胰高血糖素樣肽1受體激動劑對阿霉素誘導大鼠心肌纖維化的作用

程曉洪，李家富，宋昕雨，陳俞瑾，王歡

心力衰竭（heart failure，HF）是各種心血管疾病的晚期階段，其病死率、患病率逐年升高，嚴重威脅人類健康［1］。研究表明，心室重構引起的心肌結構和功能的改變是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的核心機制［2］，其中心肌纖維化是心肌重塑過程中心功能由代償轉變?yōu)槭Т鷥數(shù)闹匾h(huán)節(jié)［3］，因此，深入研究心肌纖維化機制，尋找治療心力衰竭的新靶點對保護心功能至關重要。胰高血糖素樣肽1（GLP-1）是結腸和小腸遠端的L細胞分泌的胃腸激素，通過刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌和胃排空，從而降低餐后血糖［4］。GLP-1受體激動劑（GLP-1RA）是GLP-1的同源性近似物，不會被體內的二肽酰肽酶-4（DDP-4）快速降解，彌補了GLP-1的不足。除降糖效應，GLP-1還因能降低糖尿病患者的心血管事件風險而被廣泛關注［5-7］，且這種心血管的獲益，在非糖尿病患者中也得到了證實［8］。度拉糖肽是美國禮來公司研發(fā)的新型長效GLP-1受體激動劑，其安全性和有效性已在隨機對照研究中得到證實［9］。

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種高效的廣譜抗癌藥物，但是其可引起時間及劑量依賴性的心臟毒性，限制其在臨床上的應用［10］。報道表明DOX致心力衰竭機制與其氧化應激損傷、心肌細胞代謝障礙、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂和活化線粒體凋亡途徑等有關［11］，因此DOX致大鼠心力衰竭模型已經成為基礎研究中方便可行的常用模型。本研究于2021年1—8月通過比較此模型從而探究GLP-1R激動劑改善阿霉素誘導心肌纖維化大鼠心室結構重構的保護作用及機制，且目前國內鮮見此類報道。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑健康雄性SD大鼠40只，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（川）2018-0017，實驗中充分保證動物福利、給予動物人道關懷，動物處置也符合倫理學原則。鹽酸阿霉素（貨號SD9280）、凝膠制備試劑盒（貨號AS1012）、RIPA總蛋白裂解液（貨號AS1004）、BCA蛋白質濃度測定試劑盒（貨號AS1086）、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（貨號 AS1086）、Exendin（9-39）（貨號 HY-P0264）均購自ASPEN公司，General cGMP ELISA Kit（貨號ELK8144）、Rat GLP1 ELISA Kit（貨號ELK8502）、Rat INS ELISA Kit（貨號ELK2370）、Rat NT-ProBNP ELISA Kit（貨號ELK8211）購自ELK Biotechnology公司，葡萄糖（Glu）測試盒說明書（貨號F006-1-1）購自南京建成公司，GLP-1（貨號D381211）購自vetter pharmafertigung Gmbh&co.KG公司。

1.2 主要儀器DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠，TGL-16型冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，DR-200BS型酶標儀購自Diatek公司，GNP9160型恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設備有限公司，HH-W-600型水浴鍋購自金壇市江南儀器廠，JT-12K型脫水機、JB-P5型包埋機購自武漢俊杰電子有限公司，RM2016型病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司。

1.3 模型建立40只 SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組（10只）和心肌纖維化模型組（30只），造模組用阿霉素3 mg/kg，每周3次，連續(xù)2周，累積18 mg/kg腹腔注射，4周后超聲觀察心臟結構與功能評估是否造模成功。成模后將心肌纖維化組采用隨機數(shù)字表法分為阿霉素組（DOX組）、阿霉素+度拉糖肽組（GLP-1RA組）、阿霉素+度拉糖肽+Exendin（9-39）組（EX-9-39組），每組10只。隨后GLP-1RA組予以度拉糖肽1 mg·kg-1·w-1皮下注射，連續(xù) 4周， EX-9-39組予以度拉糖肽 1 mg·kg-1·w-1皮下注射及 Ex9-39 200 μg·kg-1·d-1腹腔注射，連續(xù)4周，N組及DOX組予以等體積生理鹽水皮下注射。記錄末次體質量，予以5%水合氯醛 300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，完善心臟超聲后處死大鼠，取標本檢測。

1.4 主要方法

1.4.1 心臟超聲 將大鼠稱重后用5%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，待大鼠進入麻醉狀態(tài)后左側胸前區(qū)備皮，取仰臥位，固定在鼠板上，由心臟超聲科?？漆t(yī)師利用超聲診斷系統(tǒng)，選取胸骨旁左室乳頭肌短軸切面采集左室收縮末期內徑（LVDs），左室舒張末期內徑（LVDd），左心室縮短分數(shù)（FS）和左室射血分數(shù)（LVEF）。

1.4.2 組織標本檢測 將取出的新鮮心肌組織固定于4%多聚甲醛中，脫水后包埋，修整好后制作成4 μm石蠟切片。HE染色觀察心臟組織形態(tài)學變化，Masson染色觀察心肌纖維化程度并計算心肌膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。

1.4.3 蛋白質印跡法（Western blotting）測定蛋白水平 首先提取組織總蛋白；然后使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，用SDS-PAGE分離蛋白后轉PVDF膜；根據(jù)抗體說明書加入稀釋后的一抗，4 ℃過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入稀釋好的二抗，室溫孵育，搖床上洗4次，滴加新鮮配制的ECL混合溶液（A∶B=1∶1），暗室中曝光；將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 取血清后用離心機3 000 r/min離心15 min，收集上清液于1.5 mL EP管中，存于-80 ℃超低溫冰箱，按照Elisa試劑盒檢測NT-proBNP、GLP-1、血糖、胰島素等指標，心肌組織取材后，速凍于-80 ℃保存，按照Elisa試劑盒檢測cGMP。

1.5 統(tǒng)計學方法所有資料使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，所得到的數(shù)值以±s表示，多樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GLP-1R激動劑對血糖及胰島素的影響各組間血糖及胰島素的濃度比較，均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 胰高血糖素樣肽1受體（GLP-1R）激動劑對大鼠血糖及胰島素變化/± s

表1 胰高血糖素樣肽1受體（GLP-1R）激動劑對大鼠血糖及胰島素變化/± s

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10血糖/（mmol/L）5.04±0.39 4.84±0.33 4.78±0.61 4.67±0.55 0.30 0.823胰島素/（pmol/L）1 436.18±30.06 1 483.91±68.97 1 503.54±42.26 511.71±44.60 1.46 0.297

2.2 GLP-1R激動劑對心肌纖維化的影響

2.2.1 HE染色 N組心肌纖維染色均勻，排列整齊，走行正常，輪廓清晰，細胞核位于細胞中央，細胞間隙正常；DOX組心肌纖維著色不均，排列紊亂，輪廓不清，細胞核散亂分布；GLP-1RA組心肌排列較整齊，輪廓大致清晰；EX9-39組細胞排列、輪廓清晰程度介于DOX組與GLP-1RA組之間。見圖1。

2.2.2 Masson染色 N組見極少膠原纖維沉積；DOX組可見大量膠原纖維沉積；GLP-1RA組膠原沉積較DOX組少；EX9-39組膠原沉積介于DOX組與DOX+GLP-1RA組之間。進一步行CVF分析，與N組［（0.3±0.05%）］相比，DOX組［（5.88±0.13）%］CVF明顯升高（P＜0.05）；給予度拉糖肽治療后，GLP-1RA組［（0.83±0.14）%］CVF下降（P＜0.05）；予以GLP-1RA拮抗劑后，exendin9-39組CVF升高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 Western blotting測定大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB、PKG、CaMKⅡ、p-RyR蛋白水平Western blotting結果顯示與N組相比，DOX組 GLP-1R、PKG、SERCA2a、p-PLB 水平降低（P＜0.05），PLB、p-RYR、CaMKⅡ水平升高（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組GLP-1R、PKG、SERCA2a、p-PLB水平升高（P＜0.05），PLB、p-RYR、CaMKⅡ水平降低（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組GLP-IR、PKG、SERCA2a、p-PLB水平部分降低（P＜0.05），PLB、p-RYR、CaMKⅡ水平升高（P＜0.05），見表2；圖3。

圖3 大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB、PKG、CaMKⅡ、p-RyR蛋白表達

表2 各組大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB結果/± s

表2 各組大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB結果/± s

注：GLP-1R為胰高血糖素樣肽-1受體，SERCA2a為肌質網鈣泵，PLB為受磷蛋白，p-PLB為磷酸化受磷蛋白，PKG為蛋白激酶G，CaMKⅡ為鈣調蛋白激酶Ⅱ，p-RyR為磷酸化蘭尼堿受體。①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 GLP-1R 0.61±0.05 0.29±0.01①0.49±0.01②0.10±0.01③229.73＜0.001 SERCA2 ATPase 0.72±0.06 0.06±0.01①0.41±0.04②0.20±0.16③193.81＜0.001 P-PLB 0.42±0.05 0.06±0.01①0.32±0.08②0.19±0.02③31.58＜0.001 PLB 0.10±0.01 0.66±0.04①0.17±0.03②0.37±0.04③187.08＜0.001 PKG 0.70±0.07 0.10±0.02①0.40±0.01②0.20±0.02③162.36＜0.001 p-CaMKⅡ0.05±0.01 0.60±0.04①0.16±0.05②0.29±0.01③161.99＜0.001 p-RyR2 0.08±0.01 0.03±0.02①0.01±0.00②0.19±0.01③184.52＜0.001

2.4 Elisa檢測cGMP、GLP-1水平Elisa結果顯示，與N組相比，DOX組cGMP、GLP-1有所下降（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組cGMP、GLP-1升高（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組cGMP、GLP-1部分下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠環(huán)單磷酸鳥苷（cGMP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平/± s

表3 各組大鼠環(huán)單磷酸鳥苷（cGMP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平/± s

注：①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 cGMP 3 011.70±279.34 1 281.95±110.86①2 247.14±231.04②1 721.72±109.05③42.69＜0.001 GLP-1 357.64±50.89 194.67±24.58①691.97±77.99②269.18±37.64③54.03＜0.001

2.5 對心功能的影響心臟超聲結果顯示，與N組相比，DOX組LVDs、LVDd、NT-proBNP明顯上升，LVEF、FS降低（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組LVDs、LVDd、NT-proBNP降低 ，LVEF、FS升高（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組LVDs、LVDd、NT-proBNP上升，LVEF、FS值降低（P＜0.05）。見表4；圖4。

表4 各組大鼠心臟左室收縮末期內徑（LVDs），左室舒張末期內徑（LVDd）、左室射血分數(shù)（LVEF）及N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）比較/± s

表4 各組大鼠心臟左室收縮末期內徑（LVDs），左室舒張末期內徑（LVDd）、左室射血分數(shù)（LVEF）及N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）比較/± s

注：①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 LVDd/mm 3.82±0.29 6.00±0.52①4.60±0.21②5.53±0.12③27.77＜0.001 LVDs/mm 2.45±0.34 4.00±0.34①2.99±0.06②3.55±0.66③22.76＜0.001 LVEF 84.33±4.04 68.33±1.53①81.00±3.61②74.00±2.00③17.26 0.001 NT-proBNP/（ng/L）0.13±0.03 0.99±0.07①0.34±0.06②0.60±0.05③144.44＜0.001

圖4 各組大鼠心臟超聲圖：A為N組；B為DOX組；C為GLP-1RA組；D為EX9-39組

2.6 GLP-IR對各組心質量/體質量（HW/BW）的影響結果顯示，與N組相比，DOX組HW/BW明顯上升（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組HW/BW降低（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組HW/BW有所上升（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠心質量（BW）、體質量（HW）、心質量/體質量（HW/BW）比較/± s

表5 各組大鼠心質量（BW）、體質量（HW）、心質量/體質量（HW/BW）比較/± s

注：①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 BW/g 433.00±29.31 295.33±44.66 348.67±20.84 326.33±20.26 11.29 0.003 HW/mg 1 091.67±242.41 1 172.67±101.30 1 122.33±93.04 1 222.33±98.56 0.45 0.722 HW/BW/（mg/g）2.50±0.40 4.00±0.34①3.22±0.11②3.74±0.68③17.69 0.001

3 討論

本研究采用超聲評估心臟結構及功能，結果表明，度拉糖肽治療后可使大鼠心室腔縮小、心功能改善、NT-proBNP有所下降，Exendin9-39作為一級競爭性GLP-1受體拮抗劑，部分抑制了度拉糖肽的保護作用，這表明GLP-1R激動劑可在一定程度上通過改善射血功能、心臟收縮及舒張功能參與心室重構，結合度拉糖肽治療后可上GLP-1及GLP-1R，而同時予以度拉糖肽及Exendin9-39則降低了GLP-1、GLP-1R的表達，這更加進一步表明GLP-1R激動劑可能通過GLP-1R參與了心室重構的過程。

研究表明，正常情況下，GLP-1刺激胰島素分泌是依賴血糖濃度的，隨著血糖濃度降低，GLP-1促胰島素分泌作用降低，當該作用降低到一定閾值時GLP-1不顯示活性［12］，而本實驗中，各組間血糖及胰島素未見明顯改變，這也表明GLP-1R的降糖效應具有葡萄糖依賴性，符合既往研究規(guī)律。

心肌重構是指心臟為適應各種負荷增加，在結構及功能上發(fā)生適應性代償改變，長期持續(xù)高負荷最終失代償引起心力衰竭，表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌纖維化、間質細胞增生等改變［13］。生理情況下，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維構成心肌膠原網絡支架，在保護心肌細胞、維持心臟幾何構型和僵硬度等方面起著十分重要的作用［14］，心肌纖維化是指Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維沉積，導致心室壁僵硬度增加從而影響心臟功能。本研究中，與正常組相比，阿霉素組心質量/體質量比明顯升高，Masson染色顯示阿霉素組大量膠原纖維沉積，CVF高，心肌纖維化嚴重，予以度拉糖肽治療后可改善心肌細胞肥厚以及心肌纖維化程度，這表明GLP-1R激動劑一定程度上能改善心室重構，而同時予以度拉糖肽和Exendin9-39則部分拮抗了度拉糖肽作用，這更加說明了GLP-1R激動劑至少部分是通過GLP-1R發(fā)揮作用的。

鈣循環(huán)紊亂是心衰后的主要特征，可同時降低心臟收縮及舒張功能，同樣影響心臟重構，增加心律失常的風險［15］。心衰時興奮收縮偶聯(lián)受損，特別是SERCA2a表達降低，導致鈣離子增高，肌質網鈣容量降低，同時CaMKⅡ磷酸化增加，鈣滲漏的增加［16］，上述變化綜合使鈣瞬變幅值降低，降低心肌收縮力。Western blotting結果顯示度拉糖肽可上調PKG、SERCA2a、p-PLB水平，而降低PLB、p-RYR、p-CaMKⅡ，結合Elisa結果，度拉糖肽可使cGMP升高，可以推測GLP-1R激動劑可能通過增加SERCA2a表達，增加PLB的磷酸化而減少PLB對SERCA2a功能的抑制作用，同時減少磷酸化的CaMKⅡ蛋白表達，參與細胞鈣循環(huán)的調節(jié)。且既往研究表明，GLP-1R激動劑可在大鼠肺動脈平滑肌細胞中可激cGMPPKG［17］，提示 cGMP-PKG 是 GLP-1R 的下游信號通路，而PKG信號通路通過調節(jié)SERCA2a表達與鈣循環(huán)密切相關，同時，PKG信號通路通過降低CaMKⅡ的磷酸化水平，影響下游的調節(jié)位點，降低RYR磷酸化，結合本研究各組PKG、cGMP變化，我們可以合理推測GLP-1R激動劑可參與鈣循環(huán)的調節(jié)可能與cGMP-PKG信號通路有關。

綜上所述，GLP-1R激動劑在不影響血糖情況下，可以改善心肌纖維化、緩解心肌肥厚，從而逆轉心室重構，其保護作用可能與cGMP-PKG通路有關，這為心衰的治療提供了新思路。