RPS14在結直腸癌組織中的表達及意義

岳斯琦，魏麗萍，何成彥

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

結直腸癌作為癌癥相關死亡的第四大原因，也是全球第三大最常診斷的惡性腫瘤。在東歐和亞洲地區(qū)，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率上升迅速，預計到2030年，全球結直腸癌患者將新增220萬確診病例以及110萬的死亡病例[1]。在最近的研究報告中指出進行結直腸癌早期癌癥篩查診斷能顯著降低結直腸癌死亡率[2]，本實驗初步通過二維色譜質譜聯用技術及免疫印跡實驗來分析RPS14蛋白在結直腸癌組織與癌旁組織的差異，為結直腸癌的篩查和診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

吉林大學中日聯誼醫(yī)院組織標本庫中2018年到2020年術前未經治療的結直腸癌患者組織，所有標本均經病理學診斷為腺癌，共計16例。在患者術中留取結直腸癌組織和距離癌組織邊緣7 cm處的癌旁組織，完成采集迅速冷卻后用PBS徹底沖洗，液氮速凍，儲存在溫度為-80℃的冰箱中待用。研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，LTQXL 離子阱質譜儀(美國賽默飛公司)，電泳儀(柏奧易杰北京科技有限公司)，RPS14單抗(美國Affinity公司)，β-actin多抗(美國abcam公司)。BCA蛋白質定量試劑盒(美國伯樂公司)，碘代乙酰胺，DNA酶，RNA酶，TPCK修飾的測序級胰酶(美國西格瑪公司)。

1.3 方法

1.3.1蛋白提取及樣品制備 取出儲存于-80℃冰箱的樣本將其在液氮條件下研磨至粉末狀，在粉末中加入適量的蛋白裂解液并充分振蕩混勻30 min。后續(xù)在樣本中加入DNA酶和RNA酶來去除樣本殘留的物質，在4℃條件下1 200 rpm離心10 min。用BCA法測定蛋白的濃度后，用酶標儀測定樣品OD562值繪制蛋白質濃度標準曲線，在加入一定比例的上樣緩沖劑后，煮沸冷卻至室溫，在冰箱(-80℃)中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2二維質譜色譜聯用技術鑒定蛋白多肽 0.1%的FA與配制好的蛋白樣品相溶解，經陽離子交換柱和反向柱洗脫分離蛋白樣品后經LTQXL離子阱質譜儀分析檢測，在通過全掃描和二級掃描后獲取質譜數據。

1.3.3免疫印跡試驗 SDS-PAGE電泳，按照說明書配置好10%APS水溶液放入4℃冰箱中保存，加入分離膠A和分離膠B后迅速加入APS及TEMED，混勻后注入到玻璃板內，插板后等待1 h左右，注意避免產生氣泡。通過組織濃度和固定上樣質量(60 μg)計算出每孔需要的上樣體積，將配置好的電泳液倒入電泳槽內沒過凝膠，保持膠體濕潤，在每孔依次加入定量的Marker和Loading buffer，在80V條件下通電1.5 h。用稀釋好的快速轉膜液在400 mA的條件下轉膜20 min，加入快速封閉液，孵育一抗過夜(4℃)，用PBS-T清洗NC膜3次后加入二抗低溫孵育1 h，PBS-T再次洗膜5次后用ECL熒光化學法發(fā)光顯色，將顯影液與定影液按照1∶9的比例配好，各自浸沒5 min。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 二維色譜與質譜聯用技術分析結果

本實驗癌組織及癌旁組織中同一蛋白的豐度通過圖譜數來衡量，差異蛋白的滿足條件為兩個樣品中蛋白圖譜數比值 ≥1且蛋白圖譜數差值 ≥72。在此標準下共檢測到ARGAL、CUL48、B3KXD6、E5RH53、CDK5、B4E0Y9、RPS14和60 kD線粒體熱休克蛋白共8個上調蛋白，ACTS、DESM、ACTN1、A1AT、TLN1、KCRB、CNN1、MYH14、紐蛋白亞型2、熱休克蛋白β1共10個下調蛋白。RPS14作為其中一個上調蛋白，質譜圖結果見圖1。

2.2 免疫印跡試驗結果

運用WB方法，分析16對組織的RPS14表達量檢測發(fā)現RPS14在結直腸癌組織中高表達，如圖2所示。

圖1 RPS14 質譜圖結果

圖2 RPS14 免疫印跡結果

3 討論

結直腸癌作為世界范圍內最常見和致死率較高的癌癥之一，在2021年的流行病學報告中顯示，全世界范圍內早發(fā)性結直腸癌患者的發(fā)病率和死亡率不斷增加，防范重心傾向于在50歲以下的人群中積極展開CRC的篩查和隨訪[3]。結直腸鏡檢是CRC篩查的金標準，但鏡檢存在檢測費昂貴、技術要求高、并發(fā)癥多、適用性差等局限性。近年來先進的分子技術在結直腸癌檢測和治療方面發(fā)展迅速，尤其是血液中的生物標志物如蛋白質、腫瘤DNA、腫瘤細胞和血液中的RNA等都常用于結直腸癌的診斷，其靈敏度和特異度都高于FOBT和FIT，逐漸成為癌癥檢測的新風向[4]。

RPS14被稱為核糖體蛋白小亞基14，又名S14、uS11，是核糖體蛋白家族的重要成員，該家族在原核和真核細胞中普遍表達。在結構上，RPS14由五個外顯子和四個內含子組成多個功能不同的多態(tài)結構域，其中結構域B和D是RPS14生物活性所必需的部分[5-6]。在功能上，RPS14過表達將誘發(fā)細胞周期停滯和衰老[7]并調節(jié)P53通路的激活而影響腫瘤細胞的增殖[8]。此外，RPS14與肺鱗狀細胞癌[9]、膀胱癌[10]、肝細胞癌[11]及其亞型酒精性肝細胞癌[12]的發(fā)生發(fā)展密切相關，RPS14于2017年在乳腺癌的生信分析中首次被篩選出來[13]，低表達RPS14細胞株抑制了乳腺癌的增殖、遷移并顯著誘導細胞凋亡[14]。RPS14于2022年也通過生信分析手段推測其可能是通過調節(jié)核糖體途徑而影響結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵基因[15]。近年來，隨著LC-MS技術的發(fā)展，其在蛋白質的定性和定量方面都有廣泛的研究，又因LC-MS具有選擇性高、靈活性大和穩(wěn)定性強的特點，常常被認為是替代傳統方法分析蛋白質的最佳選擇[16]。因此本研究選擇通過二維質譜色譜聯用技術(LC-MS)發(fā)現在結直腸癌組織上高表達的RPS14基因并通過免疫印跡實驗的方法對處于Ducks’B期的結直腸癌及癌旁組織進行了分析和驗證，實驗結果證明RPS14在結直腸癌組織中高表達，并與癌旁組織有顯著差異。因此推測RPS14高表達與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定聯系，如果在未來能對RPS14進行更多的細胞功能實驗和機制的研究，RPS14將在結直腸癌診斷方面有更顯著的貢獻。