• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    季節(jié)性溫度對短程硝化系統(tǒng)微生物群落的影響

    2017-10-13 07:11:44趙昕燕侯愛月闞睿哲
    中國環(huán)境科學(xué) 2017年4期
    關(guān)鍵詞:生物膜條帶硝化

    趙昕燕,卞 偉,侯愛月,闞睿哲,趙 青,李 軍*

    ?

    季節(jié)性溫度對短程硝化系統(tǒng)微生物群落的影響

    趙昕燕1,卞 偉1,侯愛月2,闞睿哲1,趙 青1,李 軍1*

    (1.北京工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院,北京 100124;2.北京國環(huán)清華環(huán)境工程設(shè)計研究院有限公司,北京 100084)

    為了研究季節(jié)性溫度對短程硝化生物膜系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以平均水溫分別為28.3,23.3,21.6,9.6,-0.2℃條件下MBBR反應(yīng)器的短程硝化生物膜為對象,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)對比分析上述生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明: 在控制合適的水力停留時間(HRT)條件下,水溫降低會影響微生物活性,但不影響短程硝化穩(wěn)定性,平均水溫在21.6~-0.2℃變化過程中總細(xì)菌和AOB的多樣性及均勻性基本不變,芽孢桿菌、黃桿菌、亞硝化單胞菌等污水處理功能微生物都得到保留.平均水溫28.3~-0.2℃條件下生物膜中的優(yōu)勢菌群主要分布于變形菌門(Proteobacteria) 和擬桿菌門(Bacteroidetes).其中AOB均屬于β-Proteobacteria的亞硝化單胞菌屬().本試驗(yàn)僅調(diào)控反應(yīng)器水力停留時間(HRT)就可以實(shí)現(xiàn)低溫短程硝化,對于短程硝化工藝廣泛應(yīng)用于工程實(shí)踐具有重要意義.

    低溫;短程硝化;PCR-DGGE;微生物群落結(jié)構(gòu);MBBR

    以短程硝化為基礎(chǔ)的自養(yǎng)脫氮工藝較傳統(tǒng)工藝具有諸多優(yōu)點(diǎn),但其目前多用于處理污泥消化液、高氨氮工業(yè)廢水等,且大部分需要在30~40℃高溫下進(jìn)行[1-3].高溫(>30℃)可以維持短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行已得到了中外學(xué)者的一致認(rèn)可,而低溫條件下短程硝化能否穩(wěn)定維持尚存在爭議.將生活污水加熱到較高溫度需要消耗大量的能源,對于大型污水處理廠,具體實(shí)施的難度以及增加的能耗均不容輕視.因此,探求在常、低溫條件下實(shí)現(xiàn)并維持穩(wěn)定短程硝化的方法,建立相應(yīng)的控制策略,對于短程硝化工藝廣泛應(yīng)用于工程實(shí)踐具有重要意義.

    然而低溫環(huán)境中應(yīng)用活性污泥法處理生活污水效果下降,是目前我國北方城市低溫生活污水處理所面臨的主要問題.生物膜法由于能在生物處理系統(tǒng)中保有較高的生物量而受到廣泛關(guān)注[4-5].近來各國對生物膜的研究興趣逐漸向微觀方面[6],由原來探索水力條件來獲取最佳的處理效果轉(zhuǎn)向生物膜的微觀結(jié)構(gòu)等方面[7].聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE),可以同時快速地對多個環(huán)境樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析,提供微生物群落調(diào)控方面的理論依據(jù),已成為水處理中微生物檢測的常用方法之一.

    本試驗(yàn)采用移動床生物膜反應(yīng)器(MBBR),投加鮑爾環(huán)為懸浮填料,在室外水溫為32.6~ -3.3℃條件下通過及時控制反應(yīng)器水力停留時間(HRT)維持短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.為了研究季節(jié)性溫度對短程硝化生物膜系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以平均水溫分別為28.3,23.3,21.6, 9.6,-0.2℃條件下的短程硝化生物膜為研究對象,利用PCR-DGGE技術(shù)對比分析不同生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu)的異同,以期從微觀方面為低溫條件下穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)短程硝化提供新的思路和方法.

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    試驗(yàn)采用MBBR反應(yīng)器,長180mm,寬120mm,高260mm,有效體積約為5.6L,如圖1所示,反應(yīng)器上部進(jìn)水,蠕動泵控制,下部溢流出水.采用底部曝氣盤曝氣,曝氣量控制和計量采用微電腦曝氣裝置控制,通過探頭精確測量和微調(diào),溫度傳感器在線監(jiān)測反應(yīng)器內(nèi)水溫的變化.實(shí)驗(yàn)采用人工配水(自來水中加入12.8mg/L CH3COONa、11mg/L KH2PO4、229mg/L NH4Cl和720mg/L NaHCO3配制而成).反應(yīng)器內(nèi)的接種污泥均取自北京某污水處理廠曝氣池,其硝化性能良好,值在0.7左右,污泥指數(shù)(SVI)值在90mL/g左右,污泥濃度(MLSS)在3500mg/L左右,向反應(yīng)器內(nèi)投加鮑爾環(huán)作為懸浮填料.實(shí)驗(yàn)過程中控制溶解氧(DO)>5mg/L,進(jìn)水pH值約為7.8,出水pH值約為7.3,整個反應(yīng)階段室外水溫從32.6℃降低到-3.3℃.

    本試驗(yàn)從2015年7月11日啟動掛膜,反應(yīng)器運(yùn)行半年直至2016年1月14日,分子生物學(xué)取樣分別在平均水溫為28.3,23.3,21.6,9.6,-0.2℃條件下,分別記為R1、R2、R3、R4和R5.

    1.2 樣品總DNA提取

    將包埋菌樣品使用研缽研碎,超聲波破碎儀(AMPLITUDE 50%)破碎60s,在1.5mL離心管中靜沉30min后舍去上清液,之后15000r/min高速離心5min后,去除上層清液,取0.3g污泥用于總DNA提取,剩余污泥冷凍備用.采用上海生工提供的“Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(土壤)”提取DNA后,取5μL提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠檢測.

    1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

    針對總細(xì)菌的PCR擴(kuò)增,以提取的總DNA作為模板,采用對大多數(shù)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對[8]F357-GC(5'- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3').反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL,dNTP(各2.5mmol/L)4μL,F357-GC(20μmol/L)1μL,R518(20μmol/L)1μL,Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA模板0.25μL,加ddH2O至50μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行20個循環(huán),每個循環(huán)降低0.5℃;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行10個循環(huán);72℃延伸8min.

    針對亞硝化細(xì)菌(AOB)的PCR擴(kuò)增,采用巢式PCR擴(kuò)增,第1輪擴(kuò)增以提取的總DNA作為模板,采用特異性引物對[9]CTO189fA/B/C (CTO189fA:5'-GGAGAAAAGCAGGGGATCG-3'、CTO189fB:5'-GGAGGAAAGCAGGGGATC- G-3'、CTO189fC:5'-GGAGGAAAGTAGGGGA- TCG-3')和CTO654r(5'-CTAGCYTTGTAGTTT-CAAACGC-3');第2輪擴(kuò)增以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板,采用引物對F357-GC和R518.第1輪反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL, dNTP (各2.5mmol/L)4μL,CTO189fA/B/C(20μmol/L)0.5μL,CTO654r(20μmol/L)0.5μL,Taq DNA聚合酶(5U) 0.5μL,DNA模板1μL,加ddH2O至50μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,57℃退火45s,72℃延伸90s,共進(jìn)行35個循環(huán),72℃延伸10min.第2輪反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL,dNTP(各2.5mmol/L)2μL, F357-GC (20μmol/L)3μL,R518(20μmol/L)3μL,Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA模板0.25μL,加ddH2O至50μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min; 94℃變性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行20個循環(huán),每個循環(huán)降低0.5℃;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行10個循環(huán);72℃延伸8min.

    1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

    采用DCodeTM基因突變檢測系統(tǒng)(Bio- Rad,USA)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離.經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn),本試驗(yàn)的DGGE電泳使用8%的聚丙烯酰胺凝膠,總細(xì)菌和AOB的電泳條件均為:凝膠變性梯度為30%~60%,電壓150V,電泳緩沖液為1×TAE,電泳溫度60℃,電泳時間7h.電泳結(jié)束后,用Gel Red核酸凝膠染料染色30min,在凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+,Bio-Rad)中進(jìn)行拍照.

    1.5 克隆與測序

    對DGGE電泳后圖譜上的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收.對于選定的每個條帶,只選擇其中間部分進(jìn)行切割.回收的條帶轉(zhuǎn)移到1.5mL 離心管中,用槍頭擠碎,加入50μL的滅菌超純水,4℃浸泡過夜,使DNA片段溶解于水中,取其溶液為模板,采用不帶GC夾結(jié)構(gòu)的F357和R518引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系和程序與之前帶GC夾的引物對F357-GC和R518相同.PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并采用上海生工提供的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化,將純化后的DNA片段連接至pMD18-T Vector(TaKaRa, Japan) .轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中,在含有Amp/X- Gal/IPTG的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選.挑選白斑做菌落PCR驗(yàn)證,片段大小正確的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物公司進(jìn)行測序.將測序所得基因序列輸入到NCBI網(wǎng)站,利用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對鑒定,并利用MEGA5.0軟件中的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

    1.6 樣品的生物多樣性分析

    采用凝膠分析軟件Quantity One對掃描所得的DGGE圖譜進(jìn)行分析.根據(jù)DGGE技術(shù)原理,圖譜中分離出來的條帶都是不同種類的微生物16S rDNA基因V3區(qū)的DNA片段,每個條帶理論上可以代表一個微生物種屬,條帶的多寡可以反映系統(tǒng)中微生物種群的多樣性程度.Shannon多樣性指數(shù)(SDI)由樣品中微生物種屬的數(shù)量和豐度所決定,SDI 數(shù)值越大,種群的多樣性越高.Pielou均勻性指數(shù)(EI)表示菌種分布的均勻程度.因此可利用Shannon多樣性指數(shù)(SDI)和Pielou均勻性指數(shù)(EI)討論活性污泥中微生物多樣性特征.SDI和EI計算公式[8]如下:

    (2)

    式中:P為菌種在菌落中所占的百分比,P=n/,n為峰面積,為所有峰的總面積;為是樣品中所有菌種的總數(shù),即Patrick豐富度指數(shù).

    2 結(jié)果與討論

    2.1 溫度對短程硝化性能的影響

    2.1.1 不同溫度條件下系統(tǒng)的短程硝化效果 從圖2可以看出,MBBR反應(yīng)器從7月11日開始運(yùn)行,此時反應(yīng)水溫為30.3℃,通過逐步縮短反應(yīng)器HRT為3.7h的方式,反應(yīng)器中逐漸出現(xiàn)NO2--N的積累,至7月27日,反應(yīng)器中的NO2--N積累率達(dá)到93.3%,出水NH4+-N和NO2--N質(zhì)量濃度分別為3.48mg/L和56mg/L,氨氮去除率達(dá)到94.2%,基本所有NH4+-N都轉(zhuǎn)化為NO2--N,反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)定的短程硝化.反應(yīng)器在8月21日~9月11日停止運(yùn)行,9月11日運(yùn)行一周后活性恢復(fù)到之前的水平.反應(yīng)器運(yùn)行這一階段室外水溫從32.6℃降低至-0.2℃,通過調(diào)節(jié)反應(yīng)器HRT維持出水氨氮在6~12mg/L.11月24日以后室外水溫過低導(dǎo)致連續(xù)流出水口堵塞,所以后期采用SBR形式運(yùn)行,反應(yīng)器運(yùn)行至1月14日.選取6d取樣測定,11月26日~12月28 日HRT為24h,氨氮去除率為60%左右,12月29日~1月14日 HRT為48h,氨氮去除率為50%左右,但亞氮積累率一直維持在90%以上,SBR形式運(yùn)行期間最低溫度低至-3.3℃.R1~R5階段平均水溫分別為28.3,23.3,21.6,9.6,-0.2℃對應(yīng)的氨氧化速率分別為22.4,17.7,16.2,7.1,1.9mgNH4+-N/(L·h),可以看出隨著溫度的降低氨氮氧化速率下降,表明微生物活性下降.

    2.1.2 短程硝化實(shí)現(xiàn)與穩(wěn)定的原因 (1)反應(yīng)器HRT精準(zhǔn)的控制是短程硝化實(shí)現(xiàn)的主要因素.按照出水氨氮在6~12mg/L來調(diào)節(jié)反應(yīng)器HRT,能夠靈活、準(zhǔn)確的確定曝氣時間.這樣一方面可以使大部分氨氮被徹底氧化,另一方面防止了過度曝氣引起亞硝酸鹽氮進(jìn)一步氧化為硝酸鹽氮,從而抑制了亞硝酸氧化菌的生長.

    (2)從溫度的角度考慮,在實(shí)現(xiàn)短程硝化的階段,溫度正處于30~33℃,而這個溫度正是實(shí)現(xiàn)短程硝化的最佳溫度[10],此時AOB的生長速率高于NOB的生長速率,將快速實(shí)現(xiàn)短程硝化.

    在短程硝化的穩(wěn)定階段,通過出水中的FA和FNA協(xié)同抑制,進(jìn)一步增大AOB在硝化菌群中的優(yōu)勢,同時又盡可能減少了NOB的生長機(jī)會,使NOB逐漸從系統(tǒng)中被淘汰出去,從而逐漸優(yōu)化了硝化菌群的結(jié)構(gòu),為在低溫條件下實(shí)現(xiàn)短程硝化奠定基礎(chǔ).

    2.1.3 低溫條件下短程硝化的實(shí)現(xiàn)途徑與機(jī)理 本試驗(yàn)隨著溫度下降氨氧化速率降低,細(xì)菌活性減小,但短程硝化一直很穩(wěn)定,分析其原因:主要是低溫短程硝化的實(shí)現(xiàn)要從中溫、常溫狀態(tài)入手,通過調(diào)節(jié)運(yùn)行方式、控制手段等方法使AOB成為硝化菌群中絕對的優(yōu)勢菌種,并將NOB盡可能多的從系統(tǒng)中淘汰出去[11].

    2.2 溫度對總細(xì)菌的影響

    2.2.1 樣品總DNA提取和總細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果 污泥樣品提取的DNA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到的總DNA片段大小約為23kbp,屬于比較完整的細(xì)菌總DNA,適合做下一步PCR擴(kuò)增.針對總細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果大約為240bp,符合預(yù)期的長度,適合做下一步DGGE.

    2.2.2 DGGE指紋圖譜結(jié)果 如圖3所示,顯示了樣品R1~R5所代表的溫度條件分別為28.3, 23.3,21.6,9.6,-0.2℃的短程硝化污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異和演替.

    圖3是總細(xì)菌DGGE圖譜,將條帶對應(yīng)的微生物可以分為3類,第1類是條帶14、15、19代表的微生物,它們在整個實(shí)驗(yàn)階段都存在,能夠適應(yīng)水溫從32.6~-3.3℃溫度變化大的環(huán)境,對反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行起著至關(guān)重要的作用;第2類是條帶2、3、4、6、7、11、12、17、18對應(yīng)的微生物,它們隨著水溫的逐步降低而逐漸減少至最后被淘汰,表明這類細(xì)菌在水溫低的條件下受到抑制,適合生存于較高溫度環(huán)境中;第3類是條帶5、8、9對應(yīng)的微生物,它們在水溫高的條件下為非優(yōu)勢菌,隨著水溫逐步降低,這類微生物逐漸增多或出現(xiàn),適合生存于低水溫環(huán)境中.

    2.2.3 總細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性特征 如圖4所示,樣品R1到樣品R2的SDI值和EI值均上升,這是反應(yīng)器從啟動到穩(wěn)定的過程,故微生物種群趨于豐富和分布均勻.R2到R3階段SDI值和EI值均下降,一方面是這一階段反應(yīng)器停止運(yùn)行,使得DO和營養(yǎng)物質(zhì)無法供應(yīng)抑制微生物生長繁殖;另一方面R2到R3平均水溫從23.3~ 21.6℃,水溫降低微生物表現(xiàn)出生長速度放緩的趨勢[12],故R2到R3微生物種群多樣性變低,分布趨于集中.

    表1 總細(xì)菌部分條帶 16S rDNA 序列比對結(jié)果

    本實(shí)驗(yàn)中樣品R3、R4和R5的平均水溫分別為21.6、9.6和-0.2℃,溫度跨越比較大,但這3個樣品的SDI值和EI值幾乎相同.分析原因:一是平均水溫從21.6~-0.2℃階段該污水處理系統(tǒng)中耐冷菌漸漸保留了下來,這部分耐冷菌可以適應(yīng)溫度逐漸降低而不被淘汰;二是本試驗(yàn)采用鮑爾環(huán)懸浮填料,對微生物有截留作用,使得大部分細(xì)菌不會流失,故上述3個樣品的多樣性和均勻性幾乎相同.

    2.2.4 特征條帶的回收測序和系統(tǒng)發(fā)育分析 將總細(xì)菌的DGGE圖譜中部分優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠測序,在Genbank中進(jìn)行比對,獲得各條序列的同源性信息,總細(xì)菌的部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果見表1.總細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5.

    由表1可以看出,本次試驗(yàn)5個樣品中的微生物群落主要分布于變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes).Wagner等[14]對多篇關(guān)于廢水生物處理反應(yīng)器中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明變形菌門和擬桿菌門一直是廢水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群.其中5個樣品的共有條帶中,條帶1、13、14、16和19均與Bacillus的同源性達(dá)到98%以上,微生物同源性大于97%就可以判斷為是同一種屬,郝桂玉等[15]認(rèn)為芽孢桿菌(Bacillus)對硝化階段氨氮的去除有很明顯的作用;條帶9與Flavobacterium sp. (HQ000016.1)的同源性達(dá)到98%,黃桿菌屬(Flavobacterium)和芽孢桿菌(Bacillus)均為生物膜污水處理系統(tǒng)的常見優(yōu)勢細(xì)菌,且都是在低溫條件下高效降解生活污水的耐冷菌[16].條帶2、3、4和5均與Nitrosomonas的同源性達(dá)到97%以上,亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)在反應(yīng)器內(nèi)將氨氧化為亞硝酸鹽,為短程硝化系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群[17-18].

    2.3 溫度對AOB的影響

    2.3.1 AOB PCR擴(kuò)增結(jié)果 針對AOB 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果大約為500bp(第1輪)和250bp(第2輪),符合預(yù)期的長度,適合做下一步DGGE.

    2.3.2 DGGE指紋圖譜結(jié)果與分析 圖6為針對AOB的16S rRNA基因所得DGGE圖譜.將條帶對應(yīng)的微生物可以分為2類,第一類微生物隨室外溫度逐步降低一直存在,如條帶2、3、8、9、10,這部分亞硝酸細(xì)菌能夠適應(yīng)短程硝化溫度逐漸降低的各個階段,如果能篩選出這些菌種并加以富集大規(guī)模的培養(yǎng)馴化,則穩(wěn)定的短程硝化系統(tǒng)可以應(yīng)對低溫的惡劣環(huán)境.第二類微生物隨水溫逐步降低而逐漸減少遭到淘汰,如條帶1、4、5、6、7代表的微生物,且這幾類微生物均只存在于R1和R2階段,表明這類亞硝酸鹽細(xì)菌在水溫逐漸降低的條件下受到抑制,適合生存于水溫較高的環(huán)境中.

    2.3.3 AOB種群結(jié)構(gòu)多樣性特征 如圖7所示.可以看出:樣品R1~R5的EI值幾乎相同,表明在穩(wěn)定的生物膜短程硝化系統(tǒng)中,水溫從32.6~-3.3℃微生物分布的均勻性幾乎沒有受到影響.對于SDI值,樣品RI和樣品R2較高且相同,表明平均水溫為23.3~28.3℃環(huán)境中AOB多樣性豐富.

    樣品R3、R4和R5的SDI值較前2個樣品低且?guī)缀跸嗤?即反應(yīng)平均水溫從21.6~-0.2℃系統(tǒng)內(nèi)AOB的多樣性幾乎保持不變.在懸浮生長的活性污泥中,硝化細(xì)菌在低溫條件下生長會受到很大程度上的抑制[19-23],但試驗(yàn)所得結(jié)果卻是上述3個樣品的SDI值幾乎不變.分析原因:一是本試驗(yàn)采用MBBR工藝,V. Hoang[13]等認(rèn)為MBBR反應(yīng)器有快速適應(yīng)和快速恢復(fù)能力,在溫度變化下硝化細(xì)菌保持在生物膜中不丟失也不溶解;二是本試驗(yàn)采用鮑爾環(huán)懸浮填料,硝化細(xì)菌具有強(qiáng)烈的親和依附固體生長的特性,使得硝化細(xì)菌可以依附填料生長和繁殖,不再因其世代時間較長而受制于HRT造成硝化細(xì)菌流失[24];三是Jones等[25]認(rèn)為,如果將AOB從30℃的條件下直接轉(zhuǎn)移到5℃的環(huán)境中,會導(dǎo)致它們失活,但若逐步適應(yīng),AOB能夠根據(jù)溫度變化逐漸調(diào)整細(xì)胞膜中的脂肪酸類型,使其中的飽和長鏈脂肪酸部分轉(zhuǎn)化為短鏈不飽和脂肪酸以使其在低溫條件下不易“凍結(jié)”,但這需要一定時間的培養(yǎng)和馴化.

    2.3.4 AOB特征條帶的回收測序和系統(tǒng)發(fā)育分析 將AOB的DGGE圖譜中部分優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠測序,在Genbank中進(jìn)行比對,獲得各條序列的同源性信息,AOB的部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果見表2. AOB的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖8.

    從表2的AOB部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果和圖8的AOB系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,本研究中分離到的亞硝化細(xì)菌(AOB)均與Proteobacteria的亞硝化單胞菌屬()有較高的相似性(90%~99%),而沒有與亞硝化螺菌屬()有一定相似性的序列,已有研究證實(shí)絕大多數(shù)的生物反應(yīng)器里是AOB中的優(yōu)勢菌屬,而只出現(xiàn)在個別反應(yīng)器里[26-28].由表2可以看出,條帶2和條帶9與sp.的同源性均達(dá)到99%,itrosomonas sp.在氨氮轉(zhuǎn)化為羥胺的過程中起主導(dǎo)作用,造成反應(yīng)器內(nèi)亞硝酸鹽積累,溫室氣體N2O排放增加[29],是影響系統(tǒng)內(nèi)含氮污染物轉(zhuǎn)化途徑的關(guān)鍵菌屬.條帶6和條帶8分別與(NR_117368.1)和(HM446362.1)的同源性達(dá)到98%和99%,可利用氨氧化過程中的電子轉(zhuǎn)移能量,可將CO2固定在植物中,在氮循環(huán)中有重要作用.本研究中的優(yōu)勢AOB均屬于亞硝化單胞菌屬(),且出現(xiàn)在短程硝化穩(wěn)定時期溫度不同階段的不同菌種,表明該反應(yīng)器生物膜內(nèi)部形成的環(huán)境條件在溫度從32.6~-3.3℃均能夠?yàn)槎喾NAOB提供生存環(huán)境.

    表2 AOB部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果

    3 結(jié)論

    3.1 在合理HRT控制的前提下,水溫降低會影響微生物活性,但不會影響短程硝化穩(wěn)定性.

    3.2 試驗(yàn)平均水溫21.6~-0.2℃總細(xì)菌的多樣性和均勻性沒有改變,芽孢桿菌、黃桿菌、亞硝化單胞菌等污水處理功能微生物都得到保留.5個樣品中的優(yōu)勢菌群主要分布于變形菌門()和擬桿菌門().

    3.3 試驗(yàn)平均水溫21.6~-0.2℃ AOB的多樣性和均勻性沒有改變.AOB種群分析表明優(yōu)勢AOB均屬于亞硝化單胞菌屬().

    [1] 高春娣,王惟肖,李 浩,等.SBR法交替缺氧好氧模式下短程硝化效率的優(yōu)化 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(2):403-409.

    [2] 孫洪偉,楊 慶,董國日,等.游離氨抑制協(xié)同過程控制實(shí)現(xiàn)滲濾液短程硝化 [J]. 中國科學(xué):化學(xué), 2010,40(8):1156-1162.

    [3] 張功良,李 冬,張肖靜,等.低溫低氨氮SBR短程硝化穩(wěn)定性試驗(yàn)研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(3):610-616.

    [4] Rivasim, Arvin F. Side stream biofilm for im-proved biofouling control in cooling water system [J]. Water Science & Technology, 2001,41:445-451.

    [5] Paul L B, Tong Y.A microelectrode study of redox potential chain biofilms [J]. Water Science & Technology, 1999,39(7):179-185.

    [6] Massoldeya A A, Whallon J, Hickey R F, et al. Channel structures in aerobic biofilms of fixed –film reactors treating contaminated groundwater [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995,61(3):769-777.

    [7] Chrysi S L, Bruce E R. Modeling the development of biofilm density including active bacteria, inert bio-mass, and extracellular polymeric substances [J]. Water Research, 2004,38:3349-3361.

    [8] 侯愛月,李 軍,卞 偉,等.不同好氧顆粒污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(2):428-436.

    [9] Kowalchuk G A, Bodelier P L E, Heilig G H J, et al. Community analysis of ammonium-oxidizing bacteria,in relation to oxygen availability in soils and root-oxygenated sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotide probe hybridization [J]. FEMS Microbiology Ecology, 1998,24:339-350.

    [10] Hellinga C, Schellen A A, Mulder J W, et al. The sharon process: An innovative method for nitrogen removal from ammonium-rich wastewater [J]. Water Science & Technology, 1998,37(9): 135-142.

    [11] 楊 慶,彭永臻,王淑瑩,等.SBR法低溫短程硝化實(shí)現(xiàn)與穩(wěn)定的中試研究[J]. 化工學(xué)報, 2007,58(11):2901-2905.

    [12] 崔 迪.寒區(qū)污水生化處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能解析 [D]. 哈爾濱::哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2014.

    [13] Hoang V, Delatolla R, Abujamel R, et al. Nitrifying moving bed biofilm reactor (MBBR) biofilm and biomass response to long term exposure to 1℃ [J]. Water Research, 2014,49:215-224.

    [14] Wagner M, Loy A. Bacterial community composition and function in sewage treatment systems [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002,13(3):218-227.

    [15] 郝桂玉,徐亞同,黃民生,等.芽孢桿菌脫氮作用的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2004,27(1):20-21,37.

    [16] 韓曉云.低溫生物膜及其微生物特性研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2006.

    [17] Flores III A, Nisola G M, Cho E, et al. Bioaugmented sulfur- oxidizing denitrification system with Alcaligenes defragrans B21forhigh nitrate containing wastewater treatment [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2007,30(3):197-205.

    [18] Limpiyakorn T, Kurisu F, Sakamoto Y, et al. Effects of ammonium and nitrite oncommunities and populations of ammonia-oxidizing bacteria in laboratory-scale continuous-flow reactors [J]. Fems Microbiology Ecology, 2007,60(3):501-512.

    [19] Van Dyke S, Jones S, Ong S K. Cold weather nitrogen removal deficiencies of aerated lagoons [J]. Environmental Technology, 2003,24(6):767-777.

    [20] Buswell A M, Shiota T, Lawrence N, et al. Laboratory studies on the kinetics of the growth of Nitrosomonas with relation to the nitrification phase of the B.O.D test [J]. Applied Microbiology, 1954,2(1):21-25.

    [21] Mc Cartney D M, Oleszkiewicz J A. Carbon and nutrient removal in a sequencing batch reactor at low temperatures [J]. Environmental Technology, 1990,11(2):99-112.

    [22] Painter H A,Loveless J E. Effect of temperature and pH value on the growth-rate constants of nitrifying bacteria in the activated- sludge process [J]. Water Research, 1983,17(3):237-248.

    [23] Delatolla R, Tufenkji N, Comeau Y, et al. Effects of long exposure to low temperatures on nitrifying biofilm and biomass in wastewater treatment [J]. Water Environment Research, 2012, 84(4):328-338.

    [24] 張 巖,孫鳳俠,謝杭冀,等.四區(qū)一體反應(yīng)器冬季啟動脫氮特性及硝化菌群結(jié)構(gòu)分析[J]. 環(huán)境科學(xué), 2015,36(9):3339-3344.

    [25] Jones R D, Mo ri ta R Y, Koops H P, et al. A new marine am monium-oxidizing bacterium Nitrosomonas cryotolerans sp. nov. [J]. Can. J. Microbiol., 1988,34(10):1122-1128.

    [26] Purkhold U, Pommerening-r?ser A, Juretschko S. Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA and amo A sequence analysis: implications for molecular diversity surveys [J]. Applied Environmental Microbiology, 2000,66(12):5368–5382.

    [27] Wells G F, Park H D, Yeung C H, et al. Ammonia-oxidizing communities in a highly aerated full-scaleactivated sludge bioreactor: betaproteobacterial dynamics and low relative abundance of Crenarchaea [J]. Environmental Microbiology, 2009,11(9):2310–2328.

    [28] Zhang T, Ye L, Tong A, et al. Ammonia-oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria in six full-scale wastewater treatment bioreactors [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011,91(4):1215-7660.

    [29] Yu T, He P J, Lü F, et al. Mediating N2O emissions from municipal solid waste landfills: Impacts of landfill operating conditions on community structure of ammonia-oxidizing bacteriain cover soils [J]. Ecological Engineering, 2009,35(5): 882-889.

    Characteristics of microbial community structure in the stable operation of the partial cut nitrification system with seasonal temperature.

    ZHAO Xin-yan1, BIAN Wei1, HOU Ai-yue2, KAN Rui-zhe1, ZHAO Qing1, LI Jun1*

    (1.College of Architecture Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China;2.Beijing Guohuan Tsinghua Environment Engineering Design and Research Institute, Beijing 100084, China).

    In order to investigate the effect of seasonal temperature on microbial community structure of nitrification biofilm system, the nitrification biofilm system in MBBR reactor under the temperature of 28.3,23.3,21.6,9.6 and -0.2℃ were studied by using denatures gradient gel electrophoresis polymerase chain reaction(PCR-DGGE) technique. The activity of bacteria affected by loss of the water temperature, but did not affect stability of nitrification. During the change of water temperature(21.6~0.2℃), the total bacteria and AOB stayed stable; and the waste-water treatment of Bacillus, Flavobacterium and Nitrosomonas also stayed stable. The dominant bacteria in biofilm mainly was Proteobacteria and Bacteroidetes under the average temperature of 28.3~-0.2℃, and the AOB was Nitrosomonas that was the part of β-Proteobacteria. The partial nitrification under low temperature was achieved by controlling HRT merely, and it made great sense for the application of shortcut nitrification process.

    low temperature;partial nitrification;PCR-DGGE;microbial community structure;MBBR

    X172

    A

    1000-6923(2017)04-1366-09

    2016-08-29

    水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)2015ZX07202-013

    趙昕燕(1992-),女,山西臨汾人,北京工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要從事污水生物處理研究.

    * 責(zé)任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn

    , 2017,37(4):1366~1374

    猜你喜歡
    生物膜條帶硝化
    幽門螺桿菌生物膜的研究進(jìn)展
    生物膜胞外聚合物研究進(jìn)展
    MBBR中進(jìn)水有機(jī)負(fù)荷對短程硝化反硝化的影響
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    厭氧氨氧化與反硝化耦合脫氮除碳研究Ⅰ:
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    光動力對細(xì)菌生物膜的作用研究進(jìn)展
    海水反硝化和厭氧氨氧化速率同步測定的15N示蹤法及其應(yīng)用
    NY3菌固定化及生物膜處理含油廢水的研究
    一種基于MATLAB的聲吶條帶圖像自動拼接算法
    海岸工程(2014年4期)2014-02-27 12:51:28
    曰老女人黄片| 深夜精品福利| 午夜福利一区二区在线看| h视频一区二区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 国产免费av片在线观看野外av| 18禁国产床啪视频网站| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 最近最新免费中文字幕在线| 丝袜人妻中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久国产成人免费| 久久这里只有精品19| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 高清视频免费观看一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 日本五十路高清| 久久久国产精品麻豆| 最黄视频免费看| 伦理电影免费视频| 国产亚洲av高清不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧美激情在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 久久久久久久国产电影| 91精品三级在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美日韩黄片免| 精品乱码久久久久久99久播| 大香蕉久久成人网| 久久这里只有精品19| 亚洲国产欧美在线一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 蜜桃在线观看..| 国产黄色免费在线视频| av天堂久久9| 日韩一区二区三区影片| 欧美日本中文国产一区发布| 极品人妻少妇av视频| 99国产精品99久久久久| 免费黄频网站在线观看国产| 51午夜福利影视在线观看| 成人国语在线视频| 欧美日韩精品网址| 人妻一区二区av| 大香蕉久久成人网| 国产成人精品久久二区二区免费| 99久久人妻综合| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲人成电影免费在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品人妻1区二区| 老司机影院毛片| 操美女的视频在线观看| a级毛片黄视频| 精品一区二区三卡| 高清毛片免费观看视频网站 | 老司机影院毛片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 色婷婷久久久亚洲欧美| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 免费观看av网站的网址| www.精华液| 黄色成人免费大全| 99在线人妻在线中文字幕 | 日日夜夜操网爽| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产在线视频一区二区| 最新在线观看一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲少妇的诱惑av| 国产成人精品无人区| 一级片'在线观看视频| 色老头精品视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 天天影视国产精品| 黄频高清免费视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 久久狼人影院| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日本wwww免费看| 精品久久久精品久久久| 久久久精品免费免费高清| 国产成人影院久久av| 国产精品欧美亚洲77777| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精品美女久久av网站| 操出白浆在线播放| 超碰成人久久| 亚洲第一青青草原| 热99re8久久精品国产| 午夜91福利影院| 在线观看一区二区三区激情| 99riav亚洲国产免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产在线一区二区三区精| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久久久网色| 高清视频免费观看一区二区| 女人精品久久久久毛片| 欧美日韩av久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 天堂中文最新版在线下载| 大码成人一级视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 男女床上黄色一级片免费看| 国产97色在线日韩免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品九九99| 免费不卡黄色视频| 久久国产精品影院| 午夜福利免费观看在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲五月色婷婷综合| 高清视频免费观看一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 啦啦啦免费观看视频1| 久久免费观看电影| av国产精品久久久久影院| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 天堂中文最新版在线下载| 免费av中文字幕在线| 在线观看www视频免费| 五月开心婷婷网| 狂野欧美激情性xxxx| 九色亚洲精品在线播放| av有码第一页| 午夜成年电影在线免费观看| 嫩草影视91久久| 国产伦人伦偷精品视频| 淫妇啪啪啪对白视频| www.自偷自拍.com| 中国美女看黄片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品亚洲成国产av| 久久久久国内视频| 咕卡用的链子| 亚洲视频免费观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 成人免费观看视频高清| svipshipincom国产片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品一区二区在线观看99| 777米奇影视久久| 亚洲熟女毛片儿| 国产三级黄色录像| 欧美精品av麻豆av| 在线观看人妻少妇| 中文欧美无线码| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久狼人影院| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲欧美激情在线| 51午夜福利影视在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 纯流量卡能插随身wifi吗| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av国产精品久久久久影院| 国产一区有黄有色的免费视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 操美女的视频在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 午夜91福利影院| 人妻 亚洲 视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 久热这里只有精品99| 久9热在线精品视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 捣出白浆h1v1| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美日韩精品网址| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久久国内视频| 757午夜福利合集在线观看| www.999成人在线观看| 国产区一区二久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 最近最新免费中文字幕在线| 成人精品一区二区免费| 亚洲,欧美精品.| 久久这里只有精品19| 久热爱精品视频在线9| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品免费大片| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品成人免费网站| 一本久久精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产高清国产精品国产三级| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 香蕉国产在线看| 不卡av一区二区三区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜成年电影在线免费观看| 丁香六月天网| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久中文字幕人妻熟女| 欧美精品av麻豆av| 国产高清激情床上av| 久久性视频一级片| 午夜激情av网站| 一个人免费在线观看的高清视频| xxxhd国产人妻xxx| 久久久欧美国产精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 天堂中文最新版在线下载| xxxhd国产人妻xxx| 婷婷丁香在线五月| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 香蕉国产在线看| 国产精品国产高清国产av | 国产成人av教育| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 久久青草综合色| av欧美777| 无人区码免费观看不卡 | 亚洲国产av新网站| 飞空精品影院首页| 91国产中文字幕| 香蕉久久夜色| 女性生殖器流出的白浆| 怎么达到女性高潮| 免费在线观看完整版高清| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲少妇的诱惑av| 一区二区av电影网| 飞空精品影院首页| 制服诱惑二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 丝袜在线中文字幕| 男女边摸边吃奶| av电影中文网址| 啦啦啦 在线观看视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 麻豆国产av国片精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 男女免费视频国产| 一本大道久久a久久精品| 国产在线免费精品| 久久午夜综合久久蜜桃| av视频免费观看在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美日韩福利视频一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产成人精品久久二区二区91| 成人精品一区二区免费| 国产精品九九99| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲人成电影免费在线| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲黑人精品在线| 免费日韩欧美在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线天堂中文资源库| 在线播放国产精品三级| 午夜福利一区二区在线看| 国产成人欧美在线观看 | 精品久久久久久久毛片微露脸| 人人澡人人妻人| 在线观看免费视频网站a站| 国产97色在线日韩免费| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产高清视频在线播放一区| 成年人黄色毛片网站| 九色亚洲精品在线播放| 老鸭窝网址在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 久久国产精品大桥未久av| 久久青草综合色| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人系列免费观看| 日韩大片免费观看网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲精华国产精华精| 国产在视频线精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 99精品在免费线老司机午夜| 十八禁网站网址无遮挡| 正在播放国产对白刺激| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产亚洲欧美精品永久| 免费少妇av软件| 十分钟在线观看高清视频www| 日韩欧美国产一区二区入口| 大香蕉久久成人网| 丝袜美足系列| 波多野结衣av一区二区av| 久久免费观看电影| 午夜福利影视在线免费观看| 国产三级黄色录像| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一本大道久久a久久精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色a级毛片大全视频| videos熟女内射| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲情色 制服丝袜| 国产日韩欧美亚洲二区| 超色免费av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利,免费看| 国产单亲对白刺激| 动漫黄色视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 蜜桃在线观看..| 91国产中文字幕| 窝窝影院91人妻| 国产在线观看jvid| 又大又爽又粗| 午夜日韩欧美国产| 一区福利在线观看| 最黄视频免费看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美一级毛片孕妇| 999精品在线视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费在线观看日本一区| 免费少妇av软件| 99精品久久久久人妻精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| av网站在线播放免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产成人系列免费观看| 国产男女内射视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品一品国产午夜福利视频| 正在播放国产对白刺激| 国产精品二区激情视频| 国产99久久九九免费精品| 99国产精品免费福利视频| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 人人澡人人妻人| 精品少妇黑人巨大在线播放| 91精品国产国语对白视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 脱女人内裤的视频| 亚洲av电影在线进入| 色播在线永久视频| 黄频高清免费视频| 97人妻天天添夜夜摸| av网站免费在线观看视频| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜福利在线观看吧| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美日韩成人在线一区二区| 少妇粗大呻吟视频| 日本wwww免费看| 国产日韩欧美亚洲二区| 大片电影免费在线观看免费| 国产不卡av网站在线观看| 制服人妻中文乱码| www.999成人在线观看| 国产精品电影一区二区三区 | 大陆偷拍与自拍| 搡老熟女国产l中国老女人| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲色图av天堂| 电影成人av| 国产伦理片在线播放av一区| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品美女久久av网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 90打野战视频偷拍视频| 不卡av一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 一边摸一边抽搐一进一小说 | av视频免费观看在线观看| 搡老乐熟女国产| 深夜精品福利| 国产成人精品久久二区二区免费| 18禁美女被吸乳视频| 欧美日韩av久久| 亚洲人成电影观看| 亚洲全国av大片| 亚洲免费av在线视频| 免费少妇av软件| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品在线美女| 男女之事视频高清在线观看| 人人澡人人妻人| 国产av一区二区精品久久| 少妇的丰满在线观看| 午夜视频精品福利| 香蕉国产在线看| 亚洲全国av大片| 国产区一区二久久| 人妻 亚洲 视频| 人人澡人人妻人| 国产精品.久久久| 在线观看舔阴道视频| 99国产综合亚洲精品| 欧美激情久久久久久爽电影 | 搡老熟女国产l中国老女人| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美一级毛片孕妇| 99国产极品粉嫩在线观看| 成年人黄色毛片网站| 欧美成人午夜精品| 后天国语完整版免费观看| 韩国精品一区二区三区| av网站在线播放免费| 欧美午夜高清在线| 国产成人免费无遮挡视频| 国产有黄有色有爽视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产黄频视频在线观看| 好男人电影高清在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 成人av一区二区三区在线看| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女主播在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| av一本久久久久| 亚洲久久久国产精品| 黑人操中国人逼视频| 大型av网站在线播放| 亚洲三区欧美一区| 亚洲伊人久久精品综合| 一区福利在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 一边摸一边抽搐一进一小说 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丝袜人妻中文字幕| 国产深夜福利视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 美国免费a级毛片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美黄色淫秽网站| 他把我摸到了高潮在线观看 | 人成视频在线观看免费观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品一二三| 中文字幕高清在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 69av精品久久久久久 | a级毛片在线看网站| 午夜激情av网站| 免费观看a级毛片全部| 丁香六月天网| 91大片在线观看| 露出奶头的视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产日韩欧美在线精品| 午夜免费鲁丝| 免费观看av网站的网址| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 99re在线观看精品视频| 怎么达到女性高潮| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲中文字幕日韩| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久 成人 亚洲| 大型av网站在线播放| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 我的亚洲天堂| 国产伦人伦偷精品视频| 激情视频va一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 两个人免费观看高清视频| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | av片东京热男人的天堂| 欧美午夜高清在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产片内射在线| 久久久国产精品麻豆| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲伊人色综图| 欧美国产精品一级二级三级| 大香蕉久久网| 欧美日韩av久久| 在线观看免费午夜福利视频| 天天影视国产精品| 国产成人av激情在线播放| 91av网站免费观看| 激情视频va一区二区三区| 桃花免费在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美乱码精品一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 91国产中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 久久午夜综合久久蜜桃| 丝袜美腿诱惑在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 两人在一起打扑克的视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 久久免费观看电影| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 高清在线国产一区| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲五月色婷婷综合| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲成人国产一区在线观看| av电影中文网址| 一区二区三区精品91| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费高清在线观看日韩| 日韩一区二区三区影片| 十分钟在线观看高清视频www| 精品乱码久久久久久99久播| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 两性夫妻黄色片| 日本欧美视频一区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 91麻豆av在线| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 9热在线视频观看99| 无人区码免费观看不卡 | 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜福利在线观看吧| 精品人妻1区二区| 久久人妻av系列| 香蕉丝袜av| 亚洲精品在线美女| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日韩三级视频一区二区三区| 美女国产高潮福利片在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 男女下面插进去视频免费观看| 999久久久国产精品视频| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产激情久久老熟女| 天天添夜夜摸| 黑丝袜美女国产一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美黄色片欧美黄色片| 成年人午夜在线观看视频| 无人区码免费观看不卡 | 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜福利一区二区在线看| 无限看片的www在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲视频免费观看视频| 免费日韩欧美在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一区二区av电影网| 国产不卡av网站在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲国产av新网站|