雙特異性抗體在抗人類免疫缺陷病毒方面的研究進(jìn)展

劉廣文，秦嘉萍，顧匯權(quán)，劉嬙

艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是威脅人類健康的重大傳染病之一。經(jīng)典的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療（antiretroviral therapy，ART）［1］能夠極好地抑制感染，但它們無法清除人類免疫缺陷病毒（HIV），且存在耐藥性。單克隆抗體（mAb）具有高度特異性，是預(yù)防感染性疾病最有效的方法，由于其廣度的有限性，需使用mAb組合療法［2-4］。雙特異性抗體是在mAb的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行有目的的加工而獲得的工程抗體，具有非常強(qiáng)的抗HIV活性［5-6］。本文綜述了近期國內(nèi)外文獻(xiàn)中有關(guān)靶向不同抗原表位HIV雙特異性抗體研究的報道，以期為更深入的研究提供參考。

1 雙特異性抗體的分子結(jié)構(gòu)

雙特異性抗體可大致劃分為兩種分子形式：含有Fc區(qū)的IgG類和不含F(xiàn)c區(qū)的非IgG類［7］。IgG類雙特異性抗體，有兩個Fab區(qū)和一個Fc區(qū)，相對分子質(zhì)量較大（＞100 000 kD），具有較長的半衰期［8］，穩(wěn)定性更高。非IgG類的雙特異性抗體，由兩個抗體的VL區(qū)和VH區(qū)組成，沒有Fc區(qū)，有些也會由Fab片段組成，分子量（30～50 kD）小于整個IgG（150 kD），有助于穿透組織。但由于腎臟清除速率快，導(dǎo)致半衰期短，需要持續(xù)輸送用于延長作用時間［9-10］。

在抗病毒免疫治療中，與傳統(tǒng)單抗的組合治療不同，雙特異性抗體能夠同時靶向兩個甚至多個靶點(diǎn)，治療效果更好。目前雙特異性抗體分子結(jié)構(gòu)正在不斷創(chuàng)新，越來越多的新結(jié)構(gòu)被設(shè)計出來，為多價抗體的設(shè)計提供了基礎(chǔ)的技術(shù)平臺。

2 抗HIV雙特異性抗體

雙特異性抗體主要基于病毒和宿主細(xì)胞上特定的抗原表位，通過結(jié)構(gòu)修飾而得到的［11-13］，雙特異性抗體在抗癌及抗炎領(lǐng)域已取得了巨大進(jìn)步，如今已開始探索將其應(yīng)用到抗HIV領(lǐng)域［14］，針對不同靶向的雙特異性抗體如表1所示。

表1 處于研發(fā)階段的抗HIV雙特異性抗體

2.1 靶向HIV抗原表位的BsAb該種類型的抗體主要靶向HIV上的抗原表位，在源頭上抑制病毒的功能［15-16］?；诖?，Davis-Gardner等［17］報道了基于HIV包膜蛋白（Env）上V2和V3糖基化位點(diǎn)設(shè)計的雙特異性抗體，具體來說，在一個抗體臂上帶有單鏈（scFv）形式的CAP256.VRC26.25 V2糖基化位點(diǎn)抗體，在另一個抗體臂上帶有完整的Fa形式的10-1074 V3糖基化位點(diǎn)抗體，另外在Fc區(qū)域引入了KIH結(jié)構(gòu)，得到了BISC-1A和BICM-1A， BISC-1A是由CAP256.VRC26.25單鏈和10-1074組成的雙特異性抗體，而BICM-1A是由CAP256.VRC26.25和10-1074完整單抗組成cross-Mab結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體。這兩種組合都能更有效地中和分離株，可能是因為它們同時與Env的頂點(diǎn)和V3-聚糖表位結(jié)合顯著增加雙特異性抗體的效力。數(shù)據(jù)顯示，BISC-1A比BICM-1A具有更好的親和力，推測與完整的Fab結(jié)構(gòu)域相比，CAP256.VRC26.25的單鏈抗體Fc形式可能更好地將雙特異性抗體的Fc結(jié)構(gòu)域定位在V3糖基化位點(diǎn)附近。

Bournazos等［18］開發(fā)了一種新的抗HIV雙特異性抗體，這種抗體的IgG區(qū)改造為IgG3亞型（IgG3C），同時保留IgG1 Fc的功能特性［19］。體外實(shí)驗表明，IgG區(qū)結(jié)構(gòu)與抗體的中和能力有著密切的聯(lián)系，未經(jīng)過IgG區(qū)改造的雙特異性抗體中和能力相比單抗未有明顯提升，表明IgG1亞型的雙特異性抗體與傳統(tǒng)的單抗相比沒有優(yōu)勢。推測可能由于兩個Fab臂缺乏足夠的靈活性，無法實(shí)現(xiàn)Env三聚體的異二價相互作用。而將IgG區(qū)改造為IgG3C的雙特異性抗體，由于兩個Fab臂的長度增加，其韌性和靈活度也增加了，同時加強(qiáng)了Env三聚體的異二價相互作用，這種方法對整體IgG結(jié)構(gòu)的改變最小，也顯著增強(qiáng)中和廣度和效力。在感染 HIV-1 的人源化小鼠中該抗體顯示出比親本更強(qiáng)的中和活性，異二價BsAb能夠增強(qiáng)與Env的相互作用，從而通過FcgR介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)病毒顆粒和感染細(xì)胞的清除。

有研究者使用CrossMab 技術(shù)構(gòu)建出四種雙特異性IgG［20］，每個臂都可以靶向不同表位，這些雙特異性IgG可以中和94%至97%的病毒，表現(xiàn)出比親本抗體更高的中和廣度和效力，其中VRC07 x PG9-16的廣度優(yōu)于任何一種單獨(dú)抗體，中和了病毒中的97%，平均IC50為0.055 mg/L。這種雙特異性IgG在體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)方面也與其親本抗體組合相似。

2.2 同時靶向HIV與宿主抗原表位的BsAb此類抗體能夠同時靶向病毒的表位與免疫細(xì)胞的表位，有利于免疫細(xì)胞對病毒進(jìn)行定位，從而達(dá)到抗HIV的目的［15-16］。Strokappe等［21］參考駱駝或其他駱駝科的純重鏈抗體（VHH）開發(fā)出新一代雙特異性抗體。單價VHH抗體由于體積小和超過平均長度的CDR3可以結(jié)合到隱藏的CD4結(jié)合位點(diǎn)，且通常在高溫下穩(wěn)定?；谶@些特性，為了進(jìn)一步增加廣度和效力，構(gòu)建了雙特異性VHH，包含J3或3E3以及結(jié)合獨(dú)立表位的VHH。實(shí)驗表明N端帶有CD4bs VHH的雙特異性VHH中和效果優(yōu)于C端帶有CD4bs VHH的雙特異性VHH。使用含有2E7或11F1F構(gòu)建的雙特異性VHH，對HIV C分支病毒96ZM651.02和ZM214表現(xiàn)出了更高的中和效力。其中J3-11F1F和3E3-11F1F對ZM214的效力增加了200多倍，而單體11F1F在濃度低于1 μmol/L時無法中和該病毒。對此的合理解釋可能是J3或3E3的結(jié)合引起構(gòu)象變化，使11F1F結(jié)合或增強(qiáng)11F1F結(jié)合，從而確認(rèn)HR1中間構(gòu)象上可能存在一個表位。

值得注意，基于結(jié)構(gòu)修飾的BsAb雖然提高了其抗病毒的效能，但偏離正?？贵w結(jié)構(gòu)，不利于藥代動力學(xué)和潛在免疫原性的研究，同時生產(chǎn)純化這種抗體也是一種挑戰(zhàn)［13，22-23］。Huang等［24］通過 Cross-Mab技術(shù)構(gòu)建出具有正常結(jié)構(gòu)的10E8V2.0/iMab和10E8V1.1/P140兩種BsAb，其中10E8V2.0/iMab能中和118種HIV-1假型病毒，且能抑制HIV-1感染小鼠的病毒載量，提前給藥能提供完全保護(hù)。Moshoette等［25］設(shè)計的iMab-CAP256雙特異性抗體可能與10E08-iMab在中和廣度和效力上互補(bǔ)，10E08-iMab和iMab-CAP256聯(lián)合使用，可能會有更好的中和效果。無獨(dú)有偶，在人源小鼠中，Wu等［26］設(shè)計的BiIASG雙特異性抗體不僅表現(xiàn)出比親本分子更強(qiáng)的中和效力，且在HIV攻擊之前注射BiIA-SG即可獲得無菌保護(hù)。Niu等［27］在中華獼猴的體內(nèi)實(shí)驗表明，提前注射BiIA-SG可以防止中華獼猴感染SHIVSF162P3CN病毒［28］，而在病毒激發(fā)后的第1天或第3天，單次注射BiIA-SG可顯著降低病毒血癥峰值，接受BiIA-SG治療的中華獼猴延遲疾病進(jìn)展數(shù)年。相比之下，未經(jīng)治療的中華獼猴在2年內(nèi)發(fā)展為SHIV。通過抗CD8b抗體耗竭實(shí)驗確定，BiIA-SG誘導(dǎo)與CD8+T細(xì)胞長期保護(hù)作用相關(guān)［29］，該發(fā)現(xiàn)提供了雙特異性抗體治療誘導(dǎo)非人靈長類中T細(xì)胞免疫的概念證明，這保證了BiIA-SG用于HIV-1預(yù)防和免疫治療的臨床開發(fā)。

Seber Kasinger等［30］描述了一個基于植物的瞬時表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的雙特異性抗體VRC01Fab-Avaren，由靶向CD4結(jié)合位點(diǎn)的mAb VRC01的抗原結(jié)合片段（Fab）和靶向gp120的抗病毒凝集素（Avaren）組成的新型雙特異性抗體。有趣的是，VRC01Fab-Avaren以煙草花葉病毒為載體在煙草中表達(dá)。初步試驗表明，VRC01AB-Avaren顯示出比二價母體分子VRC01-IgG和Avaren-Fc更強(qiáng)的中和作用，IC50值范圍為48-310 pM。這些結(jié)果支持了基于植物的瞬時過表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的雙特異性抗體，與傳統(tǒng)的基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法相比，植物表達(dá)系統(tǒng)提供了更高的生產(chǎn)速度、可擴(kuò)展性和安全性［31-32］，使其成為藥物蛋白生產(chǎn)的一個有吸引力的選擇，為開發(fā)更有效的雙特異性和三特異性抑制劑提供了一個更好的平臺。鄭欽文等［33］也報道了一種新型單基因編碼的串聯(lián)雙特異性抗體iMab-PGT151，由靶向CD4的iMab抗體和靶向gp120和gp41交界面的PGT151抗體組成。該抗體由單一基因編碼，保證了產(chǎn)物的均一性，生產(chǎn)和純化更加方便高效。

2.3 靶向宿主細(xì)胞抗原表位的BsAb此類抗體靶向宿主細(xì)胞的抗原表位，招募免疫細(xì)胞對其清除［15-16］。Sung等［34］設(shè)計了一種可以招募效應(yīng)T細(xì)胞的雙特異性抗體（HIV×CD3 DART），該雙特異性抗體一臂可以和受感染的宿主細(xì)胞抗原表位相連，另一臂是單價CD3抗體可以和效應(yīng)T細(xì)胞結(jié)合。HIV×CD3 DART可以錨定受感染并表達(dá)Env的細(xì)胞，重定向效應(yīng)T細(xì)胞特異性殺滅這些細(xì)胞。但當(dāng)HIV患者使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療時，在沒有病毒感染的靶細(xì)胞的情況下，未觀察到T細(xì)胞活化，可能由于HIV×CD3 DART只能作用于感染并表達(dá)Env的靶細(xì)胞。Pollara等［35］使用人類臍帶血作為新生兒免疫系統(tǒng)的模型，以此來評估HIV×CD3 DART分子招募和重定向效應(yīng)T細(xì)胞的能力，從臍帶血中分離的T細(xì)胞相較于成人外周血分離的細(xì)胞，其殺傷力有所降低，這是由于缺乏記憶和效應(yīng)CD8 T細(xì)胞。當(dāng)它們被雙特異性DART分子重定向時，它們的溶細(xì)胞作用可以達(dá)到最強(qiáng)［35］。Dashti等［36］對感染SHIV.C.CH505.375H.dCT的恒河猴分別進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和HIVxCD3 DART分子的混合物治療，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組和對照組在使用AZD5582+DART分子治療前后CD4+T細(xì)胞中總vDNA的水平穩(wěn)定，研究發(fā)現(xiàn)在沒有潛伏期逆轉(zhuǎn)的情況下，HIVxCD3 DART分子不能在體內(nèi)清除感染細(xì)胞，而潛伏期逆轉(zhuǎn)是誘導(dǎo)Env表達(dá)和允許DART分子識別的必要條件。

Ramadoss等［31］以增強(qiáng)針對HIV感染細(xì)胞的自然殺傷（NK）細(xì)胞ADCC為目的設(shè)計的雙特異性抗體，該抗體由針對HIV-Env保守gp41殘基的單抗，和針對NK細(xì)胞上激活受體CD16的高親和力scFv組成，通過CD16將NK細(xì)胞連接到HIV感染的靶點(diǎn)，CD16是NK細(xì)胞激活的有效觸發(fā)器［37］，從而迫使NK細(xì)胞與這些細(xì)胞接觸并被激活。實(shí)驗表明，與相應(yīng)單克隆抗體相比，bsAbs對 gp41和CD16的親和力增加，由于bsAb能夠同時與NK細(xì)胞表面的兩個CD16受體結(jié)合，因此其親和力比單抗更高。此外，最近的研究表明［38］，HIV通過隱藏Env數(shù)量以及ADCC表位，以此阻礙ADCC抗體的識別，有研究者猜測，由于HIV Vpu和Nef對CD4的下調(diào)，降低了Env進(jìn)入CD4結(jié)合構(gòu)象的可能性［39-40］。為了克服感染細(xì)胞表面的CD4下調(diào)，研究者設(shè)計了CD4mc，其可以結(jié)合Env并誘導(dǎo)CD4結(jié)合構(gòu)象，能夠改善ADCC介導(dǎo)抗體與Env的結(jié)合，并使HIV感染細(xì)胞對ADCC敏感［41-443］。Li等［44］設(shè)計的雙特異性殺傷細(xì)胞接合器BiKEs，通過激活受體CD16A與自然殺傷（NK）細(xì)胞結(jié)合，將其引導(dǎo)至表達(dá)Env的細(xì)胞并消除。他們通過柔性連接體將靶向CD4的mD1.22融合到CD16A的抗體結(jié)構(gòu)域，由于其尺寸小且完全來源于人類，可以有效穿透組織找到隱藏的CD4表位，并通過CD16A引導(dǎo)NK細(xì)胞殺死HIV-1感染的細(xì)胞。實(shí)驗顯示，該BiKEs能夠結(jié)合所有HIV-1分離物的可能性，這些分離物體積小，完全來自人類，結(jié)合它們的高親和力和特異性，激活與CD16A的相互作用，導(dǎo)致HIV-1感染細(xì)胞的裂解，表明它們是有希望的候選療法，值得在動物模型和人類中進(jìn)一步評估，以治療HIV-1感染。

3 總結(jié)與展望

隨著基因工程抗體的快速發(fā)展，雙特異性抗體技術(shù)也日趨成熟，數(shù)十個BsAb已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，三個雙特異性抗體已批準(zhǔn)上市并應(yīng)用于腫瘤以及炎癥方面的治療，在病毒免疫治療方面也已起步。HIV雙特異性抗體通過改變結(jié)構(gòu)作用于病毒和宿主細(xì)胞的不同靶點(diǎn)，具有更好的效力、廣度，值得進(jìn)一步研究。但Env的多樣性、mAb的病毒逃逸突變和進(jìn)入淋巴結(jié)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的濾泡區(qū)等解剖部位（病毒可以在這些部位建立宿主）仍是基于BsAb治療的主要挑戰(zhàn)。在未來，抗HIV雙特異性抗體藥物開發(fā)非常重要，基于結(jié)構(gòu)設(shè)計的抗體將會越來越多，不論是其單獨(dú)使用或與其他抗HIV療法聯(lián)合，都必將成為有效的治療方案。