血清學(xué)結(jié)合基因檢測對1例Bx亞型的鑒定

孫 巖，王曉寧，劉 冰*，鐘 靖

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 輸血科，吉林 長春130021；2.邵陽市中心醫(yī)院 輸血科)

截至目前，共有376個人類紅細胞血型抗原被國際輸血協(xié)會(ISBT)認定，其中有345個抗原屬于總數(shù)為43種的紅細胞血型系統(tǒng)(www.isbtweb.org)。每個血型系統(tǒng)表現(xiàn)為一個單基因或相關(guān)區(qū)域兩個至三個緊密連鎖基因構(gòu)成的基因簇，在它們之間很少或幾乎沒有可識別的重組，因此每個血型系統(tǒng)都具有基因獨立性[1]。其中ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血中具有重要的意義，在輸血前常規(guī)檢測中會發(fā)現(xiàn)某些ABO亞型表現(xiàn)為正反定型不一致[2]。大部分的ABO亞型都是由于ABO基因不同的突變位點造成A、B轉(zhuǎn)移酶的活性變化，導(dǎo)致了H抗原轉(zhuǎn)化為A/B抗原的數(shù)量不同，形成了不同類型的ABO亞型，其中B血型亞型主要包括B3、Bx、Bm、Bel等，其B抗原表達逐漸減弱[3]。本實驗室在常規(guī)血型檢測中發(fā)現(xiàn)了1例疑似B亞型，并通過基因方法證實為Bx/Bweak表型，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 臨床資料

產(chǎn)婦肖某，女，31歲，孕1產(chǎn)1，無肝炎、傳染病史，無輸血及獻血史，無藥物過敏史。2021年10月順產(chǎn)足月寶寶送吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢測新生兒溶血3項試驗。對該孕婦進行血型鑒定時，使用微柱凝膠卡在室溫下進行正反定型，其結(jié)果為抗-A呈陰性，抗-B呈陰性，抗-D呈陽性4+凝集，陰性對照孔為陰性，正定型O、RhD+，反定型檢測患者血漿與標準試劑A細胞出現(xiàn)4+凝集，與標準試劑B細胞在室溫下不凝集，反定型為B型，正反定型不相符為疑難血型，遂利用血清學(xué)及基因檢測方法鑒定其血型。

1.2 試劑與儀器

血型檢測卡(西班牙DIANA，批號21014.02)；抗人球蛋白檢測卡(西班牙DIANA，批號21092.01)；抗A、抗B試劑(上海血液生物醫(yī)藥，批號20210504)；單克隆抗-AB、抗-H(Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH)；ABO血型反定型試劑盒(長春博迅，批號2021080101)；不規(guī)則抗體檢測試劑(長春博迅，批號20210903)；快速PCR擴增高保真DNA聚合酶(北京全式金)；Axyprep DNA試劑盒(批號21419KC3，康寧生命科學(xué)公司)；QIAquick膠體DNA回收試劑盒(德國Eppendorf)，以上所有試劑均在效期內(nèi)使用?？ㄊ椒x心機、孵育器(DIANA)；低速離心機(雷勃爾公司)；高速離心機(Eppendorf)；梯度PCR儀(Eppendorf)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Gel Doc XR+型)；電泳儀(DYY-8C，北京六一)；引物合成與基因測序均由上海生工生物工程公司完成。

1.3 方法

1.3.1血清學(xué)實驗 患者血型鑒定，采用卡式法、試管法分別在不同溫度條件下檢測，卡法按廠家說明書操作，紅細胞吸收放散試驗、試管法按文獻[3]中方法操作；患者血漿意外抗體篩查試驗采用卡法，按說明書操作。

1.3.2基因檢測 DNA提取按照試劑盒說明書提取血液標本基因組。參照美國NCBI GenBank中ABO基因編碼區(qū)堿基序列設(shè)計引物，對ABO血型外顯子2-7 PCR引物進行擴增，PCR反應(yīng)條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，延伸結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的片段進行膠回收實驗，以回收產(chǎn)物為模板繼續(xù)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測條帶清晰，進行測序，測序結(jié)果以ABO blood group alleles(IBST 001)v1.1 171023突變位點比對，DNAStar軟件進行序列比對，進行基因型和表型分析[4]。

2 結(jié)果

2.1 ABO 血型鑒定及H 抗原檢查

患者樣本在常規(guī)室溫下檢測正定型為O型，其紅細胞與微柱凝膠卡中單克隆抗-A、抗-B反應(yīng)均陰性，反定型為B型，但樣本紅細胞在4℃條件下與抗-B抗體反應(yīng)呈弱陽性凝集，結(jié)果見表1；患者樣本在不同溫度條件下試管法血型鑒定及其紅細胞與抗-AB反應(yīng)結(jié)果見表2。

表1 患者ABO血型鑒定(微柱凝膠法)

2.2 意外抗體檢測及紅細胞H物質(zhì)活性強度測定

樣本意外抗體篩檢試驗結(jié)果陰性，說明患者血清中不存在ABO系統(tǒng)以外的意外抗體。將患者紅細胞及O、B型紅細胞分別與抗-H反應(yīng)，結(jié)果凝集強度分別為3+、弱陽、陰性，與亞型H物質(zhì)含量測定標準相符[1]。

表2 患者ABO血型鑒定結(jié)果(試管法)

2.3 樣本紅細胞吸收放散實驗結(jié)果

采用人源抗-B(效價128)進行吸收放散試驗，最后一次洗滌液與健康成人O型、B型細胞均不反應(yīng)；樣本紅細胞放散液與O型細胞無凝集，但與健康成人B型細胞反應(yīng)，凝集強度3+，說明樣本紅細胞表面存在B抗原?？紤]為B亞型，進行基因檢測。

2.4 基因檢測結(jié)果

測序結(jié)果顯示，外顯子 2、3、4、5 無突變位點，外顯子 6、7 有突變，突變位點見表3。樣本序列與B101(ABO*B.01)基因序列比對，僅在6號外顯子278位發(fā)生C>T的突變，見圖1。經(jīng)檢索[5]，樣本序列與ABO*BW.12基因的序列完全一致，c.278C>T堿基突變導(dǎo)致93位脯氨酸變成亮氨酸，經(jīng)過分析該樣本基因型為ABO*BW.12，表型為Bx/Bweak亞型。

表3 樣本ABO血型基因突變結(jié)果

3 討論

血型之父Landsteiner于1900年首次描述了ABO血型，其至今仍是輸血醫(yī)學(xué)中最重要的血型系統(tǒng)。同RH血型的D抗原一樣，A和B抗原具有高度免疫原性，輸注ABO不相容的血液可導(dǎo)致嚴重的免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)可能導(dǎo)致急性血管內(nèi)溶血和腎功能衰竭等并發(fā)癥，并導(dǎo)致患者出現(xiàn)致命的后果[6]。除了常見的ABO表型外，還發(fā)現(xiàn)了許多在紅細胞上弱表達A或B抗原的ABO亞型，ABO亞型雖然罕見，但卻是導(dǎo)致ABO血型正反定型不符合的重要原因之一。抗原弱表達的ABO亞型是由ABO 基因座上罕見的等位基因遺傳引起的，通常涉及基因編碼區(qū)、剪切位點或調(diào)控序列中的錯義突變、插入或缺失等，有文獻報道中國人群弱ABO亞型的檢出率約為0.015%左右[7]。

圖1 樣本ABO血型基因6號外顯子的c.278C>T突變

根據(jù)與單克隆抗-B/抗-AB/抗-H抗體的凝集程度、人源抗-B抗體吸收放散實驗結(jié)果、唾液分泌狀態(tài)以及血清中是否存在抗-B等，可將B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，如果不符合以上四類，則可劃分為Bw[8]。另外，如要準確的確定正反定型不相符的患者ABO血型，仍需借助基因檢測的方法來分析確定[4]。在本例，患者樣本常規(guī)條件下檢測正定型O型，反定型B型，正反定型不相符。但患者紅細胞與抗-H強反應(yīng)，且在4℃條件下檢測其紅細胞與抗-B和抗-AB抗體呈弱反應(yīng)，并使用人源抗-B吸收放散后可驗證有B抗原存在，可初步判斷為弱B亞型，疑似為Bx。在諸多B亞型中，Bx、Bm的檢測確認尤其是重要的，因為這些B亞型紅細胞上只有極弱的B抗原，作為獻血者其可能會被錯誤地判斷成O型，如果輸血給O型受血者，則可能導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生[4]。另外，當這類B亞型(如Bx)個體由于其血清(血漿)中可能含有弱的抗-B抗體，因而其作為受血者時應(yīng)該給其輸O型紅細胞和(或)匹配/兼容的血漿和血小板成分[8]。

目前，ISBT(國際輸血協(xié)會)確認的涉及弱B的等位基因接近50個，最常見的B基因是ABO*B.01(B表型)，弱B表型的基因突變主要發(fā)生在6、7外顯子[5]。不同的B等位基因編碼翻譯出不同的糖基轉(zhuǎn)移酶，Bx型是由于基因的錯義突變，造成了編碼翻譯的酶只具有弱的合成抗原的能力[9]。本例患者樣本的直接測序結(jié)果顯示，在ABO基因第6外顯子出現(xiàn)c.278C>T、c.297A>G兩個等位基因突變，在第7外顯子出現(xiàn)c.526C>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A共6個等位基因突變。通過比對ISBT的ABO血型抗原等位基因突變資料，分析得出患者樣本序列與ABO*BW.12基因的序列完全一致，c.278C>T堿基突變導(dǎo)致93位脯氨酸變成亮氨酸，而這一突變在中國人群中已有多例發(fā)現(xiàn)，并推測該突變正是其弱表型Bx/Bweak形成的分子基礎(chǔ)[5,10-11]。