南京市乙肝病人乙型肝炎病毒P區(qū)突變特點與肝癌易感性的相關(guān)性分析

徐露露，張琴，時瑞，金曉燕，孫梅

乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致的常見肝病。相關(guān)研究顯示，在全球范圍內(nèi)約有2.4億人長期感染HBV，長期慢性HBV感染可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝癌［1-2］。大量研究表明，HBV感染是乙肝病人高發(fā)肝癌的重要因素，加之長期藥物治療易使多聚酶區(qū)產(chǎn)生耐藥性突變，導(dǎo)致HBV難以被清除，因此，HBV突變特點在乙肝病人病情程度的預(yù)測中發(fā)揮重要的臨床意義［3］。而HBV-P區(qū)是HBV重要的多聚酶區(qū)，其突變特點與HBV耐藥有關(guān)，但關(guān)于其與肝癌易感性的報道較少［3-4］。對此，本研究檢測南京市第二醫(yī)院乙肝病人HBV-P區(qū)突變情況，并分析其與肝癌易感性的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2020年12月南京市第二醫(yī)院乙肝病人1 100例，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床癥狀、病史、實驗室、超聲或CT等檢查為乙肝［5］，年齡＞18歲、無精神病病史，無心、肺、腎等功能不全，臨床資料完整，簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并乳腺癌、胃癌等其他腫瘤，孕產(chǎn)婦或哺乳期女性，檢查前3個月有免疫、化療、放療等治療史，合并心、肺、腎等功能不全及精神病病史，具有檢查禁忌證。病人均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

分組標(biāo)準(zhǔn)：乙肝組：乙肝病毒感染后，但未發(fā)生癌變的病人（包括肝硬化）；肝癌組：乙肝病毒感染后，乙肝細(xì)胞發(fā)生癌變的病人。

1.2 方法所有病人均行常規(guī)肝功能、HBV基因分型及其P區(qū)突變、病理等檢查，所有操作均嚴(yán)格依據(jù)相關(guān)說明書進行。主要試劑與儀器，AU5800全自動生化分析儀及測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBiL）試劑購自美國貝克曼庫爾特公司，HBV檢測試劑購自湖南圣湘生物科技有限公司，HBV全基因組提取試劑盒、乙型肝炎病毒耐藥基因突變檢測試劑盒均購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，ABI3500基因測序儀及配套Data Collection與Sequencing Analysis測序軟件購自美國Life technology公司，取空腹靜脈血5 mL并分離血清（3 000 r/min，10 min）后保存于-20 ℃冰箱。肝功能檢查，常規(guī)以AU5800全自動生化分析儀及試劑檢測ALT、AST、TBiL；HBV檢測，ABI Prism7500熒光定量PCR儀及湖南圣湘定量檢測試劑盒行定量分析；HBV-P區(qū)突變檢測，采用中山大學(xué)達(dá)安基因提取試劑盒提取HBV基因組，以中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司乙型肝炎病毒耐藥基因突變檢測試劑盒采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-測序法行HBV-P區(qū)核酸擴增，純化處理后以ABI3500基因測序儀行測序和基因分型、耐藥突變位點檢測，采用Data Collection與Sequencing Analysis測序軟件確定突變位點；病理檢查，肝穿刺或手術(shù)后取肝病變組織，送病理學(xué)行常規(guī)病理檢查肝癌發(fā)生情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布的采用t檢驗，HBV-P區(qū)突變特點與肝癌易感性的相關(guān)性采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙肝組和肝癌組HBV-P區(qū)突變情況病理切片檢查顯示1 100例乙肝病毒感染者中，HBV-P區(qū)突變650例，占比59.09%；其中肝癌病人24例，占比2.18%。

2.2 肝癌組和乙肝組一般資料比較肝癌組和乙肝組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 肝癌組和乙肝組一般資料比較

2.3 肝癌組和乙肝組HBV-P區(qū)突變率比較乙肝組的HBV-P區(qū)突變率為58.18%（626/1 076），肝癌組HBV-P區(qū)均發(fā)生突變，突變率為100.00%（24/24），顯著高于乙肝組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.99，P＜0.001）；在乙肝組和肝癌組中，rt204突變比率均最高，并且肝癌組（41.67%）此位點突變率顯著高于乙肝組（15.34%）。結(jié)果還顯示rt180，rt250位點在肝癌組（25%，16.67%）中突變率也高于乙肝組（8.63%，5，11%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2，3。

表2 肝癌組和乙肝組HBV-P區(qū)位點突變率比較/例（%）

表3 肝癌組和乙肝組HBV-P區(qū)位點突變率比較/例（%）

2.4 HBV-P區(qū)突變特點與肝癌易感性的相關(guān)性分析logistic回歸分析結(jié)果顯示，將乙肝病人是否發(fā)生肝癌設(shè)為Y變量（是=1、否=0），將rt204、rt180、rt250位點是否突變設(shè)為X變量（是=1、否=0）時，rt204、rt180、rt250位點突變是乙肝病人發(fā)生肝癌易感性的獨立影響因素（P＜0.05），見表4。

表4 HBV-P區(qū)突變特點與肝癌易感性的logistic回歸分析

3 討論

乙肝發(fā)病機制復(fù)雜，主要與HBV感染有關(guān)，與飲食、黃曲霉素攝入等因素也有相關(guān)性，可導(dǎo)致肝區(qū)疼痛、腹脹、肝脾腫大等癥狀。目前，對于乙肝病人的主要治療策略均以干擾素與抗病毒藥物治療為主，經(jīng)證實其療效已逐漸被認(rèn)可［6-7］。但在臨床治療中，尚無特效療法，尤其是長期HBV感染可加劇肝細(xì)胞損壞，加之HBV為雙鏈DNA病毒，易發(fā)生變異、耐藥，導(dǎo)致病情遷延不愈，引起肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌［8-9］。而有研究顯示，HBV可分為A-I共9型，呈地理區(qū)域性分布，其會誘導(dǎo)機體發(fā)生自身免疫反應(yīng)、免疫耐受性損害等病理變化，導(dǎo)致HBV不易被免疫系統(tǒng)清除，從而增加治療難度，提示分析乙肝病人HBV突變特點對評估其病情變化具有重要的臨床意義［10-11］。

本研究結(jié)果中，結(jié)合病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，所納入的南京市1 100例乙肝病人中，肝癌發(fā)生率為2.18%，肝癌病人HBV-P區(qū)均發(fā)生突變，且突變率顯著高于乙肝組，表明HBV-P區(qū)突變的乙肝病人者較易發(fā)生肝癌。據(jù)相關(guān)研究表明，HBV-P區(qū)突變與HBV耐藥、不易被免疫清除等改變有關(guān)，酪氨酸（Y）-蛋氨酸（M）-門冬氨酸（D）-D變異是HBV最常見的耐藥變異模式，主要由蛋氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）取代所致，進而增加乙肝病毒核心抗原（HBcAg）的產(chǎn)量而加強HBV的復(fù)制能力，并可調(diào)節(jié)pg RNA轉(zhuǎn)錄水平或促使其衣殼化，使HBV耐藥而不易被免疫清除［12-13］。因此，乙肝病人HBV-P區(qū)突變時可能促使Y-M-D-D變異，使機體發(fā)生自身免疫反應(yīng)、免疫耐受性損害等病理變化，誘導(dǎo)HBV耐藥并增強其復(fù)制能力，增強了HBV的存活能力而不易被機體免疫或藥物治療清除，使病人長期處于HBV感染中，從而導(dǎo)致肝癌［14-15］。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)HBV-P區(qū)突變特點中，肝癌病人rt204、rt180、rt250位點突變率明顯高于乙肝組，logistic回歸分析結(jié)果顯示rt204、rt180、rt250位點突變是乙肝病人發(fā)生肝癌易感性的獨立影響因素，表明rt204、rt180、rt250位點突變可能易導(dǎo)致乙肝病人發(fā)生肝癌。有研究報道，HBV-P區(qū)含多個位點，不同位點突變的作用存在差異，其中rt204、rt180、rt250等位點突變可能導(dǎo)致HBV原結(jié)構(gòu)和功能改變［16］。因此，本研究認(rèn)為HBV-P區(qū)中rt204、rt180、rt250等位點突變可能會促使Y-M-D-D變異，使M變?yōu)閂或I，引起了pg RNA轉(zhuǎn)錄改變或衣殼化，并促使HBcAg產(chǎn)量增加而加強了HBV復(fù)制能力，增強了HBV耐藥及存活能力而不易被清除，使乙肝病人長期處于HBV感染中，加劇了肝細(xì)胞損壞而促使了病情進展，從而引起肝纖維化、肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌。故本研究認(rèn)為，應(yīng)重視乙肝病人HBV檢測，尤其是重點分析HBV-P區(qū)突變特點，對rt204、rt180、rt250等位點突變者應(yīng)警惕其肝癌易感性，加強對該人群的病情監(jiān)測和治療。

本研究也有局限性，如乙肝病人呈地理區(qū)域性分布，且乙肝病人HBV-P區(qū)突變特點復(fù)雜，不同位點突變的作用存在差異，尚不足以代表所有病患情況，今后還需更深入、更大樣本研究。但本研究確切發(fā)現(xiàn)，南京市乙肝病人HBV-P區(qū)突變特點與肝癌易感性有關(guān)，其中rt204、rt180、rt250位點突變可能易導(dǎo)致肝癌發(fā)生，臨床治療時應(yīng)重視病情監(jiān)測。