滋腎通關(guān)方中肉桂反佐配伍對(duì)黃柏-知母藥對(duì)在大鼠體內(nèi)活性成分組織分布的影響*

孫蕾，王迅，趙晨光，劉月恒，劉順

（江蘇省中醫(yī)院·南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210036）

反佐配伍是一種獨(dú)特的中醫(yī)遣方組藥，通過“藥性相反、藥效協(xié)同”的組方理論實(shí)現(xiàn)藥性與病性相趨、因勢(shì)利導(dǎo)、相反相成的獨(dú)特配伍方式。左金丸、吳茱萸湯、交泰丸、通關(guān)丸等均是反佐配伍的經(jīng)典方劑。滋腎通關(guān)膠囊是江蘇省中醫(yī)院基于《蘭室秘藏》所載“通關(guān)丸”開發(fā)的醫(yī)院制劑，用于治療腎虛濕熱淋證之熱蘊(yùn)膀胱所致尿閉不通、小腹脹滿、尿道澀通等癥，療效較好［1-2］。目前對(duì)滋腎通關(guān)方機(jī)理的認(rèn)識(shí)還不足，對(duì)組成較簡(jiǎn)單的復(fù)方、藥對(duì)的研究大多是針對(duì)化學(xué)成分的含量和變化、藥理作用等方面，而對(duì)藥對(duì)配伍前后尤其反佐配伍前后藥對(duì)的活性成分在動(dòng)物體內(nèi)的組織分布研究較少。故本課題采用已建立的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）法［3］，以黃柏-知母藥對(duì)及藥對(duì)配伍肉桂后的滋腎通關(guān)方為研究對(duì)象，通過比較藥對(duì)中的代表性成分黃柏堿和知母皂苷AⅢ在正常大鼠心、肝、脾、肺、腎組織中分布的差異，探討肉桂反佐配伍的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：ThermoFisher TSQ Quantum Access MAX型三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源、Xcalibar 1.4工作站、LC Quan數(shù)據(jù)處理軟件），Dionex型超高效液相色譜系統(tǒng)（配有二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器），均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；Milli-Q Gradient A10型超純水器（美國(guó)Millipore公司）；VORTEX-GENIE 2型漩渦儀（美國(guó)Scientific Industries公司）；PCB-11型振蕩儀，Eppendorf Centrifuge 5430R型冷凍高速離心機(jī)，均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；BP 211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為十萬分之一）；Centrivap Concentrator/Cold Trap型高速冷凍離心濃縮儀（美國(guó)Labconco公司）；FLuKO F6/10型手持組織勻漿機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；可調(diào)移液器［百得實(shí)驗(yàn)儀器有限公司（2～20μL和20～200μL），德國(guó)Eppendorf公司（100～1 000μL）］。

試藥：知母皂苷AⅢ對(duì)照品（批號(hào)為Y27A6Y17282），黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)為H24F3X1），氫溴酸右美沙芬-水合物對(duì)照品（批號(hào)為F26M7E11810），薯蕷皂苷對(duì)照品（批號(hào)為P20J7F18116），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度不低于98%；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）；其余試劑均為分析純；黃柏（馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，批號(hào)為20170201）；知母（貴州同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20161101）；肉桂（安徽大別山中藥飲片公司，批號(hào)為160803）；滋腎通關(guān)方和黃柏-知母藥對(duì)混懸液（自制）。

動(dòng)物：健康Wistar大鼠56只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（蘇）-2017-0007。飼養(yǎng)溫度為（24±1）℃，相對(duì)濕度為50%～60%。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

按方中知母、黃柏、肉桂比例10∶10∶1（m/m/m）稱配，打粉，加生理鹽水配制成按飲片量計(jì)質(zhì)量濃度為1 g/mL的滋腎通關(guān)方混懸液，置4℃溫度下儲(chǔ)存，臨用時(shí)混勻。分別取黃柏和知母飲片，按滋腎通關(guān)方中比例10∶10（m/m）稱配，打粉，加生理鹽水配制成按飲片量計(jì)質(zhì)量濃度為1 g/mL的黃柏-知母藥對(duì)混懸液，置4℃溫度下儲(chǔ)存，臨用時(shí)混勻。

2.2 分組及給藥

取健康Wistar大鼠56只適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組，滋腎通關(guān)方低、中、高劑量組，黃柏-知母藥對(duì)低、中、高劑量組，各8只，雌雄各半。滋腎通關(guān)方臨床等效劑量為10 g/kg，低、中、高劑量分別5，10，20 g/kg?？瞻捉M，滋腎通關(guān)方低、中、高劑量組，黃柏-知母藥對(duì)低、中、高劑量組分別灌胃相應(yīng)量的生理鹽水、滋腎通關(guān)方混懸液、黃柏-知母藥對(duì)混懸液，給藥前禁食12 h，自由飲水。

2.3 組織樣品處理［4-6］

給藥后1 h處死大鼠，迅速取出心、肝、肺、腎、脾組織，用生理鹽水洗去組織表面血跡及內(nèi)容物，并用濾紙吸干，即得各組織樣品。取各組織樣品，精密稱定，按1 g∶5 mL的比例加入預(yù)冷（4℃）的生理鹽水，制成20%的組織勻漿液。取200 μL組織勻漿液，分別加入質(zhì)量濃度為11.11 μg/mL和7.01 μg/mL的右美沙芬及薯蕷皂苷混合內(nèi)標(biāo)液15 μL，混勻，再加入1 mL乙腈，渦旋振蕩（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）5 min，離心（轉(zhuǎn)速為16 000 r/min）5 min，取上層有機(jī)相置另一離心管中，45℃溫度下?lián)]干溶劑，加入100 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶殘留物，渦旋混勻（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）5 min，離心（16 000 r/min，溫度為10℃）10 min，取上清液，備用。

2.4 黃柏堿和知母皂苷AⅢ含量測(cè)定

2.4.1 測(cè)定條件

1）色譜條件。色譜柱：預(yù)柱Kromasil 100-3.5 C18柱，色譜柱Kromasil 100-3.5 C18柱（150 mm×2.1 mm，100?）；流動(dòng)相：0.2%甲酸水溶液（A）-純乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min時(shí)75%A，1～4 min時(shí)75%A～10%A，4～9 min時(shí)10%A，9～9.8 min時(shí)10%A～75%A，9.8～13 min時(shí)75%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；自動(dòng)進(jìn)樣：溫度為8℃，進(jìn)樣量為5μL。

2）質(zhì)譜條件。離子化方式采用電噴霧離子源（ESI），選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式（MRM）。主要掃描參數(shù)：噴霧電壓為3 000 eV（-）和4 000 eV（+）；毛細(xì)管溫度為270℃，霧化溫度為200℃；鞘氣（N2）壓力為20 psi，輔助氣壓為5 psi；正、負(fù)離子模式同時(shí)檢測(cè)；放電電流為4.0μA（正極）和4.0μA（負(fù)極）。

2.4.2 溶液制備

取黃柏堿和知母皂苷AⅢ對(duì)照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含黃柏堿721.28 μg、知母皂苷AⅢ559.44μg的混合對(duì)照品溶液。取氫溴酸右美沙芬-水合物和薯蕷皂苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含右美沙芬11.11μg、薯蕷皂苷7.01μg的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：吸取空白心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液，分別加入2.4.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，按2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。色譜圖見圖1。黃柏堿和知母皂苷AⅢ與2個(gè)內(nèi)標(biāo)都能同時(shí)被檢測(cè)到，且色譜峰峰形良好，各組織勻漿液中的內(nèi)源性成分不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，表明組織處理方法及測(cè)定條件的專屬性均良好。

線性關(guān)系考察及檢測(cè)限確定：取2.4.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，依次精密吸取10μL各對(duì)照品稀釋液、混合內(nèi)標(biāo)溶液，置100μL空白肝組織勻漿液中，制成每1 mL含黃柏堿18.032，36.064，288.512，721.280，1 442.560，3 606.400，7 212.800 ng和含知母皂苷AⅢ13.986，27.972，223.776，559.440，1 118.880，2 797.200，5 594.400 ng的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，按2.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件檢測(cè)，以待測(cè)物質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得肝臟組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以信噪比（S/N）為3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度確定檢測(cè)限。結(jié)果見表1。

表1 黃柏堿和知母皂苷AⅢ在肝組織勻漿液中的線性關(guān)系考察結(jié)果及檢測(cè)限Tab.1 Results of the linear relation test and limit of detection of phellodendrine and timosaponin AⅢin liver tissue homogenate

精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液，加入黃柏堿對(duì)照品和知母皂苷AⅢ對(duì)照品，分別配制成黃柏堿低、中、高質(zhì)量濃度分別為72.128，144.256，1 442.560 ng/mL和知母皂苷AⅢ低、中、高質(zhì)量濃度分別為55.944，111.888，1 118.880 ng/mL的樣品溶液，每個(gè)濃度平行5份，按2.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件測(cè)定，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算各組織樣品中黃柏堿和知母皂苷AⅢ的濃度，并與配制濃度對(duì)照，求得測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和日間精密度。結(jié)果黃柏堿和知母皂苷AⅢ在各組織勻漿液中日間精密度的RSD小于15%（n=15），準(zhǔn)確度在±15%范圍內(nèi)，表明方法的準(zhǔn)確度和日間精密度均良好。

基質(zhì)效應(yīng)考察：基質(zhì)效應(yīng)的考察可用來衡量樣品前處理方法的可行性與準(zhǔn)確性。取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件檢測(cè)，以峰面積內(nèi)標(biāo)法定量分析黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（A）；以純水代替心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液，同法考察樣品中黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（C），各濃度平行操作5份，按公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)（%）=A/C×100%。結(jié)果見表2。

表2 黃柏堿和知母皂苷AⅢ在各組織勻漿液中的基質(zhì)效應(yīng)（n=5）Tab.2 Matrix effects of phellodendrine and timosaponin AⅢin homogenates of various tissues（n=5）

1.黃柏堿2.右美沙芬3.知母皂苷AⅢ4.薯蕷皂苷A.心組織B.肝組織C.脾組織D.肺組織E.腎組織圖1超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.Phellodendrine 2.Dextromethorphan 3.Timosaponin AⅢ4.DioscinA.Heart tissue B.Liver tissue C.Spleen tissue D.Lung tissue E.Kidney tissueFig.1 Chromatograms of UHPLC-MS/MS

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液，分別于常溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件檢測(cè)。結(jié)果不同質(zhì)量濃度各成分含量的RSD均小于15%（n=6），表明大鼠心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液中黃柏堿和知母皂苷AⅢ常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

提取回收率考察：取心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液200 μL，分別加入20 μL精密度試驗(yàn)項(xiàng)下含黃柏堿、知母皂苷AⅢ低、中、高質(zhì)量濃度的樣品溶液，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件檢測(cè)，以峰面積內(nèi)標(biāo)法定量分析黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（B）；以純水代替心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液，同法計(jì)算樣品中黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（C）。各質(zhì)量濃度平行操作5份，按公式計(jì)算提取回收率，提取回收率（%）=B/C×100%。結(jié)果見表3。

表3 黃柏堿和知母皂苷AⅢ在各組織勻漿液中的提取回收率（n=5）Tab.3 Extraction recovery rates of phellodendrine and timosaponin AⅢin homogenates of various tissues（n=5）

2.5 組織分布考察

按2.2項(xiàng)下方法分組并給藥1 h后，取大鼠肝、心、脾、肺、腎組織，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件檢測(cè)，結(jié)果見圖2和圖3?？梢?，除灌胃高、低劑量滋腎通關(guān)方組大鼠脾組織勻漿液中黃柏堿的含量低于黃柏-知母藥對(duì)組外，灌胃其余各劑量滋腎通關(guān)方組大鼠中各組織勻漿液中黃柏堿的含量均高于黃柏-知母藥對(duì)組，并以肺組織勻漿液中的黃柏堿含量差異最顯著（P＜0.05）；知母皂苷AⅢ主要分布在肝、肺組織中，其組織濃度除中劑量給藥后的心、脾組織勻漿液及低劑量給藥后的的脾組織勻漿液外，其余均為滋腎通關(guān)方組高于黃柏-知母藥對(duì)組，其中以肝、肺組織中知母皂苷AⅢ含量差異最顯著（P＜0.05）。結(jié)果顯示，灌胃低、中、高劑量滋腎通關(guān)方和黃柏-知母藥對(duì)混懸液1 h后，黃柏堿和知母皂苷AⅢ在肝、心、脾、肺、腎中均有分布，但大鼠灌胃黃柏-知母藥對(duì)后在其組織中的黃柏堿和知母皂苷AⅢ含量整體低于相同灌胃量配伍肉桂的滋腎通關(guān)方組。

3 討論

黃柏中的黃柏堿屬異阿樸啡型生物堿，知母中的知母皂苷AⅢ屬螺甾皂苷類成分。由圖2和圖3可知，大鼠灌胃給藥黃柏-知母藥對(duì)和滋腎通關(guān)方后，黃柏堿和知母皂苷AⅢ活性成分能在大鼠體內(nèi)廣泛分布，在心、肝、脾、肺、腎等組織/器官中均可檢測(cè)出，其中在肝、肺、腎等組織中分布相對(duì)較多。可能是由于這些組織血流量豐富，通透性好，且肝是主要代謝器官，腎是主要排泄器官，是藥物經(jīng)過的必要場(chǎng)所。同時(shí)，與中醫(yī)歸經(jīng)理論的知母歸肺、胃、腎經(jīng)，黃柏歸腎、膀胱經(jīng)，肉桂歸腎、脾、心、肝經(jīng)有一定程度的契合。

黃柏-知母藥對(duì)灌胃后在大鼠組織中的黃柏堿和知母皂苷AⅢ含量低于相同灌胃量配伍肉桂的滋腎通關(guān)方組，表明黃柏-知母藥對(duì)配伍少量肉桂可促進(jìn)黃柏和知母活性成分在組織中的分布，可能是藥對(duì)反佐配伍肉桂后改變了黃柏-知母藥對(duì)中活性成分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了活性成分在細(xì)胞器官內(nèi)的吸收，直接影響活性成分的分布。

A.高劑量（20 g/kg）B.中劑量（10 g/kg）C.低劑量（5 g/kg）注：與滋腎通關(guān)方組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。H為黃柏-知母藥對(duì)，Z為滋腎通關(guān)方。圖3同。圖2灌胃高、中、低劑量藥物的大鼠體內(nèi)組織勻漿液中黃柏堿含量A.High dose（20 g/kg）B.Medium dose（10 g/kg）C.Low dose（5 g/kg）Note：Compared with those in the Zishen Tongguan Recipe groups，*P＜0.05，**P＜0.01.H refers to Phellodendri Chinensis Cortex-Anemarrhenae Rhizoma herb pair，and Z refers to Zishen Tongguan Recipe（for Fig.2-3）.Fig.2 Contents of phellodendrine in tissue homogenates of rats after the administration of high-，medium-and low-dose of drugs by gavage

A.高劑量（20 g/kg）B.中劑量（10 g/kg）C.低劑量（5 g/kg）圖3灌胃高、中、低劑量藥物的大鼠體內(nèi)組織勻漿液中知母皂苷AⅢ含量A.High dose（20 g/kg）B.Medium dose（10 g/kg）C.Low dose（5 g/kg）Fig.3 Contents of timosaponin AⅢin tissue homogenates of rats after the administration of high-，medium-and low-dose of drugs by gavage

本研究中采用UHPLC-MS/MS法定量分析了大鼠組織勻漿液中的黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量，初步比較了黃柏-知母藥對(duì)及配伍肉桂的滋腎通關(guān)方的代表性成分在大鼠體內(nèi)組織分布的規(guī)律和特征。黃柏、知母中的代表性成分在組織的分布中有一定變化，但不十分明顯。配伍是否能改變藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的分布，可通過增加考察其他代表性成分、增加樣本量、增加取樣時(shí)間點(diǎn)、或通過進(jìn)一步的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)加以全面探究。