糖肝煎對2型糖尿病大鼠攝食及攝食抑制因子1、饑餓素的影響

陶毅，徐乃佳，胡愛民

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以胰島細(xì)胞損傷及胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為臨床特征的代謝性疾?。?］。T2DM慢性高血糖會對機(jī)體臟器產(chǎn)生長期損害，從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。研究發(fā)現(xiàn)，攝食過盛造成的能量代謝紊亂與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，攝食抑制因子1（Nesfatin-1）是一種由核連蛋白 2（nucleobindin 2，NUCB2）水解產(chǎn)生的攝食抑制因子，而最近研究表明，其還具有抗高血糖的作用［3］。饑餓素（Ghrelin）作為生長激素釋放肽不僅可通過激活機(jī)體下丘腦神經(jīng)回路來刺激食物的攝取，其缺失還可降低血糖并促使胰島素（insulin，INS）分泌［4］。Nesfatin-1與Ghrelin作為機(jī)體能量代謝的調(diào)控因子，可通過調(diào)控食物攝取能力來改變攝食量，從而調(diào)控機(jī)體的能量代謝，已得到多項研究證實，但關(guān)于中草藥在此方面的研究甚少［3-4］。糖肝煎是臨床中用于治療糖尿病等慢性代謝性疾病的常用藥，對T2DM的糖脂代謝具有良好的改善作用［5］，不斷深入了解其治療機(jī)制對T2DM的治療具有重要意義［1-2］。因此本研究自2021年12月至2022年2月以T2DM大鼠為對象，通過探究糖肝煎對T2DM大鼠攝食及血漿Nesfatin-1、Ghrelin水平的影響，為糖肝煎在T2DM中的治療機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物將由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司［許可證SCXK（遼）2020-0001］購買的50只SPF級SD大鼠（180±10）g與明暗交替12 h的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究中對于大鼠的處理符合動物實驗倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑糖肝煎中所含藥材由武漢市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供；鏈脲佐菌素（STZ，常州貝源鑫生物科技有限公司，批號BYX455A）；利格列汀（5 mg，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)上海海尼藥業(yè)有限公司，批號H20213378）；INS、Ghrelin試劑盒（E-EL-R2466c、EEL-R0842c，伊萊瑞特）；低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、三酰甘油（TG）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、總膽固醇（TC）（長春匯力生物技術(shù)有限公司，批號C047-a、C019-a、C046-a、C048-a）；NUCB2 試劑盒（MM-70231R2，酶免）；Nesfatin-1 ELISA試劑盒（無錫云萃生物科技有限公司YRX302227R）；Chemray240全自動生化分析儀（Rayto）；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices）。

2 方法

2.1 糖肝煎提取濃縮糖肝煎由茯苓、白芍、茵陳、當(dāng)歸、柴胡等中藥組成，其中白芍、茯苓、茵陳用水煎煮，其余打粉，混合成浸膏后0.9%氯化鈉溶液稀釋為含生藥量為0.28 g/mL及0.56 g/mL的懸濁液。

2.2 分組與T2DM模型構(gòu)建將50只所購SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成正常組（10只）、模型組（40只），構(gòu)建T2DM模型大鼠：模型組大鼠連續(xù)8周給予高脂飼料喂養(yǎng)后，禁食12 h，尾靜脈一次性注射STZ（0.15 g/kg，由檸檬酸緩沖鹽溶液溶解），正常組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，并注射檸檬酸鈉緩沖鹽溶液；1周后若大鼠空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L，且出現(xiàn)三多一少（多食、多尿、多飲、體質(zhì)量減輕）癥狀則造模成功［6］，成功后正常組大鼠繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼料，模型組大鼠飼喂高脂飼料，將模型組分為T2DM組、利格列汀組（50 mg/kg利格列汀）［7］、低劑量組（2.8 g/kg糖肝煎）、高劑量組（5.6 g/kg糖肝煎）［8］，10只/組；利格列汀組、低劑量組及高劑量組連續(xù)4周分別給予相應(yīng)藥物灌胃，正常組及T2DM組給予等量生理鹽水，1次/天，于實驗結(jié)束后觀察大鼠一般情況，并稱取大鼠體質(zhì)量，稱量大鼠實驗結(jié)束后12 h進(jìn)食量并量取實驗結(jié)束后12 h耗水量和尿量，計算各組大鼠的攝食量、攝水量、尿量。

2.3 大鼠一般指標(biāo)測定于造模結(jié)束1周后抽取所有大鼠3 mL的腹主動脈血，經(jīng)離心（3 000 r/min）10 min后檢測血清中FBG水平；實驗結(jié)束后再次抽取大鼠8 mL的腹主動脈血，其中3 mL經(jīng)Chemray240全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中FBG、LDL-C、HDL-C、TG及TC水平（n=10），剩余5 mL用于后續(xù)ELISA實驗及qRT-PCR實驗。

2.4 大鼠口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）待取血后所有大鼠給予葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，分別于15 min、0.5 h、1 h、2 h檢測大鼠各時間點的血糖水平，根據(jù)梯形公式計算OGTT曲線下區(qū)域面積（AUC）。

2.5 ELISA法檢測血清INS水平及血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平將2.2所得3 mL靜脈血樣本一部分靜置、離心（3 000 r/min）10 min后取上清液，使用ELISA檢測試劑盒測定血清INS水平，另一部分進(jìn)行枸櫞酸鈉抗凝，離心、取上清液，使用NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1 ELISA檢測試劑盒測定血漿中各指標(biāo)水平（n=10）。

2.6 qRT-PCR檢測血漿Nesfatin-1、GHRL表達(dá)水平按照RNA提取試劑盒實驗方法提取血漿樣本中總RNA，以其為模板，按照50 μL的反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)NCBI網(wǎng)址中Nesfatin-1、Ghrelin序列設(shè)計引物（表1），以95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，50次循環(huán)作為反應(yīng)程序進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，Nesfatin-1、Ghrelin 均以 GAPDH 為內(nèi)參，使用 2-ΔΔCt計算 Nesfatin-1、Ghrelin表達(dá)水平（重復(fù)5次）。

表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）引物

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法經(jīng)SPSS 20.0分析，采用Shapiro-Wilk test（S-W檢驗）判定數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，使用±s描述，多組間比較使用單因素方差分析，多組間多時點比較采用重復(fù)測量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況觀察正常組大鼠糞便正常，皮毛光澤順滑，行動靈活、精神狀態(tài)良好；T2DM組大鼠出現(xiàn)便溏，精神不振、皮毛發(fā)黃粗糙；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組大鼠上述癥狀存在不同程度改善。

3.2 糖肝煎對大鼠血清FBG、INS水平及OGTT曲線下區(qū)域面積（AUC）的影響相較于正常組，T2DM組大鼠灌胃前血清FBG水平顯著增加（P＜0.05），灌胃后血清FBG水平、OGTT AUC顯著增加，INS水平顯著降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組FBG水平、OGTT AUC顯著降低，INS水平顯著增加；相較于低劑量組，高劑量組血清FBG水平、OGTT AUC顯著降低，INS水平顯著增加（P＜0.05），見表2。

表2 糖肝煎對大鼠血清FBG、INS水平及OGTT AUC的影響/± s

表2 糖肝煎對大鼠血清FBG、INS水平及OGTT AUC的影響/± s

注：FBG為空腹血糖，INS為胰島素，OGTT為口服葡萄糖耐量試驗。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 FBG/（mmol/L）灌胃前5.02±0.49 16.73±3.41①16.57±3.86①17.29±4.16①17.03±3.50①100.17（時間） ，56.69（組間），20.07（交互）＜0.001（時間），＜0.001（組間），＜0.001（交互）灌胃后4.76±0.30 17.01±3.22①11.27±1.15①②7.04±0.48①②③6.30±0.71②③OGTT曲線下區(qū)域面積19.40±1.48 49.28±5.03①36.17±4.05①②23.80±2.73②③21.40±3.75②③121.27＜0.001 INS/（pmol/L）26.04±1.58 5.60±1.11①10.43±1.23①②14.75±1.29①②③19.81±1.23①②③376.84＜0.001

3.3 糖肝煎對大鼠攝食量、攝水量、尿量及體質(zhì)量的影響相較于正常組，T2DM組大鼠攝食量、攝水量、尿量顯著增加，體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組攝食量、攝水量、尿量顯著降低，體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組攝食量、攝水量、尿量顯著降低，體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），見表3。

表3 糖肝煎對大鼠攝食量、攝水量、尿量及體質(zhì)量的影響/± s

表3 糖肝煎對大鼠攝食量、攝水量、尿量及體質(zhì)量的影響/± s

注：①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10攝食量/（g/12h）20.59±2.53 50.70±4.22①38.97±3.22①②27.25±4.01①②③25.20±3.43①②③119.31＜0.001攝水量/（g/12h）34.03±2.75 240.92±28.34①201.20±10.12①②170.04±7.41①②③164.52±5.37①②③303.60＜0.001尿量/（mL/12h）17.40±1.52 204.33±15.03①173.99±7.22①②148.10±6.27①②③140.05±8.24①②③655.98＜0.001體質(zhì)量/g 327.10±5.66 269.50±12.02①293.40±0.71①②310.50±10.02①②③307.35±1.04①②③83.49＜0.001

3.4 糖肝煎對大鼠血脂水平的影響相較于正常組，T2DM組大鼠LDL-C、TG及TC水平顯著增加，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組LDL-C、TG及TC水平顯著降低，HDL-C水平顯著增加（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組LDL-C、TG及TC水平顯著降低，HDL-C水平顯著增加（P＜0.05），見表4。

表4 糖肝煎對大鼠血脂水平的影響/（mmol/L，± s）

表4 糖肝煎對大鼠血脂水平的影響/（mmol/L，± s）

注：LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 LDL-C 0.71±0.02 2.39±0.04①1.94±0.22①②1.60±0.04①②③1.13±0.14①②③304.14＜0.001 TG 0.78±0.08 2.14±0.11①1.71±0.12①②1.49±0.06①②③1.23±0.02①②③352.51＜0.001 TC 1.21±0.05 4.01±0.40①3.11±0.31①②2.14±0.10①②③1.73±0.09①②③226.82＜0.001 HDL-C 2.01±0.09 0.34±0.04①0.90±0.01①②1.27±0.12①②③1.73±0.04①②③852.23＜0.001

3.5 糖肝煎對大鼠血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平的影響相較于正常組，T2DM組大鼠血漿NUCB2、Nesfatin-1水平顯著降低，Ghrelin水平顯著增加（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組血漿NUCB2、Nesfatin-1水平顯著增加，Ghrelin水平顯著降低（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平顯著增加，Ghrelin水平顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 糖肝煎對大鼠血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平的影響/（μg/L，± s）

表5 糖肝煎對大鼠血漿NUCB2、Ghrelin、Nesfatin-1水平的影響/（μg/L，± s）

注：NUCB2為核連蛋白2，Nesfatin-1為攝食抑制因子1，Ghrelin為饑餓素。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 NUCB2 5.16±0.47 1.12±0.28①1.92±0.23①②2.44±0.31①②③3.18±0.34①②③209.12＜0.001 Ghrelin 23.62±2.79 135.73±9.83①91.35±6.97①②67.79±6.55①②③43.88±4.62①②③436.38＜0.001 Nesfatin-1 2.10±0.23 1.38±0.20①1.69±0.13①②1.98±0.15②③2.02±0.31②③19.35＜0.001

3.6 糖肝煎對大鼠血漿Nesfatin-1、Ghrelin mRNA水平的影響相較于正常組，T2DM組大鼠血漿Nesfatin-1表達(dá)水平顯著降低，Ghrelin水平表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；相較于T2DM組，利格列汀組、低劑量組、高劑量組Nesfatin-1表達(dá)水平顯著增加，Ghrelin表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；相較于低劑量組，高劑量組Nesfatin-1表達(dá)水平顯著增加，Ghrelin表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 糖肝煎對大鼠血漿Ghrelin、Nesfatin-1 mRNA表達(dá)水平的影響/± s

表6 糖肝煎對大鼠血漿Ghrelin、Nesfatin-1 mRNA表達(dá)水平的影響/± s

注：Ghrelin為饑餓素，Nesfatin-1為攝食抑制因子1。①相較于正常組，P＜0.05。②相較于T2DM組，P＜0.05。③相較于低劑量組，P＜0.05。

組別正常組T2DM組低劑量組高劑量組利格列汀組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 Ghrelin mRNA 1.00±0.03 1.68±0.14①1.40±0.12①②1.10±0.10②③1.06±0.07②③82.45＜0.001 Nesfatin-1 mRNA 1.01±0.06 0.38±0.10①0.60±0.07①②0.89±0.08①②③0.92±0.06②③120.61＜0.001

4 討論

T2DM作為一種由INS分泌受損或IR引起的慢性代謝性疾病，會導(dǎo)致體內(nèi)脂肪、葡萄糖、蛋白質(zhì)的代謝紊亂，而長期處于高血糖水平，會造成血管、心臟、腎臟、眼等器官或組織損傷［9-10］。隨著人類生活方式及飲食的改變，由于高熱量食物的大量攝入及運(yùn)動的缺乏，導(dǎo)致T2DM的發(fā)病率逐漸增加［11］，因此，深入了解其治療機(jī)制意義重大。

在中醫(yī)理論中，T2DM屬消渴范疇，其發(fā)病特點為：燥熱為標(biāo)、陰虛為本，氣虛、陰虛、陰陽均衰、臟腑虛損［5］。糖肝煎是一種由茯苓、白芍、茵陳、當(dāng)歸、柴胡等中草藥組成的中藥方劑，白芍及當(dāng)歸可活血養(yǎng)血，茯苓可健脾，柴胡可疏肝解郁，茵陳可清熱利濕，合用具有清熱利濕、疏肝健脾的功效［12-13］。糖肝煎已在臨床上用于治療慢性代謝性疾病，其對中醫(yī)辨證為肝郁脾虛、濕熱蘊(yùn)結(jié)的T2DM合并脂肪肝患者具有較好的療效［13］。有研究發(fā)現(xiàn)其可通過促進(jìn)胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）/磷脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路激活來改善T2DM合并非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠糖脂代謝［14］。糖肝煎可通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)來改善T2DM大鼠NAFLD［12］。本研究造模后，模型大鼠FBG≥11.1 mmol/L，且出現(xiàn)三多一少癥狀表明造模成功，且低、高劑量糖肝煎可顯著降低T2DM大鼠FBG水平、OGTT AUC、攝食量、攝水量、尿量、LDL-C、TG及TC水平，增加INS水平、體質(zhì)量、HDL-C水平，并且隨糖肝煎劑量的增加效果更加顯著，該結(jié)果表明糖肝煎能夠有效調(diào)節(jié)T2DM大鼠糖脂代謝及改善三多一少癥狀。

Nesfatin-1是由NUCB2水解所產(chǎn)生的具有82個氨基酸的肽，表達(dá)于下丘腦的特定區(qū)域，而分泌到胰島β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等外周組織細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)攝食、葡萄糖代謝等功能［15］。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病患者血清中Nesfatin-1水平顯著降低，有作為預(yù)測妊娠期糖尿病生物標(biāo)志物的潛能［16］。在糖尿病患者中Nesfatin-1循環(huán)水平顯著降低，而注射Nesfatin-1可抑制肝臟葡萄糖形成，促進(jìn)葡萄糖攝取。由于Nesfatin-1具有抗高血糖及抑制食欲的作用，可有效促進(jìn)糖尿病及肥胖的治療［17］。Ghrelin作為一種促食欲激素，可被存在于下丘腦、胰島、垂體等組織中的生長激素促分泌素受體-1a（growth hormone secretagogue receptor，GHSR-1a）所識別，通過相互作用來刺激機(jī)體攝入食物［18］。Ghrelin與糖尿病等代謝疾病有關(guān)，其在糖尿病大鼠血漿中水平高于正常大鼠［18-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 大鼠血漿 NUCB2、Nesfatin-1水平顯著降低，Ghrelin水平顯著增加，與前人研究結(jié)果相似［17，20］，而低、高劑量糖肝煎可顯著增加T2DM大鼠血漿NUCB2、Nesfatin-1水平，降低Ghrelin水平，并且隨糖肝煎劑量的增加效果更加顯著，該結(jié)果表明，糖肝煎抑制T2DM大鼠攝食及調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用可能與其促進(jìn)Nesfatin-1表達(dá)及降低Ghrelin表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，糖肝煎可抑制T2DM大鼠攝食，增加其體質(zhì)量及血漿Nesfatin-1水平，降低Ghrelin水平。本研究對糖肝煎在T2DM中詳細(xì)作用機(jī)制的探究具有重要意義，但由于樣本受限，目前未對其詳細(xì)的通路機(jī)制進(jìn)行探究，這將成為接下來的研究重點。