lncRNA DNAJC3-AS1/miR-3619-5p軸影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究

劉湛 魏?jiǎn)⒚?李瑩（濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦病科，濟(jì)南 271199）

人腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，致死率較高，嚴(yán)重威脅患者生命安全。目前，隨著治療手段的不斷進(jìn)步，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有了較大改善，但整體治療效果仍不令人滿意［1］。膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未明確，探究其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可為闡明其發(fā)病機(jī)制提供新途徑，并為其治療提供分子靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與微小RNA（miRNA）是真核生物中存在的兩類(lèi)小分子非編碼RNA，且lncRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用，調(diào)控miRNA靶基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控功能，影響人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2-3］。DNAJC3的反義RNA1（DNAJC3-AS1）屬于lncRNA家族成員，參與多種腫瘤發(fā)展進(jìn)程。有報(bào)道稱(chēng)，lncRNA DNAJC3-AS1在腎細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)明顯上調(diào)，沉默其表達(dá)可有效阻礙腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制與發(fā)揮miR-27a-3p分子海綿作用，調(diào)控PRDM14表達(dá)有關(guān)，對(duì)腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用［4］；lncRNA DNAJC3-AS1在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）組織中表達(dá)升高，且與CRC患者預(yù)后不良密切相關(guān)，干擾其表達(dá)可降低CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，可能成為CRC診斷和治療的新靶點(diǎn)［5］。但目前l(fā)ncRNA DNAJC3-AS1是否影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展尚未明確。

Starbase靶基因在線預(yù)測(cè)軟件顯示，lncRNA DNAJC3-AS1可能靶向結(jié)合miR-3619-5p。研究顯示，miR-3619-5p在骨肉瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、胃癌和膽囊癌等腫瘤中表達(dá)降低，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制基因［6-9］。但目前miR-3619-5p對(duì)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的影響尚不明確。本研究首先檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p的表達(dá)，并觀察lncRNA DNAJC3-AS1與miR-3619-5p對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響及l(fā)ncRNA DNAJC3-AS1能否靶向miR-3619-5p發(fā)揮作用，以期為膠質(zhì)瘤的治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料收集34例2017年5月至2019年5月于濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦病科確診并行手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織，液氮保存，其中男性19例，女性15例，平均年齡（56.31±6.82）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)；首次確診；術(shù)前未進(jìn)行放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝臟、腎臟等功能無(wú)障礙；合并其他惡性腫瘤。另收34例同時(shí)期行腦外傷內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織為對(duì)照組，其中男性22例，女性12例，平均年齡（50.26±7.95）歲。本研究經(jīng)濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.1.2 細(xì)胞和主要試劑正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088和Hs683購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物；si-lncRNA DNAJC3-AS1、si-NC、miR-3619-5p mimics、miR-NC、anti-miR-3619-5p及anti-miR-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)；RPMI1640培養(yǎng)液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶；胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗人上皮型鈣黏蛋白（E-cad?herin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p表達(dá)在液氮保護(hù)下研磨腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織，用RNA抽提試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個(gè) 循 環(huán)。lncRNA DNAJC3-AS1正向引物：5'-AGCGATTGTGGAAGACCCTG-3'，反向引物：5'-ATTTCCCCTGGTAAGCG?CAA-3'；miR-3619-5p正向引物：5'-TCATCAGCAG?GCAGGCTGGTGC-3'，反向引物：5'-GTGCAGGGTCCCGAGGT-3'；GAPDH正向引物：5'-CAACAGCCT?CAAGATCATCAGC-3'，反向引物：5'-TTCTAGACG?GCAGGTCAGGTC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTC?GGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA DNAJC3-AS1相對(duì)于GAPDH、miR-3619-5p相對(duì)于U6的表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)復(fù)蘇正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088和Hs683，均用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的各細(xì)胞接種至6孔板（1.0×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)各細(xì)胞中l(wèi)nc-RNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p表 達(dá)，方 法 同

1.2.1 ，選擇較HEB細(xì)胞表達(dá)差異最顯著的LN18細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 LN18細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對(duì)數(shù)期LN18細(xì)胞接種至6孔板（1.0×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后，采用Lipo?fectamineTM2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染si-lncRNA DNAJC3-AS1（si-lncRNA DNAJC3-AS1組）、si-NC（si-NC組）、miR-3619-5p mimics（miR-3619-5p組）、miRNC（miR-NC組）、共轉(zhuǎn)染si-lncRNA DNAJC3-AS1與anti-miR-3619-5p（si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-3619-5p組）、si-lncRNA DNAJC3-AS1與anti-miR-NC（si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC組）。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1或miR-3619-5p表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.2.1，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲遷移實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室置于24孔板中，在上室加入100μl含5.0×104個(gè)細(xì)胞的各轉(zhuǎn)染后的LN18細(xì)胞懸液，下室加入500μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，取出小室，用棉簽擦去上層未穿過(guò)基底膜的細(xì)胞。然后用4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min后，PBS清洗3次，置于顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中融化，于冰上用不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)液以1∶8比例稀釋?zhuān)佊赥ranswell小室上室，并自然晾干。然后加入各組轉(zhuǎn)染后的LN18細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種至6孔板（1.0×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后，RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，行10%SDS-PAGE電泳，恒壓80 V，進(jìn)入分離膠后轉(zhuǎn)為恒壓120 V。電泳結(jié)束后，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜電流200 mA，時(shí)間90 min。然后以5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，分別用E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin（1∶1 000）一抗在4℃冰箱中孵育過(guò)夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）于37℃下孵育1 h。再次洗膜后，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，采用凝膠系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析E-cadherin、N-cadherin和Vimentin相對(duì)于β-actin的表達(dá)量。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)PCR擴(kuò)增含miR-3619-5p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA DNAJC3-AS1核苷酸序列，構(gòu)建lncRNA DNAJC3-AS1野生型（lnc-RNA DNAJC3-AS1-WT）熒光素酶載體；同時(shí)將結(jié)合位點(diǎn)突變后構(gòu)建lncRNA DNAJC3-AS1突變型（lnc-RNA DNAJC3-AS1-MUT）熒光素酶載體，該過(guò)程由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。將對(duì)數(shù)期LN18細(xì)胞接種至6孔板（1.0×105個(gè)/孔），LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別共轉(zhuǎn)染miR-3619-5p mimics與WT-lncRNA DNAJC3-AS1、miR-NC與WT-lncRNA DNAJC3-AS1、miR-3619-5p mimics與MUT-lncRNA DNAJC3-AS1、miR-NC與MUT-lncRNA DNAJC3-AS1。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解，3 500 r/min離心5 cm，取上清，檢測(cè)熒光素酶活性，其結(jié)果以螢火蟲(chóng)與海腎的熒光強(qiáng)度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在 腦 膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)腦膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)明顯高于正常腦組織（3.45±0.37vs1.00±0.12，t=18.896，P<0.05），而miR-3619-5p表達(dá)明顯低于正常腦組織（0.48±0.07vs1.00±0.14，t=9.966，P<0.05）。

2.2 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在 膠 質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)與正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)升高（P<0.05），miR-3619-5p表達(dá)降低（P<0.05），選擇lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p表達(dá)較HEB細(xì)胞差異最為顯著的膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18進(jìn)行后續(xù)研究。見(jiàn)表1。

表1 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)（±s，n=9）Tab.1 Expressions of lncRNA DNAJC3-AS1 and miR-3619-5p in glioma cell lines（±s，n=9）

表1 lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)（±s，n=9）Tab.1 Expressions of lncRNA DNAJC3-AS1 and miR-3619-5p in glioma cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with HEB cells，1）P<0.05.

Groups HEB LN18 SW1088 Hs683 F P lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.09 2.76±0.181）2.27±0.151）1.87±0.121）258.124 0.000 miR-3619-5p 1.00±0.08 0.34±0.031）0.47±0.051）0.53±0.041）261.579 0.000

2.3 下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1抑制膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT與NC組或si-NC組相比，si-lncRNA DNAJC3-AS1組LN18細(xì) 胞 中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)降低（P<0.05），細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)及細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低（P<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P<0.05），而NC組或si-NC組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1抑制LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT（±s，n=9）Tab.2 Down-regulation of lncRNA DNAJC3-AS1 inhibits migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

表2 下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1抑制LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT（±s，n=9）Tab.2 Down-regulation of lncRNA DNAJC3-AS1 inhibits migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC group or si-NC group，1）P<0.05.

Groups NC si-NC si-lncRNA DNAJC3-AS1 t P lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.08 1.04±0.09 0.45±0.031）190.578 0.000 E-cadherin 0.40±0.04 0.38±0.03 0.87±0.071）280.581 0.000 N-cadherin 0.75±0.07 0.73±0.06 0.32±0.031）169.181 0.000 Vimentin 0.92±0.07 0.94±0.08 0.49±0.031）143.041 0.000 Migration 216±13.05 219±10.09 102±7.191）370.971 0.000 Invasion 169±11.09 164±8.96 78±3.611）326.669 0.000

圖1 下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1對(duì)LN18細(xì)胞遷移、侵襲及 細(xì) 胞 中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋 白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of down-regulated lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in LN18 cells

2.4上調(diào)miR-3619-5p抑制膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT與miR-NC組相比，miR-3619-5p組LN18細(xì)胞中miR-3619-5p表達(dá)升高（P<0.05），細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)及細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低（P<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 上調(diào)miR-3619-5p抑制LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT（±s，n=9）Tab.3 Up-regulation of miR-3619-5p inhibits migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

表3 上調(diào)miR-3619-5p抑制LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT（±s，n=9）Tab.3 Up-regulation of miR-3619-5p inhibits migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-3619-5p t P miR-3619-5p 1.00±0.06 2.19±0.141）25.697 0.000 E-cadherin 0.37±0.02 0.91±0.091）11.661 0.000 N-cadherin 0.75±0.07 0.35±0.031）15.757 0.000 Vimentin 0.94±0.08 0.43±0.041）17.106 0.000 Migration 247±15.16 91±6.131）28.620 0.000 Invasion 161±10.97 82±5.191）19.529 0.000

圖2 上調(diào)miR-3619-5p對(duì)LN18細(xì)胞遷移、侵襲及細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of up-regulated miR-3619-5p on migration，invasion and protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in LN18 cells

2.5 lncRNA DNAJC3-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-3619-5p

Starbase靶基因在線預(yù)測(cè)軟件顯示，lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯 示，miR-3619-5p與WT-lncRNA DNAJC3-AS1共轉(zhuǎn)染后LN18細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低（P<0.05），而 與MUT-lncRNA DNAJC3-AS1共 轉(zhuǎn) 染 后LN18細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P>0.05），提示lncRNA DNAJC3-AS1可靶向結(jié)合miR-3619-5p，見(jiàn)表4。同時(shí)si-lncRNA DNAJC3-AS1組lncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)低 于si-NC組（0.48±0.02vs1.00±0.01，t=69.765，P<0.05），miR-3619-5p表 達(dá)量高于si-NC組（1.91±0.11vs1.00±0.11，t=17.549，P<0.05），進(jìn)一步說(shuō)明lncRNA DNAJC3-AS1負(fù)調(diào)控miR-3619-5p。

圖3 Starbase靶基因在線軟件預(yù)測(cè)lncRNA DNAJC3-AS1和miR-3619-5p的結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 Binding sites of lncRNA DNAJC3-AS1 and miR-3619-5p predicted by Starbase target gene online software

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（±s，n=9）Tab.4 Test results of dual luciferase activity（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（±s，n=9）Tab.4 Test results of dual luciferase activity（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-3619-5p t P WT-lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.08 0.43±0.031）20.014 0.000 MUT-lncRNA DNAJC3-AS1 1.00±0.09 0.97±0.08 0.747 0.466

2.6下調(diào)miR-3619-5p可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響與si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC組相比，silncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-3619-5p組LN18細(xì)胞中miR-3619-5p表達(dá)降低（P<0.05），細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)及細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)升高（P<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)表5、圖4。

表5 下調(diào)miR-3619-5p可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1對(duì)LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-3619-5p can reverse effect of down-regulation of lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

表5 下調(diào)miR-3619-5p可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1對(duì)LN18細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-3619-5p can reverse effect of down-regulation of lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and EMT of LN18 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-NC si-lncRNA DNAJC3-AS1+anti-miR-3619-5p t P miR-3619-5p 1.00±0.09 0.42±0.031）18.341 0.000 E-cadherin 0.89±0.06 0.43±0.031）20.572 0.000 N-cadherin 0.34±0.02 0.77±0.061）20.397 0.000 Vimentin 0.47±0.03 0.81±0.071）13.393 0.000 Migration 105±8.06 227±18.121）18.455 0.000 Invasion 75±6.19 169±1.241）44.670 0.000

圖4 同時(shí)下調(diào)miR-3619-5p與lncRNA DNAJC3-AS1對(duì)LN18細(xì)胞遷移、侵襲及細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of both down-regulated miR-3619-5p and lncRNA DNAJC3-AS1 on migration，invasion and protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in LN18 cells

3 討論

膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的異常激活及抑癌基因的失活密切相關(guān)，研究膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)的基因分子及其作用機(jī)制可為膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的闡明及治療靶點(diǎn)的選擇提供新途徑。lncRNA是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，可靶向結(jié)合miRNA，調(diào)控miRNA靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，多種lncRNAs在膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)，參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA HNF1A-AS1呈高表達(dá)，敲減其表達(dá)可靶向miR-32-5p/SOX4軸對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了潛在的新型治療靶點(diǎn)［10］；lncRNA CTBP1-AS2在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)增加，其可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-370-3p并上調(diào)Wnt7a表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及EMT過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程［11］；lncRNA TPTEP1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低，在體外和體內(nèi)均可減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘤的干性和抗輻射性，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-106a-5p/MAPK14軸有關(guān)，可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的分子靶標(biāo)［12］。

lncRNA DNAJC3-AS1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-214-3p進(jìn)而抑制LIVIN表達(dá)以阻礙結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲和EMT過(guò)程，lncRNA DNAJC3-AS1可能為結(jié)腸癌的治療提供了新的分子靶點(diǎn)［13］；骨肉瘤中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)升高，其可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并降低骨肉瘤對(duì)順鉑的敏感性，可能是骨肉瘤的治療靶標(biāo)［14］。本研究顯示，腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)明顯升高，提示其可能促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展進(jìn)程；通過(guò)下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示lncRNA DNAJC3-AS1可能成為腦膠質(zhì)瘤治療的分子靶點(diǎn)。

EMT是細(xì)胞失去上皮極性而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，在這一過(guò)程中，上皮標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高［15］。腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷EMT過(guò)程后，細(xì)胞骨架發(fā)生改變，細(xì)胞間黏附作用降低，遷移和侵襲能力增強(qiáng)［16］。因此，抑制腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程對(duì)降低腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要意義。本研究顯示，下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，說(shuō)明下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1可阻礙腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT過(guò)程，進(jìn)而降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

為進(jìn)一步探究下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲及EMT過(guò)程的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了lncRNA DNAJC3-AS1可靶向負(fù)調(diào)控miR-3619-5p，這與本文腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)升高而miR-3619-5p表達(dá)降低的分子機(jī)制一致。研究顯示，lncRNA HEIH在卵巢癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，而miR-3619-5p表達(dá)下調(diào)，lncRNA HEIH可通過(guò)靶向miR-3619-5p/CTTNBP2軸促進(jìn)體外卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)尋找改善卵巢癌治療的新靶點(diǎn)具有重要意義［17］；lncRNA PVT1在抗順鉑的胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默其表達(dá)可通過(guò)靶向miR-3619-5p下調(diào)TBL1XR1進(jìn)而增強(qiáng)抗順鉑的胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，為逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥性提供了潛在分子靶點(diǎn)［18］。本研究通過(guò)上調(diào)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-3619-5p的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-3619-5p可阻礙腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲及EMT過(guò)程，提示miR-3619-5p可作為抑制膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)。本研究結(jié)果還顯示，下調(diào)miR-3619-5p可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNA DNAJC3-AS1對(duì)LN18細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的抑制作用，提示lncRNA DNAJC3-AS1可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-3619-5p影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，lncRNA DNAJC3-AS1在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中表達(dá)升高，其可能通過(guò)靶向下調(diào)miR-3619-5p來(lái)促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，lnc-RNA DNAJC3-AS1/miR-3619-5p軸可能為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的分子靶點(diǎn)。但本研究尚存在不足之處，尚未探究miR-3619-5p下游靶基因及信號(hào)通路，且僅在體外細(xì)胞層面進(jìn)行了探究，還需通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證lncRNA DNAJC3-AS1/miR-3619-5p軸對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。