siRNA靶向干擾circ_0055625表達對胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響

劉奕明 孫銀平 鐘平玉 楊柏?zé)槪ǜ＝ㄡt(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院消化內(nèi)科，龍巖 364000）

胃癌是威脅我國人民生命安全的消化道惡性腫瘤之一，每年全球胃癌的發(fā)病例數(shù)超過103萬例，且病死率在所有腫瘤中占據(jù)第三位，由于胃癌早期癥狀較為隱匿導(dǎo)致40%左右的患者確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療后胃癌患者五年生存率<10%，因而抑制胃癌轉(zhuǎn)移是提高胃癌治療效果及改善患者預(yù)后的關(guān)鍵［1］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由前體mRNA通過剪切形成的閉合環(huán)狀RNA分子，其具有穩(wěn)定性與組織特異性，并可通過吸附微小RNA（miRNA）而參與翻譯蛋白等多種生物學(xué)過程從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。近年來，越來越多的研究表明circRNA可調(diào)控胃癌細胞增殖、侵襲等多種生物學(xué)行為，并可能作為胃癌治療的潛在靶點［2-4］。circ_0055625在結(jié)腸癌細胞中呈高表達，并可通過吸附miR-106b-5p而促進細胞增殖及轉(zhuǎn)移［5］。但circ_0055625在胃癌中的表達及其可能生物學(xué)功能尚未可知。通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測顯示circ_0055625與miR-1225-3p存在結(jié)合位點，研究表明miR-1225-3p在非小細胞肺癌中呈低表達，上調(diào)其表達可抑制非小細胞肺癌細胞轉(zhuǎn)移［6］。但circ_0055625/miR-1225-3p軸在胃癌形成及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚未可知。因此，本研究主要探討circ_0055625是否可通過靶向調(diào)控miR-1225-3p的表達從而影響胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移，為胃癌的治療提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料收集2019年1月至2020年6月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院進行胃癌根治術(shù)的55例胃癌患者的癌組織及其癌旁組織（癌組織>5 cm范圍外正常組織）標(biāo)本，于液氮中保存，其中 男35例，女20例，年 齡46~67歲，平 均 年 齡（53.68±7.49）歲。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理診斷確診。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器人胃癌細胞AGS購自湖南豐暉生物；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Trizol試劑、circ_0055625過表達載體（pcDNA-circ_0055625）及其對照空載體（pcDNA）購自美國Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑與qRTPCR試劑購自北京天根生化；circ_0055625小分子干擾RNA（si-circ_0055625）及其陰性對照（si-NC）、miR-1225-3p寡核苷酸模擬物（miR-1225-3p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、miR-1225-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-1225-3p）及其陰性對照（anti-miR-NC）購自廣州銳博生物；MTT試劑、Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶；Transwell小室購自美國Corning；兔抗人vimentin、YAP-1多克隆抗體購自沈陽萬類生物；兔抗人Snail多克隆抗體、二抗購自美國Abcam；蛋白質(zhì)提取相關(guān)試劑與SDS凝膠電泳相關(guān)試劑購自上海碧云天生物；低溫離心機購自美國Thermo Fisher；EON型酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Tek；Nikon ECLIPSE Ti-S熒光倒置顯微鏡購自日本尼康；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI；DYY-6C型雙穩(wěn)定電泳儀購自北京六一生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組AGS細胞常規(guī)培養(yǎng)，按1×105個/孔的密度接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，待細胞生長融合度達到70%左右時用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent進行轉(zhuǎn)染，每孔取4μg的si-NC、si-circ_0055625、miR-NC、miR-1225-3p mimics、si-circ_0055625與anti-miR-NC（共轉(zhuǎn)染）、si-circ_0055625與anti-miR-1225-3p（共轉(zhuǎn)染）分別進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記為si-NC組、si-circ_0055625組、miR-NC組、miR-1225-3p組、si-circ_0055625+anti-miR-NC組、si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p組。

1.2.2 qRT-PCR檢 測circ_0055625、miR-1225-3p的表達水平收集各組AGS細胞與癌旁組織、胃癌組織，采用Trizol法分別提取組織標(biāo)本與細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 2μl、ddH2O補足體系至20μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán)。circ_0055625以GAPDH為內(nèi)參，miR-1225-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖取各組AGS細胞按照3 000個/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，每孔分別加入MTT溶液20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，3 000 r/min離心5 min后棄上清，每孔分別加入150μl DMSO，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值（OD）。細胞存活率（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.4克隆形成實驗取各組AGS細胞懸液接種于6孔板（500個/孔），于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d（0肉眼可見克?。? d更換1次培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)后用4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，計算克隆形成數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗將各組AGS細胞按照1×104個/孔接種于6孔板，待細胞生長融合度達到90%時用10μl移液槍的槍頭在6孔板的中間劃線，PBS沖洗劃掉的細胞后再加入2 ml含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，此時記為0 h，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后在相同位置拍照并應(yīng)用Image J軟件計算細胞劃痕距離，計算劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按照1∶5的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，將其加入小室的上室（30μl/孔）后于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，然后加入各組AGS細胞（2×104個/ml）400μl，小室的上室，下室中加入600μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后取出小室，PBS洗滌細胞后用4%多聚甲醛固定20 min，0.05%結(jié)晶紫染色液染色20 min，PBS洗滌后晾干，于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測circ_0055625與miR-1225-3p的靶向關(guān)系Circular RNA Interactome預(yù)測顯示circ_0055625與miR-1225-3p存在結(jié)合位點，用點突變試劑盒將結(jié)合位點進行突變，分別構(gòu)建含有結(jié)合位點與突變位點的熒光素酶報告基因載體（野生型載體WT-circ_0055625、突變型載體MUT-circ_0055625），利用LipofectamineTM3000 Trans?fection Reagent試劑盒分別將WT-circ_0055625、MUT-circ_0055625與miR-NC或miR-1225-3p mimics共轉(zhuǎn)染至AGS細胞，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性。分別將si-NC、si-circ_0055625、pcDNA、pcDNA-circ_0055625轉(zhuǎn)染至AGS細胞24 h后收集細胞并采用qRT-PCR實驗檢測miR-1225-3p的表達量。

1.2.8 Western blot檢測Snail、Vimentin、YAP-1蛋白表達收集各組AGS細胞后加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，取40μg蛋白樣品進行10%SDSPAGE電泳分離蛋白，用210 mA恒流的方式將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Snail（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、YAP-1（1∶1 000）一抗與內(nèi)參GAPDH抗體（1∶3 000）稀釋液，4℃孵育過夜后TBST洗膜，加入二抗稀釋液（1∶5 000）37℃孵育1 h后TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光液顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，Pearson法進行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0055625與miR-1225-3p在胃癌組織及癌旁組織中的表達與癌旁組織比較，胃癌組織中circ_0055625的表達量升高（P<0.05），miR-1225-3p的表達量降低（P<0.05），見表1。Pearson法分析胃癌組織中circ_0055625與miR-1225-3p表達量的相關(guān)性，結(jié)果顯示circ_0055625與miR-1225-3p呈負相關(guān)（r=-0.881 6，P<0.001），見圖1。

圖1 胃癌組織中circ_0055625與miR-1225-3p表達量的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of circ_0055625 and miR-1225-3p expression in gastric cancer tissues

表1 circ_0055625與miR-1225-3p在胃癌組織及癌旁組織中的表達量（±s，n=55）Tab.1 Expression of circ_0055625 and miR-1225-3p in gastric cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=55）

表1 circ_0055625與miR-1225-3p在胃癌組織及癌旁組織中的表達量（±s，n=55）Tab.1 Expression of circ_0055625 and miR-1225-3p in gastric cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=55）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P<0.05.

Groups Adjacent tissues Gastric cancer tissues t P circ_0055625 1.00±0.11 3.46±0.621）28.973 0.000 miR-1225-3p 1.00±0.18 0.36±0.091）23.585 0.000

2.2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響與si-NC組比較，si-circ_0055625組細胞存活率降低（P<0.05），克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），劃痕愈合率降低（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平降低（P<0.05），見圖2、表2。

表2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

表2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-circ_0055625 t P circ_0055625 1.00±0.04 0.28±0.051）33.734 0.000 Cell survival rate（%）99.69±3.87 35.73±4.611）31.879 0.000 Number of clones formed 114.44±10.75 45.33±8.721）14.978 0.000 Scratch healing rate（%）56.06±2.86 25.88±5.501）14.605 0.000 Number of invasion cells 137.67±7.83 55.11±6.571）24.232 0.000

圖2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響Fig.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migra?tion and invasion of AGS cells

2.3 雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗驗證circ_0055625與miR-1225-3p的靶向調(diào)控關(guān)系Cir?cular RNA Interactome預(yù) 測 顯 示circ_0055625與miR-1225-3p存在結(jié)合位點，見圖3A。上調(diào)miR-1225-3p表達可降低野生型載體WT-circ_0055625的熒光素酶活性（P<0.05），而對突變型載體MUTcirc_0055625的熒光素酶活性無顯著影響，見圖3B。與si-NC組比較，si-circ_0055625組miR-1225-3p的表達量升高（P<0.05）；與pcDNA組比較，pcDNAcirc_0055625組miR-1225-3p的 表 達 量 降 低（P<0.05），見圖3C。

圖3 circ_0055625與miR-1225-3p的靶向調(diào)控作用Fig.3 Targeted regulatory effects of circ_0055625 and miR-1225-3p

2.4 上調(diào)miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響與miR-NC組比較，miR-1225-3p組細胞存活率降低（P<0.05），克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），劃痕愈合率降低（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平降低（P<0.05），見圖4、表3。

表3 上調(diào)miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

表3 上調(diào)miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with the miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-1225-3p t P miR-1225-3p 1.00±0.05 3.12±0.081）67.416 0.000 Cell survival rate（%）99.64±3.26 57.62±4.091）24.309 0.000 Number of clones formed 113.33±11.75 52.67±9.381）12.104 0.000 Scratch healing rate（%）56.13±4.67 23.54±3.661）16.478 0.000 Number of invasion cells 136.22±8.89 70.67±4.851）19.419 0.000

圖4 上調(diào)miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響Fig.4 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells

2.5 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用與si-circ_0055625+anti-miR-NC組比較，si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p組細胞存活率升高（P<0.05），克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù)增多（P<0.05），劃痕愈合率升高（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平升高（P<0.05），見表4、圖5。

表4 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effects of interference with circ_0055625 expres?sion on AGS cell proliferation，clone formation，migration and invasion（±s，n=9）

表4 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effects of interference with circ_0055625 expres?sion on AGS cell proliferation，clone formation，migration and invasion（±s，n=9）

Note：Compared with si-circ_0055625+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups si-circ_0055625+anti-miR-NC si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p t P miR-1225-3p 1.00±0.05 0.41±0.041）27.643 0.000 Cell survival rate（%）35.85±4.97 79.94±5.451）17.933 0.000 Number of clones formed 45.33±2.24 85.11±8.101）14.200 0.000 Scratch healing rate（%）25.28±3.07 47.02±3.221）14.660 0.000 Number of invasion cells 55.11±6.05 93.78±6.281）13.304 0.000

圖5 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用Fig.5 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effect of interference with circ_0055625 expression on proliferation，clone forma?tion，migration and invasion of AGS cells

3 討論

circRNA廣泛存在于真核細胞中，其主要是由外顯子與內(nèi)含子構(gòu)成的一種共價閉合環(huán)狀RNA分子，其在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，同時circRNA分子富含miRNA的結(jié)合位點，并可在細胞中發(fā)揮miRNA海綿的作用，circRNA_100782、circRNA_100876在胃癌細胞中表達上調(diào)，并可發(fā)揮miRNA海綿的作用而調(diào)控其靶基因表達從而促進胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移［7-8］。circRNA_0005075、circ_0000190、circ_0004872、circRHOBTB3

在胃癌細胞中表達下調(diào)，并可通過調(diào)節(jié)miRNA/靶mRNA表達而抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲從而抑制胃癌進展［9-12］。

circ_0055625在結(jié)腸癌患者血清中表達上調(diào)且與化療耐藥性有關(guān)［13］。但circ_0055625在胃癌中的表達及其可能作用機制尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中circ_0055625的表達量高于癌旁組織，通過體外細胞實驗證實，siRNA靶向干擾circ_0055625表達后胃癌細胞存活率降低且克隆形成數(shù)減少，提示干擾circ_0055625表達可抑制胃癌細胞增殖及克隆形成。YAP-1屬于Hippo/YAP通路的關(guān)鍵蛋白，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細胞遷移及侵襲的重要環(huán)節(jié)，其可通過將上皮細胞重構(gòu)后促使細胞失去黏合連接進而導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)移，YAP-1表達上調(diào)可促進轉(zhuǎn)錄因子Snail表達進而上調(diào)Vimentin的表達［14-15］。本研究結(jié)果顯示，干擾circ_0055625表達后胃癌細胞侵襲細胞數(shù)減少且劃痕愈合率降低，并可抑制Snail、Vimentin、YAP-1蛋白表達，提示干擾circ_0055625表達后可抑制胃癌細胞遷移及侵襲。

circ_0055625與胃癌細胞生物學(xué)功能的相關(guān)性研究尚未見報道，本研究通過在線靶基因預(yù)測顯示circ_0055625與miR-1225-3p存在結(jié)合位點，并檢測到胃癌組織中miR-1225-3p的表達量低于癌旁組織，且胃癌組織中circ_0055625與miR-1225-3p表達量呈負相關(guān)，提示circ_0055625可能通過靶向結(jié)合miR-1225-3p而負向調(diào)控其表達進而參與胃癌發(fā)生發(fā)展過程。研究表明miR-1225-3p在骨肉瘤中表達量降低，circ_0016347通過調(diào)節(jié)miR-1225-3p/KCNH1表達而促進骨肉瘤進展［16］。miR-1225-3p在膽道癌、結(jié)直腸癌中表達下調(diào)，并可能作為腫瘤早期診斷及評估患者預(yù)后的潛在標(biāo)記物［17-18］。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實circ_0055625可靶向調(diào)控miR-1225-3p的表達，上調(diào)miR-1225-3p表達可抑制胃癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，而抑制其表達可拮抗干擾circ_0055625表達對胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的抑制作用。提示circ_0055625可通過靶向結(jié)合miR-1225-3p而抑制其表達從而促進胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胃癌組織中circ_0055625表達上調(diào)，而miR-1225-3p的表達下調(diào)，二者存在負相關(guān)關(guān)系且存在靶向結(jié)合作用，干擾circ_0055625表達可通過上調(diào)miR-1225-3p表達而抑制胃癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，可為進一步揭示胃癌的發(fā)病機制奠定實驗基礎(chǔ)，還可為胃癌的治療提供潛在靶點。但circ_0055625序列上富含多個miRNA結(jié)合位點，其是否可通過調(diào)控其他miRNA表達而參與胃癌發(fā)生、發(fā)展過程尚需進一步探究。