澇漬地的75%以上[2].

國外研究者更多關(guān)注在小麥苗期和灌漿期植物的根系和地上部分對澇災(zāi)的響應(yīng)[3-4],研究者們認(rèn)為植物為適應(yīng)淹水環(huán)境,形成了在解剖學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上一套新機(jī)制[5],包括通氣組織的產(chǎn)生、不定根的形成、葉柄速度伸長、莖肥大、下胚層生長、增加株高、氣孔關(guān)閉、蒸騰減少和抑制光合作用等[6-8]，國內(nèi)學(xué)者認(rèn)為小麥生育期無論受淹水時間長短,均會使粒質(zhì)量和產(chǎn)量下降[9].拔節(jié)期-灌漿期是小麥生長發(fā)育的重要時期,也是小麥對澇害的敏感時期,此時易導(dǎo)致根系發(fā)育不良,活力衰退,葉片光合受阻,影響成熟期干物質(zhì)積累,從而降低穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量,導(dǎo)致產(chǎn)量降低[10-11].近些年研究淹水脅迫對植物的影響,了解植物的抗?jié)承?選育耐淹能力強(qiáng)的品種用于黃淮海平原及其他澇漬災(zāi)害頻發(fā)地區(qū)成為首要任務(wù),這對當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的健康安全可持續(xù)發(fā)展具有重要意義.

至今,國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于澇害對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的影響已有較多研究,但不同生育期淹水對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)影響的研究結(jié)果不同,且研究多集中在苗期和抽穗期,有關(guān)花期澇害脅迫對小麥生長發(fā)育及不同耐澇資源比較的報道較少.因此本研究以耐淹性不同的兩種小麥品種周麥22（ZM22,不耐淹型）和百農(nóng)607（BN607,耐淹型）為試材,通過盆栽試驗,在小麥開花期設(shè)置3 d的淹水處理和不淹水處理,研究淹水處理后1 d、3 d和7 d對兩種基因型小麥老葉和旗葉葉綠素含量的影響,同時重點分析處理后對兩種小麥各部位（根系、老葉、旗葉、籽粒）中糖分含量及乙醇脫氫酶（ADH）活性的影響.本研究旨在為小麥耐澇選育提供參考依據(jù),并進(jìn)一步完善澇害對小麥生長發(fā)育的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年4月至6月在河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院試驗地進(jìn)行,本試驗選取兩種耐淹性不同的小麥品種周麥22（ZM22,不耐淹型）和百農(nóng)607（BN607,耐淹型）為試驗材料,在小麥拔節(jié)期選取大小、長勢基本一致的麥苗移栽到溫室盆中,每盆留小麥苗5株.試驗土壤選取河南科技學(xué)院東區(qū)試驗基地0-20 cm土壤-砂質(zhì)中壤土,其土壤理化性質(zhì):堿解含氮量為43.75 mg/kg,含速效磷量為10.85 mg/kg,含速效鉀量為115 mg/kg,含有機(jī)質(zhì)量為1.64%,pH值為7.46.土壤經(jīng)過2 mm篩后混勻,試驗盆缽選用聚乙烯塑料桶,桶底中央須設(shè)有排水孔,淹水處理時另外再套一個無排水孔的塑料桶,每盆裝土質(zhì)量為3 kg.

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置兩個處理:從小麥?zhǔn)⒒ㄆ陂_始進(jìn)行3 d的淹水處理（W）,同時以不淹水處理（CK）作為對照.淹水處理時向花盆中注水,水面超過土壤表面至少5 cm,每隔4 h補(bǔ)水到統(tǒng)一刻度,模擬淹水處理3 d.每個處理都設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).分別采集淹水處理和不淹水處理3 d后1 d、3 d和7 d時（從小麥?zhǔn)⒒ㄆ诘焦酀{初期）小麥的根系、老葉、旗葉和籽粒樣品,其中小麥?zhǔn)⒒ㄆ谝殉霈F(xiàn)發(fā)育的籽粒.采集一部分鮮樣放于4℃冰箱中用于測定老葉和旗葉的葉綠素含量,另外采集小麥各部位（根系、老葉、旗葉和籽粒）新鮮樣品用于糖分含量和乙醇脫氫酶（ADH）活性的測定.

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和總?cè)~綠素（Chl a+b）含量的測定

（1）取小麥老葉和旗葉新鮮葉片,擦凈葉片表面污物,去除大葉脈,剪碎組織;

（2）每個處理稱取3份已經(jīng)剪碎的新鮮樣品各0.100 g,分別置于試管中.每個試管加入5 mL 95%乙醇,使樣品完全浸泡在乙醇溶液中.置于暗處浸泡24 h;

（3）24 h后將葉綠素色素提取液加入酶標(biāo)板中,以95%的乙醇為對照調(diào)零,在波長665 nm和649 nm下測定吸光度;

（4）分別計算葉綠素a和b的質(zhì)量濃度（mg/L）,a+b即得葉綠素總質(zhì)量濃度.

公式如下

式（1）和（2）中:Ca、Cb分別為葉綠素a和b的質(zhì)量濃度.葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665 nm和649 nm,A665和A649分別表示葉綠素a和葉綠素b的吸光度.

（5）求得色素的質(zhì)量濃度后,再計算組織中各色素的含量

含葉綠體色素量/%=（色素濃度×提取液體積）/樣品鮮質(zhì)量×100.

1.3.2 可溶性糖的測定

（1）從每個處理中取0.100 0 g組織鮮樣（根系、老葉、旗葉和籽粒）,加1 mL的蒸餾水研磨,粗提液全部轉(zhuǎn)移到EP管中,12 000 r/min,常溫離心10 min,上清液待測.

（2）樣品制備好后,采用酶標(biāo)儀,調(diào)節(jié)波長到340 nm,測定不同混合反應(yīng)下樣品的吸光值.

（3）結(jié)果計算

式（3）、（4）、（5）中:?A蔗糖=（A2-A1）測定管M-（A2-A1）對照管M;?A葡萄糖=（A2-A1）測定管N-（A2-A1）對照管N;?A果糖=（A3-A2）測定管N-（A3-A2）對照管N;D,稀釋倍數(shù);W,樣本質(zhì)量.

1.3.3 乙醇脫氫酶酶活性的測定

（1）分別稱取小麥根、老葉、旗葉和籽粒約0.100 0 g,加入1 mL提取液,提取時盡量在冰上進(jìn)行.4℃離心20 min,上清液待測.

（2）樣品制備好后,采用酶標(biāo)儀,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零,分別測定空白管和測定管中樣品的吸光值.

（3）空白管:在96孔板（UV板）中依次加入20μL蒸餾水、160μL試劑一和20μL試劑三,迅速混勻后于340 nm測定吸光值變化,分別記錄15 s和75 s時吸光值,分別記為A1和A2,?A空白管＝A1-A2.

（4）測定管:在96孔板（UV板）中依次加入20 mL上清液、160μL試劑一和20μL試劑三,迅速混勻后于340 nm測定吸光值變化,分別記錄15 s和75 s時吸光值,分別記為A3和A4、?A測定管＝A3-A4．

（5）使用96孔板按樣本質(zhì)量計算:

活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘氧化lμmol NADH為1個酶活單位.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理;采用SPSS18.0進(jìn)行方差分析并通過單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析,以不同小寫字母表示達(dá)到P＜0.05顯著差異水平;采用Duncan's multiple range test法進(jìn)行顯著性檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種基因型小麥葉片中葉綠素含量對淹水脅迫響應(yīng)的差異

淹水脅迫對兩種基因型小麥葉片中葉綠素含量的影響如圖1所示.

圖1 淹水脅迫對小麥葉片中葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of waterlogging stress on chlorophyll content in wheat leaves

由圖1可以看出,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22老葉中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量都顯著低于對照處理,而BN607老葉中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量都顯著高于對照處理（圖1-A、圖1-C和圖1-E）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22和BN607旗葉中葉綠素a含量相比對照處理都顯著降低,其中7 d時ZM22和BN607旗葉中含葉綠素a量相比對照處理分別顯著降低27.59%和15.00%（圖1-B）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607旗葉中含葉綠素b量相比對照處理都顯著降低,分別下降105.30%、43.74%和100.37%,而淹水處理后3 d和7 d時,ZM22旗葉中葉綠素b含量與對照處理差異不顯著（圖1-D）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607旗葉中葉含綠素a+b量相比對照處理都顯著降低,分別顯著下降37.75%、22.22%和36.10%.淹水處理后1 d和7 d時,ZM22旗葉中含葉綠素a+b量相比對照處理都顯著降低,分別下降11.54%和41.73%（圖1-F）.

2.2 兩種基因型小麥各部位糖分含量對淹水脅迫響應(yīng)的差異

2.2.1 淹水脅迫對小麥根系中糖分含量的影響

淹水脅迫對兩種基因型小麥根系中糖分含量的影響如圖2所示.

圖2 淹水脅迫對小麥根系中糖分含量的影響Fig.2 Effects of waterlogging stress on sugar content in wheat roots

由圖2可以看出,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607根系中含蔗糖量相比對照處理分別顯著提高72.00%、27.00%和22.00%.淹水處理后1 d和3 d時ZM22根系中含蔗糖量相比對照處理分別顯著提高12.00%和16.00%.淹水處理后ZM22和BN607根系中含葡萄糖量都顯著低于對照處理.淹水處理后7 d時,ZM227和BN607根系中葡萄糖含量相比對照處理分別顯著降低63.84%和14.89%.淹水處理后1 d和3 d時,ZM22和BN607根系中果糖含量相比對照處理都顯著降低.整體來看,淹水處理后1 d、3 d和7 d,ZM22根系中總糖含量都顯著低于對照處理,而除了淹水處理3 d外,其他兩個時期時BN607根系中總含量糖都顯著高于對照處理.

2.2.2 淹水脅迫對小麥老葉中糖分含量的影響

淹水脅迫對兩種基因型小麥老葉中糖分含量的影響如圖3所示.

圖3 淹水脅迫對小麥老葉中糖分含量的影響Fig.3 Effects of waterlogging stress on sugar content in old leaves of wheat

由圖3可以看出,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22老葉中蔗糖含量顯著高于對照處理,而除淹水處理后3 d外,其他時期BN607老葉中含蔗糖量顯著低于對照處理,分別顯著降低18.25%和10.97%（圖3-A）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607老葉中含葡萄糖量相比對照處理分別顯著降低40.64%、31.57%和41.67%,除淹水處理后1 d外,其他時期ZM22老葉中含葡萄糖量相比對照處理分別顯著降低73.44%和54.07%（圖3-B）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607老葉中含果糖量相比對照分別顯著降低38.74%、54.06%和38.76%,淹水處理后3 d和7 d時,ZM22老葉中含果糖量相比對照處理分別顯著降低70.93%和27.54%（圖3-C）.整體來看,淹水處理后BN607老葉中含總糖量顯著低于對照處理,分別顯著降低27.47%、29.27%和18.16%,而淹水處理后1 d和3 d時ZM22老葉中總糖含量與對照處理差異不顯著（圖3-D）.

2.2.3 淹水脅迫對小麥旗葉中糖分含量的影響

淹水脅迫對兩種基因型小麥旗葉中糖分含量的影響如圖4所示.

圖4 淹水脅迫對小麥旗葉中糖分含量的影響Fig.4 Effects of waterlogging stress on sugar content in flag leaves of wheat

由圖4可以看出,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22旗葉中蔗糖含量和果糖含量都顯著低于對照處理,而BN607旗葉中蔗糖含量和果糖含量卻都顯著高于對照處理（圖4-A和圖4-C）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22旗葉中含葡萄糖量相比對照處理分別降低42.19%、69.62%和40.51%,BN607旗葉中含葡萄糖量相比對照處理分別降低5.63%、43.62%和25.58%（圖4-B）.總體來看,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22旗葉中含總糖量相比對照處理分別降低17.87%、28.53%和34.91%,而BN607旗葉中含總糖量相比對照處理分別顯著增加50.59%、76.60%和31.05%（圖4-D）.

2.2.4 淹水脅迫對小麥籽粒中糖分含量的影響

淹水脅迫對兩種基因型小麥籽粒中糖分含量的影響如圖5所示.

由圖5可以看出,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22籽粒中含蔗糖量相比對照處理分別顯著提高133.22%、121.63%和45.50%,BN607籽粒中含蔗糖量相比對照處理分別提高68.80%、45.86%和22.46%（圖5-A）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607籽粒中含葡萄糖量相比對照處理分別顯著提高12.15%、9.87%和8.44%,而ZM22籽粒含葡萄糖量相比對照處理分別降低54.51%、28.57%和2.10%（圖5-B）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,BN607籽粒中果糖含量相比對照處理差異不顯著.淹水處理后3 d時,ZM22籽粒含果糖量相比對照處理顯著降低17.02%（圖5-C）.整體來看,淹水處理后ZM22和BN607籽粒中總糖含量相比對照處理都顯著提高,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22籽粒中含總糖含量相比對照處理分別顯著提高20.88%、26.11%和17.16%,BN607籽粒中含總糖量相比對照處理分別顯著提高5.43%、20.98%和17.73%（圖5-D）.

圖5 淹水脅迫對小麥籽粒中糖分含量的影響Fig.5 Effects of waterlogging stress on sugar content in wheat grain

2.3 兩種基因型小麥各部位ADH酶活性對淹水脅迫響應(yīng)的差異

淹水脅迫對兩種基因型小麥各部位ADH酶活性的影響如圖6所示.

圖6 淹水脅迫對小麥各部位ADH酶活性的影響Fig.6 Effects of waterlogging stress on ADH enzyme activity in various parts of wheat

由圖6可以看出,淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22根系中ADH酶活性相比對照處理分別顯著提高39.60%、48.95%和64.32%,而BN607根系中ADH酶活性相比對照處理差異不顯著（圖6-A）.除淹水處理后1 d外,其他兩個時期中ZM22老葉中ADH酶活性相比對照處理分別顯著降低28.88%和81.79%,而BN607老葉中ADH酶活性相比對照處理分別顯著提高21.70%和61.61%（圖6-B）.淹水處理后1 d、3 d和7 d時,ZM22旗葉中ADH酶活性相比對照處理分別顯著降低68.30%、31.97%和42.31%,而BN607旗葉中ADH酶活性相比對照處理分別顯著提高215.95%、18.60%和49.33%（圖6-C）.淹水處理后ZM22籽粒中ADH酶活性相比對照處理逐漸降低,淹水處理后7 d時,相比對照處理顯著降低15.29%,而BN607籽粒中ADH酶活性相比對照處理差異不顯著（圖6-D）.

3 結(jié)論與討論

葉綠素不僅是吸收和運(yùn)輸光能的載體,同時也是電子傳遞過程中不可或缺的電子傳遞體,其含量的高低可以反映光合能力與葉片的生長狀況[12].通常情況下淹水脅迫會造成植物葉綠素含量的下降,但有研究表明淹水初期葉綠素含量及其相關(guān)組分會上升,這是植物增強(qiáng)耐澇性的表現(xiàn)[13].本研究發(fā)現(xiàn)淹水處理后造成ZM22老葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量以及旗葉中葉綠素a含量的嚴(yán)重下降,BN607旗葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量都下降,但是BN607老葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量反而都上升.說明兩種耐淹性不同的小麥不同部位葉片響應(yīng)淹水脅迫的內(nèi)在反應(yīng)存在差異.有研究表明不同品種之間葉綠素含量響應(yīng)淹水脅迫下存在差異[14],尤其是葉綠素b,它主要起到與捕光蛋白復(fù)合體結(jié)合收集光能的作用[15],這也進(jìn)一步說明在淹水脅迫下,相比ZM22品種,BN607品種的老葉在維持葉片光合結(jié)構(gòu),提升光合能力方面起著重要作用.

植物體內(nèi)糖分含量的變化是植物適應(yīng)淹水脅迫的重要指標(biāo).蔗糖是植物地上部光合作用的產(chǎn)物,同時它要經(jīng)由韌皮部運(yùn)輸?shù)礁?是根系生長和呼吸代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)[16].在根系有氧呼吸代謝過程中,蔗糖經(jīng)由糖酵解和三羧酸（TCA）循環(huán)等途徑被分解為簡單物質(zhì).但在缺氧環(huán)境下,電子受體（氧）缺少導(dǎo)致電子傳遞受阻,抑制ATP合成和氧化型輔酶再生.ATP是根系細(xì)胞分裂、礦質(zhì)營養(yǎng)吸收同化和運(yùn)輸?shù)缺姸嗌泶x的能量基石.蔗糖的合成和分解受阻就會影響到ATP的供給[17].有研究表明在氧化磷酸化受阻的情況下,氧化型輔酶再生減少使糖酵解和TCA循環(huán)受到抑制,導(dǎo)致小麥植株中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（如蔗糖）大量積累.有研究發(fā)現(xiàn)漬水3 d后小麥地上部分蔗糖含量提高2倍,漬水6 d后根系中蔗糖含量提高4倍[18-19].本研究也發(fā)現(xiàn)淹水處理后兩種耐淹性不同小麥根系中蔗糖含量都上升,但是BN607小麥根系中蔗糖含量相比對照增加幅度更高.淹水處理后兩品種根系中的葡萄糖和果糖含量相比對照處理都降低.這進(jìn)一步說明根系在受到淹水脅迫下蔗糖供應(yīng)能力的多少對根系的生長和呼吸代謝起重要作用.本研究還發(fā)現(xiàn)淹水處理后老葉和旗葉中蔗糖含量存在相反的現(xiàn)象,淹水處理3d后ZM22老葉中蔗糖含量相比對照處理顯著提高,旗葉蔗糖含量相比對照處理顯著降低,而BN607老葉中蔗糖含量相比對照處理降低,旗葉中蔗糖含量相比對照處理顯著提高.說明淹水脅迫下BN607旗葉中合成的蔗糖向下運(yùn)輸受阻,而老葉合成的蔗糖更多的向根系或者其他部位進(jìn)行運(yùn)輸,這一點與前面提到的BN607旗葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量都下降,但是BN607老葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量反而都上升相一致.此外,還發(fā)現(xiàn)ZM22和BN607籽粒中蔗糖含量在淹水處理后都顯著上升,這說明淹水脅迫下葉片合成的光合產(chǎn)物在向根系運(yùn)輸受阻后會加速向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn).

ADH酶活性的高低可以判斷植物對外界淹水環(huán)境下的適應(yīng)能力.在缺氧環(huán)境下,植物體內(nèi)會通過糖酵解過程直接生成ATP,但低氧環(huán)境下糖酵解過程所需的氧化型輔酶合成減少,所需的氧化型輔酶主要在無氧呼吸途徑中由丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇的過程中合成,所以植物會提高丙酮酸脫羧酶（PDC）和ADH酶活性[20],以無氧呼吸維持細(xì)胞生長和代謝的能量供應(yīng)[21].Da-Silva等[22-23]發(fā)現(xiàn)大豆幼苗淹水處理6 h后根系中ADH酶活性急劇上升.這與本研究中發(fā)現(xiàn)淹水處理3 d后ZM22根系中ADH酶活性顯著高于對照處理相一致,但是淹水處理3 d后1 d和3 d時BN607根系中ADH酶活性與對照處理差異不顯著.說明在遇到外界淹水脅迫時ZM22品種根系對外界不良環(huán)境比較敏感,根系需要消耗更多的能量物質(zhì)（蔗糖）來維持生命活動.這一點也與淹水處理下ZM22根系中蔗糖含量的增幅小于BN607根系中蔗糖含量的增幅相吻合.此外,不同品種在淹水脅迫下ADH酶活性以及ADH基因的表達(dá)量都存在差異性,例如水稻KH139和TN14幼苗中淹水脅迫下,ADH1基因的相對表達(dá)量顯著高于對照處理,而TN11、TK9和TNG71品種在淹水脅迫下幼苗ADH1基因的相對表達(dá)量差異不顯著[23].本研究發(fā)現(xiàn)淹水處理下ZM22老葉和旗葉中ADH酶活性顯著低于對照處理,而BN607老葉和旗葉中ADH酶活性顯著高于對照處理,這說明在淹水脅迫下BN607品種相比ZM22品種葉片中能更多的提供所需能量物質(zhì).

總體來看,淹水脅迫下BN607更能較好地適應(yīng)環(huán)境變化,而ZM22對淹水脅迫比較敏感.