水分虧缺對小麥芒和旗葉光合特性及蔗糖、淀粉合成的影響

和 娟，唐 燕，李曉瑞，李海蘭，周春菊，呂金印

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

小麥?zhǔn)俏覈狈街骷Z作物，其總產(chǎn)量涉及到國家糧食安全，不同生長期的季節(jié)性干旱是造成中國北方冬小麥減產(chǎn)的主要原因[1]。小麥穗部非葉器官是除旗葉外重要的光合同化物來源[2]。芒作為穗部重要的光合器官，占穗部50%～60%的光合面積，潛在地增加了小麥對光的捕獲[3-4]，對籽粒的光合貢獻(xiàn)約占穗部凈光合的50%[5]。大麥中芒光合可占穗部凈光合作用的90%[6-7]。對小麥近等基因系(NILs)的研究表明，芒的存在增加了籽粒體積。但因籽粒數(shù)量減少，最終產(chǎn)量不一定增加，而籽粒數(shù)量減少可能是芒的生長消耗了碳同化物[8]，從而使可供小花原基發(fā)育的同化物分配量減少[9]。目前，有關(guān)芒的光合貢獻(xiàn)仍存在爭議，而更多的研究仍支持芒的存在是促進穗光合的主要因素[1,5,10-11]。

小麥穗部在干旱下可保持較高的滲透調(diào)節(jié)能力[13]，相比旗葉具有較高的相對水分含量[14]。研究表明，芒因其特殊的解剖結(jié)構(gòu)而具有一定的抗旱保水能力[15]。蔗糖是植物中光合碳同化物運輸?shù)闹饕问絒16]，蔗糖合成酶(Sucrose synthase, SS)和蔗糖磷酸合酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)是蔗糖合成的關(guān)鍵酶[17-18]。蔗糖合成酶催化果糖和核苷二磷酸(NDP)之間糖基部分的轉(zhuǎn)移是可逆的(蔗糖+NDP?NDP-葡萄糖+果糖)，其轉(zhuǎn)化平衡與pH值有關(guān)，當(dāng)7.5

干旱處理下，有關(guān)小麥芒等非葉器官對籽粒的光合貢獻(xiàn)及其蔗糖淀粉合成酶活性與基因表達(dá)的研究較少，本研究于小麥灌漿期進行水分虧缺處理，測定籽粒灌漿過程中小麥旗葉和芒凈光合速率、蒸騰速率、葉綠素含量和相對含水量等生理指標(biāo)，分析蔗糖和淀粉含量及其合成關(guān)鍵酶活性與基因表達(dá)水平，以期為研究干旱脅迫下小麥生育后期穗部芒的光合貢獻(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗品種選用‘鄭引1號’小麥，盆栽試驗于2017年10月—2018年6月在西北農(nóng)林科技大學(xué)遮雨網(wǎng)室中進行。使用上、下口直徑和高分別為23、16 cm和18 cm的聚乙烯塑料桶；試驗土壤類型為紅油土，取自大田耕作層(0～20 cm)，風(fēng)干后過篩(每公斤土拌入尿素0.447 g、磷酸二氫鉀0.2 g)，播種前每盆裝土6.5 kg(風(fēng)干土含水量為14.7%)。每盆點播22粒小麥種子，于小麥三葉期定苗12株，同時剪去分蘗。本試驗設(shè)置對照組(CK)和水分虧缺(WD)兩組處理，土壤水分分別保持在田間持水量的70%～75%(CK)和40%～45%(WD)，土壤凈含水量分別為20.51%～21.98%和11.72%～13.19%。本試驗在開花前5 d開始控水，通過稱重法每天按照控水標(biāo)準(zhǔn)補水，使每盆小麥土壤含水量于開花時達(dá)到控水標(biāo)準(zhǔn)。花后0、4、8、12、16、20、24 d上午9∶00采集小麥旗葉和芒，兩組處理不同器官各采集3個生物學(xué)重復(fù)，稱重后-80℃冰箱保存，待測其他指標(biāo)。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合參數(shù)的測定 根據(jù)Jia等的方法[22]，在花后0、4、8、12、16、20、24 d上午9∶00，選取對照(CK)和水分虧缺(WD)兩組處理小麥植株，采用便攜式光合測定系統(tǒng)(LI-6400XT，LiCor，USA)測定旗葉和芒的凈光合速率(Pn)與蒸騰速率(E)，每個處理設(shè)5個生物學(xué)重復(fù)。芒光合參數(shù)的測定參考Hosseini等[23]和施生錦等[12]的方法,并做了一些修改，將芒迅速剪下整齊無重疊排列于標(biāo)準(zhǔn)葉室中，測定其光合參數(shù)。實際參與光合的芒表面積用Epson Perfection V800 photo根系掃描儀(SeikoEpson Corporation, Nagano Prefecture, Japan)測定。旗葉光合參數(shù)的測定按常規(guī)方法進行。

1.2.2 葉綠素含量(Chl)、相對水分含量(RWC)和丙二醛(MDA)含量的測定 葉綠素含量測定參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》的方法[24]。將旗葉和芒剪成0.5 cm長小段浸泡于25 ml 80%丙酮中，于黑暗中提取2 d至樣品變白。過濾后的葉綠素提取液分別在663 nm和646 nm下測定吸光度，以80%丙酮為空白對照。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

RWC的測定參照Maydup等的方法[1]。采集不同處理芒、旗葉，稱鮮重(wi)，浸泡于蒸餾水中，4℃處理過夜，取出稱重(wf)，然后60℃下烘48 h至恒重，稱重(wd)。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

MDA含量的測定參照Li等的方法[11]。將樣品放入提前預(yù)冷的研缽中，加入3 ml 0.05 mol·l-1磷酸緩沖液(pH值7.8)研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，加入3 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液(用5%三氯乙酸溶解)，搖勻。沸水浴10 min后冷卻，3 000 g離心15 min，取上清液測532、600 nm和450 nm處的吸光度，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 蔗糖含量、淀粉含量與可溶性糖含量的測定 提取液的制備參考張志良等[25]的方法，蔗糖含量測定用間苯二酚法[26]，可溶性糖和淀粉含量的測定采用蒽酮-硫酸法[25,27]。

1.2.4 酶活性測定 蔗糖合成酶(SS，合成方向)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性測定參考Wardlaw的方法[28]。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性測定根據(jù)Nakamura等的方法[29]進行。上述酶活性測定每個處理均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 蔗糖和淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)差異的測定 RNA提取、cDNA合成及實時定量RT-PCR參照Li等的方法[30]。用Primer Premier 6.0設(shè)計引物，蔗糖和淀粉合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因(SS1,SS2,SPS1,AGPase,SSS)引物及內(nèi)參基因actin的引物見表1?；虮磉_(dá)水平的計算用2-ΔΔCT公式[32]。

表1 小麥芒和旗葉中蔗糖和淀粉代謝關(guān)鍵酶基因?qū)崟r定量RT-PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比較(P<0.05)檢驗差異顯著性，采用Graphpad prism 6.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分虧缺對芒和旗葉凈光合速率和蒸騰速率的影響

小麥灌漿期旗葉凈光合速率(Pn)呈持續(xù)下降趨勢(圖1A)。與正常供水處理(CK)相比，水分虧缺處理(WD)旗葉Pn下降速率較快。但芒Pn呈現(xiàn)先增后減趨勢(圖1C)，花后8 d達(dá)到峰值。與正常供水處理(CK)相比，水分虧缺處理花后16、24 d旗葉Pn分別下降了29.5%、87.7%，而芒Pn則分別下降了14.2%、11.4%。旗葉Pn降幅明顯高于芒。旗葉和芒的蒸騰速率(E)表現(xiàn)出與Pn相似的趨勢(圖1B)，花后4 d芒E達(dá)到峰值(圖1D)。與正常供水處理(CK)相比，水分虧缺處理花后20 d旗葉E下降了40.1%，而芒E則下降了20.9%。表明水分虧缺狀態(tài)下小麥芒的Pn和E所受抑制小于旗葉，芒在兩種處理下均表現(xiàn)出了一定的光合持久性。

2.2 水分虧缺對芒和旗葉葉綠素含量、相對水分含量和丙二醛含量的影響

在灌漿期小麥旗葉葉綠素(Chl)含量呈持續(xù)下降趨勢(圖2A)，芒Chl含量呈先增后減趨勢，于花后8 d達(dá)到峰值(圖2D)。與對照(CK)相比，水分虧缺處理(WD)旗葉Chl含量在花后20、24 d分別下降了58.0%、50.2%，而芒Chl含量在花后20、24 d分別下降了15.9%、9.9%，旗葉Chl含量降幅明顯大于芒。表明水分虧缺狀態(tài)下芒中葉綠素降解較慢，相比旗葉表現(xiàn)出了衰老延遲現(xiàn)象。

旗葉和芒相對水分含量(RWC)表現(xiàn)出與Chl相似的趨勢。與對照(CK)相比，在花后20、24 d水分虧缺處理旗葉相對水分含量(RWC)分別下降了7.6%、13.9%(圖2B)，芒RWC分別下降了2.1%、1.5%(圖2E)。相比旗葉，芒有較好的保水能力，可能是其在水分虧缺下具有更高光合效率的原因之一。

旗葉和芒丙二醛(MDA)含量呈持續(xù)上升趨勢，且旗葉MDA含量顯著上升。與對照相比，水分虧缺處理花后4、12、24 d旗葉MDA含量分別增加了19.3%、19.4%、50.8%(圖2C)，而芒在花后4、12、24 d分別增加了9.8%、14.5%、14.0%(圖2F)。芒中MDA增幅明顯小于旗葉。表明水分虧缺下芒的MDA積累少，相比旗葉具有較強的抗氧化能力，其膜脂過氧化對細(xì)胞的損傷程度相對較小。

2.3 水分虧缺對小麥芒和旗葉中蔗糖、淀粉和可溶性糖含量的影響

隨著小麥灌漿進程旗葉和芒中蔗糖含量呈先升后降趨勢，并在花后8 d達(dá)到峰值(圖3A，3D)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理旗葉蔗糖含量下降速率較快，花后4、12、24 d旗葉蔗糖含量分別下降了28.0%、33.7%、50.1%，芒蔗糖含量分別下降了13.7%、14.1%、18.2%，明顯低于旗葉的降幅。芒和旗葉淀粉含量在灌漿過程中呈現(xiàn)出與蔗糖含量相似的趨勢(圖3B，3E)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理灌漿中期(花后12 d)旗葉和芒中淀粉含量分別降低了19.5%、7.0%。在灌漿中后期，花后16、24 d水分虧缺下旗葉淀粉含量分別降低了23.3%、46.4%，芒中淀粉含量分別降低了8.1%、18%，降幅明顯小于旗葉。說明水分虧缺下芒中蔗糖和淀粉含量受影響較小，為灌漿中后期籽粒中同化物的重要來源。

由于粗過濾器2016年下半年進行過內(nèi)部檢修，失效可能性較小而且粗過濾器拆檢工程量相對較大，先對細(xì)過濾器進行開罐檢查；濾料剩余不到一半，表面的無煙煤基本消失，而且濾料中大量泥土類雜質(zhì)，基本確定細(xì)過濾器失效。

與蔗糖和淀粉含量變化類似，在灌漿期小麥旗葉和芒可溶性糖含量呈先上升后下降趨勢，峰值出現(xiàn)在花后4 d(圖3C，3F)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理花后4、12、24 d旗葉可溶性糖含量分別下降了21.2%、14.1%、64.4%，芒中可溶性糖含量分別下降了10.6%、6.9%、16.2%，旗葉可溶性糖降幅明顯高于芒。說明芒的可溶性糖含量受干旱脅迫的影響較小，其滲透調(diào)節(jié)能力更強。

2.4 水分虧缺對小麥芒和旗葉中蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合酶、腺苷二磷酸焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶活性的影響

小麥灌漿期旗葉和芒蔗糖合成酶(SS，合成方向)活性呈先升后降趨勢(圖4A、4E)，花后8 d達(dá)到峰值。與正常供水處理相比，水分虧缺處理旗葉SS活性下降速率較快，花后8、24 d旗葉SS活性分別下降了15.0%和30.1%，而芒SS活性則分別下降了11.5%和8.3%，旗葉SS活性降幅明顯高于芒。旗葉和芒的蔗糖磷酸合酶(SPS)活性表現(xiàn)出與SS相似的趨勢，花后8 d達(dá)到峰值(圖4B、4F)。與正常供水處理相比，花后8、24 d水分虧缺處理旗葉SPS活性分別下降了13.7%和36.0%，芒則分別下降了7.3%和14.8%，降幅明顯小于旗葉。表明水分虧缺對芒中蔗糖合成關(guān)鍵酶活性影響較小。

小麥灌漿期旗葉和芒腺苷二磷酸焦磷酸化酶(AGPase)活性呈先升后降趨勢，花后8 d達(dá)到峰值(圖4C、4G)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理旗葉和芒花后8 d AGPase活性分別下降了20.8%和8.4%；在灌漿中后期(花后12、24 d)，旗葉AGPase活性分別下降了27.8%和32.3%(圖4C)，芒則分別下降了10.7%和7.9%(圖4G)，旗葉AGPase活性降幅明顯高于芒。旗葉和芒的可溶性淀粉合成酶(SSS)活性表現(xiàn)出與AGPase相似的趨勢，花后8 d達(dá)到峰值(圖4D、4H)。與正常供水處理相比，花后8 d水分虧缺處理旗葉和芒SSS活性分別降低了15.9%和10.2%；花后20、24 d旗葉SSS活性分別下降了27.8%和36.2%，芒分別降低了15.0%和7.0%，明顯低于旗葉的降幅。說明在干旱處理下，相對于旗葉，芒中淀粉合成關(guān)鍵酶受到的損傷較小，在小麥灌漿中后期仍能保持一定的碳同化能力。

2.5 水分虧缺下小麥芒和旗葉蔗糖與淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)差異

小麥灌漿期旗葉和芒中蔗糖合成酶基因(SS1、SS2)和蔗糖磷酸合酶基因(SPS1)表達(dá)水平呈先升后降趨勢，花后4d達(dá)到峰值(圖5)。與正常供水處理相比，花后4、12 d水分虧缺處理旗葉SS1表達(dá)水平分別下降了23.1%、30.4%，SPS1表達(dá)水平分別下降了11.8%、7.7%；而芒中SS1表達(dá)水平分別下降了9.5%、6.7%，SPS1表達(dá)水平分別降低了20.0%、9.5%，芒中基因表達(dá)水平降幅明顯低于旗葉。水分虧缺下SS2表達(dá)水平整體呈逐漸下降趨勢，花后4 d有小的增幅。與正常供水處理相比，花后4、12d水分虧缺下旗葉SS2表達(dá)水平分別下降了14.8%、25.0%，芒則分別下降了10.4%、12.5%，明顯低于旗葉的降幅。在整個灌漿期旗葉與芒蔗糖合成相關(guān)基因表達(dá)水平變化趨勢，與蔗糖合成相關(guān)酶活性變化趨勢基本吻合，同時與蔗糖含量變化趨勢一致。

與正常供水處理相比，水分虧缺處理花后4、12 d旗葉中AGPase表達(dá)水平分別下降了13.3%、16.7%，SSS表達(dá)水平分別下降了20.0%、14.3%；而芒中AGPase表達(dá)水平分別下降了6.3%、15.4%，SSS表達(dá)水平分別降低了6.3%、8.3%，芒中AGPase、SSS表達(dá)水平降幅明顯低于旗葉。灌漿前中期(花后4、8、12 d)淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)水平上升，與淀粉含量和淀粉合成關(guān)鍵酶活性變化趨勢一致。

3 討 論

旗葉是小麥的主要光合器官，但近年來有研究表明，穗光合對小麥產(chǎn)量貢獻(xiàn)顯著，尤其是在水分虧缺下[32]。當(dāng)小麥旗葉光合作用在花后逐漸下降時，穗部仍然保持一定光合活性，尤其是在灌漿中后期穗部依然可為生長的籽粒提供光合產(chǎn)物[22]。芒著生于穗部頂端，有更大的光合面積，便于獲取光能，使其在光合作用方面更有優(yōu)勢[33]。本研究表明，在小麥灌漿過程中，旗葉凈光合速率(Pn)和蒸騰速率(E)在灌漿中后期快速下降，而芒Pn和E降幅明顯小于旗葉。與正常供水處理相比，水分虧缺處理芒的Pn和E降幅明顯小于旗葉。表明水分虧缺下芒在灌漿中后期仍能保持一定的光合能力，在灌漿后期可保持比旗葉更高的光合效率。

相比于旗葉，水分脅迫下穎殼和芒更好的水分狀態(tài)與其更強的滲透調(diào)節(jié)能力和更高的相對水分含量有關(guān)[2]。本研究中水分虧缺下旗葉葉綠素(Chl)含量和相對水分含量(RWC)隨著灌漿進程快速下降，而芒Chl含量和RWC在灌漿中后期降幅明顯小于旗葉。相比于旗葉，水分虧缺下芒具有衰老延遲性和更好的保水性。水分虧缺下芒中MDA含量增幅明顯小于旗葉，芒具備更強的抗氧化能力。這些特性均為芒保持一定的光合速率奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

1)灌漿期水分虧缺處理對小麥旗葉光合作用的影響較芒顯著(P<0.05)，隨著灌漿的進行，旗葉和芒Pn、Chl含量和RWC均呈下降趨勢，與CK處理相比，花后24 d旗葉Pn、Chl含量和RWC分別下降了87.7%、54.1%和13.9%，芒中則分別下降了14.4%、12.3%和1.5%。相比旗葉，芒表現(xiàn)出保水性和光合持久性。

2)灌漿期水分虧缺處理對小麥旗葉光合碳同化物合成的影響較芒顯著(P<0.05)。灌漿期間旗葉和芒中蔗糖、淀粉含量及其合成關(guān)鍵酶的活性和基因表達(dá)水平均下降，特別是在灌漿中后期，旗葉中降幅明顯大于芒，表現(xiàn)出芒持續(xù)合成光合產(chǎn)物的能力。

3)灌漿期間水分虧缺下芒中丙二醛含量增幅顯著小于旗葉，表現(xiàn)出更強的抗氧化能力；可溶性糖含量降幅顯著小于旗葉，有更強的滲透調(diào)節(jié)能力。