雙氫青蒿素對(duì)CNP模型大鼠的治療作用及對(duì)炎癥小體NLRP3信號(hào)通路的影響①

杜菲 周巖 王軍浩 韓建鵬 馮建勇 郭闊 陳文彬 李永章

（河北省中醫(yī)院泌尿外科，石家莊 050011）

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CNP）是男性常見病，臨床表現(xiàn)為慢性盆腔疼痛、尿急、尿痛、排尿不盡感、排尿困難等尿道刺激或梗阻癥狀［1］；CNP發(fā)病率高，治愈率低，且持續(xù)時(shí)間長，易反復(fù)，對(duì)患者身心造成嚴(yán)重危害［2-3］。迄今為止，CNP的診斷標(biāo)準(zhǔn)、治療方法及療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)均存在不足，CNP的致病機(jī)制和治療方法急需進(jìn)一步研究。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素被硼氫化鈉還原生成的衍生物，療效強(qiáng)而副作用小，除具有治療瘧疾、抗腫瘤等作用外，還具有抗炎作用［4］。但DHA是否對(duì)CNP有治療作用尚不清楚。本研究以健康雄性SPF級(jí)SD大鼠復(fù)制CNP模型，旨在觀察DHA對(duì)CNP模型大鼠的治療作用及對(duì)炎癥小體NLRP3信號(hào)通路的影響，為CNP治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SPF級(jí)SD大鼠36只，6周齡，體質(zhì)量180~200 g，購于成都達(dá)碩生物有限公司［SCXK（川）2020-030］。

1.1.2 試劑與儀器苯甲酸雌二醇（Sigma，CAS#：50-50-0）；TNF-αELISA試劑盒（#ab181421）、IL-10 ELISA試 劑 盒（#ab255729）、IL-6 ELISA試 劑 盒（#ab46027）、caspase-1、IL-1β（英國Abcam公司）；抗NLRP3（中國Bioss公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek Elx9808）；倒置顯微鏡（德國Zeiss）。

1.2 方法

1.2.1 分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)放入鼠籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第4天挑選健康雄性SPF級(jí)SD大鼠36只用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)取6只大鼠作為對(duì)照組（Control），其余30只用于構(gòu)建CNP模型，對(duì)照組實(shí)行假手術(shù)。CNP模型建立后，隨機(jī)選擇24只大鼠分為4組：模型組（Model）、DHA高劑量組（High-DHA）、DHA低劑量組（Low-DHA）和前列康組（QLK），每組6只，其中模型組不采取治療，DHA高、低劑量組每天灌胃給予40、20 mg/kg DHA，前列康組每天灌胃給予0.5 g/kg前列康片，連續(xù)治療1個(gè)月，空白組和模型組每天灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.2 CNP模型構(gòu)建采用去勢和雌激素誘導(dǎo)的方式建立CNP模型［5］。大鼠造模前12 h禁食不禁水，造模開始時(shí)腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，大鼠完全昏迷后固定，剔除腹部全部毛發(fā)，消毒。無菌條件下在腹中線位置開口，將兩側(cè)睪丸分別擠出陰囊，結(jié)扎后剪斷精索血管，縫合消毒后將大鼠放入鼠籠中等待蘇醒。第2天在腹部皮下注射苯甲酸雌二醇（0.35 mg/kg，溶于橄欖油），1次/d，連續(xù)20 d。每天用碘伏擦拭傷口，肌內(nèi)注射青霉素1周（200 000 U/kg）?？瞻捉M假手術(shù)處理，除不擠出陰囊和剪斷精索血管外，其余操作同CNP造模。

1.2.3 von Frey纖維檢測痛覺敏感性及前列腺指數(shù)計(jì)算采用von Frey絲（4 g）測試大鼠痛覺敏感性，刺激范圍局限于前列腺附近盆腔區(qū)域。1~2 s/次施加刺激，間隔至少5 s，共10次，若大鼠出現(xiàn)腹部劇烈收縮、舔或抓撓及跳躍等劇烈動(dòng)作，則被認(rèn)為積極響應(yīng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以正響應(yīng)百分比計(jì)算，即響應(yīng)頻率（%）。大鼠稱重，頸椎脫位處死，取前列腺組織并稱重。前列腺指數(shù)（mg/g）=前列腺重（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.4 HE染色10%多聚甲醛固定大鼠前列腺組織，乙醇脫水，二甲苯清除，石蠟包埋，切片，按照常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.5 ELISA采用50 mmol/L冷磷酸鉀緩沖液（pH=7.4）制備前列腺勻漿（10%，W/V），4℃、3 000 r/min離心10 min，采集上清進(jìn)行ELISA分析。TNF-α、IL-10和IL-6含量分別采用ELISA試劑盒檢測，按照試劑盒說明書操作。

1.2.6 Western blot提取前列腺組織總蛋白，Bradford's法測定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜（PVDF），5%牛血清白蛋白（BSA）孵育，4℃孵育一抗，TBST洗滌3次，孵育二抗，顯色，Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算前列腺組織NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA對(duì)CNP模型大鼠痛覺敏感性的影響

von Frey纖維檢測大鼠痛覺敏感性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠痛覺響應(yīng)頻率顯著升高；與模型組相比，DHA高、低劑量組與前列康組大鼠痛覺響應(yīng)頻率均顯著降低，其中DHA高劑量組和前列康組大鼠痛覺敏感性改善效果比DHA低劑量組更為顯著（表1）。

表1 各組大鼠反應(yīng)頻率（±s，n=6）Tab.1 Response frequency of rats（±s，n=6）

表1 各組大鼠反應(yīng)頻率（±s，n=6）Tab.1 Response frequency of rats（±s，n=6）

Note：1）P<0.001 vs control group；2）P<0.01，3）P<0.001 vs model group；4）P<0.01 vs low-DHA group.

Groups Control Model Low-DHA High-DHA QLK Response frequency（%）26.67±8.16 85.00±10.491）70.00±6.322）55.00±5.483）4）53.33±10.333）4）

2.2 DHA對(duì)CNP模型大鼠前列腺指數(shù)的影響與對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低，前列腺重和前列腺指數(shù)顯著升高；與模型組相比，3個(gè)治療組體質(zhì)量均顯著增加，前列腺重和前列腺指數(shù)降低，與DHA低劑量組相比，DHA高劑量組和前列康組大鼠體質(zhì)量顯著增加，前列康組前列腺指數(shù)顯著降低（表2）。

表2 大鼠體質(zhì)量、前列腺重及前列腺指數(shù)（±s，n=6）Tab.2 Body weight，prostatic weight and prostatic index of rats（±s，n=6）

表2 大鼠體質(zhì)量、前列腺重及前列腺指數(shù)（±s，n=6）Tab.2 Body weight，prostatic weight and prostatic index of rats（±s，n=6）

Note：1）P<0.001 vs control group；2）P<0.05，3）P<0.001 vs model group；4）P<0.05，5）P<0.01，6）P<0.001 vs low-DHA group.

Groups Control Model Low-DHA High-DHA QLK Body weight/g 310.78±8.46 258.25±7.421）269.23±8.432）287.27±5.453）6）284.78±2.543）5）Prostate weight/mg 639.43±47.86 832.37±71.871）686.12±5.653）669.38±48.043）633.87±60.533）Prostate index/（mg·g-1）2.06±0.18 3.23±0.301）2.55±0.083）2.33±0.203）2.23±0.213）4）

2.3 DHA對(duì)CNP模型大鼠前列腺組織病理損傷的影響HE染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組前列腺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯病理變化；模型組前列腺組織結(jié)構(gòu)受損，腺管結(jié)構(gòu)模糊，大量腺管萎縮，腔內(nèi)分泌物基本消失，間質(zhì)內(nèi)可見大量纖維組織，部分區(qū)域可見淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞聚集；與模型組相比，3個(gè)治療組前列腺組織結(jié)構(gòu)損傷程度減輕，腺腔內(nèi)分泌物增加，其中，DHA高劑量組和前列康組腺腔內(nèi)分泌物恢復(fù)更為明顯（圖1）。

圖1 HE染色觀察大鼠前列腺組織病理損傷Fig.1 Pathological lesions of prostate tissues observed by HE staining

2.4 DHA對(duì)CNP模型大鼠前列腺中炎癥因子的影響ELISA結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠前列腺組織中TNF-α和IL-6含量顯著升高，IL-10含量顯著降低；與模型組相比，DHA高劑量組及GLK組TNF-α和IL-6含量顯著降低，IL-10含量增加，但3個(gè)治療組間前列腺組織TNF-α、IL-6和IL-10含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。2.5 DHA對(duì)CNP模型大鼠前列腺組織炎癥小體NLRP3信號(hào)通路的影響Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高，與模型組相比，DHA高、低劑量組NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)均顯著降低，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

表3 大鼠前列腺組織TNF-α、IL-10、IL-6含量（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 TNF-α，IL-10 and IL-6 contents in prostate tissues of rats（±s，n=6，pg/ml）

表3 大鼠前列腺組織TNF-α、IL-10、IL-6含量（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 TNF-α，IL-10 and IL-6 contents in prostate tissues of rats（±s，n=6，pg/ml）

Note：1）P<0.01 vs control group；2）P<0.05，3）P<0.01 vs model group.

Groups Control Model Low-DHA High-DHA QLK IL-6 28.243±0.737 31.765±1.2601）31.028±1.323 29.314±0.8982）29.836±0.3142）IL-10 5.868±0.211 5.162±0.1841）5.410±0.231 5.794±0.0803）5.642±0.0993）TNF-α 46.148±1.309 51.895±2.0531）49.882±1.921 48.403±1.2552）48.547±0.3612）

圖2 Western blot檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detected NLRP3，caspase-1，IL-1β protein expressions

3 討論

本研究采用去勢和雌激素誘導(dǎo)的方式建立CNP模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠痛覺敏感性、前列腺重和前列腺指數(shù)顯著升高，體質(zhì)量減少，前列腺組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，說明CNP大鼠模型建立成功。分別采用40、20 mg/kg DHA及前列康片治療后，CNP大鼠以上癥狀均得到明顯改善。前列康片是臨床CNP治療的常用藥，40 mg/kg DHA表現(xiàn)出了與前列康片相似的治療效果，表明DHA有望成為新的CNP治療藥物。

雖然CNP的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但越來越多的研究表明炎癥在CNP中起關(guān)鍵作用［6-7］。XIONG等［6］研究表明，CNP大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-8和IL-17表達(dá)顯著上升，八正散降低了IL-6、IL-8和IL-17表達(dá)，表明八正散的抗炎作用是治療CNP的途徑之一。本研究表明，DHA和前列康片均降低了促炎因子TNF-α和IL-6表達(dá)，提高了抑炎因子IL-10表達(dá)，表明調(diào)控炎癥因子表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)可能是DHA和前列康治療CNP的作用靶點(diǎn)。

NLRP3炎癥小體激活是各種炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，可能是抗炎治療的一個(gè)有前途的靶點(diǎn)［8-10］。細(xì)胞損傷過程中衍生的脂多糖和其他分子可促進(jìn)NLRP3炎癥小體激活，從而導(dǎo)致caspase-1激活；活化的caspase-1最終將內(nèi)源性促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18轉(zhuǎn)化為成熟的分泌形式［8，11-13］。研究表明，CNP大鼠前列腺組織中NLRP3信號(hào)通路被激活，血清IL-1β和IL-18水平升高，可能是大鼠前列腺炎癥細(xì)胞浸潤和組織學(xué)改變的原因之一［14-15］。DHA是從青蒿素中提取的倍半萜內(nèi)酯，具有抗炎和抗癌作用。LIANG等［16］通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，DHA可通過抑制NLRP3炎癥小體激活預(yù)防葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。但DHA在CNP中對(duì)NLRP3炎癥小體通路的作用尚無報(bào)道。本研究證實(shí)，40、20 mg/kg DHA均能顯著抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)，說明DHA可通過抑制NLRP3炎癥小體通路激活，減少炎癥細(xì)胞因子分泌，從而緩解CNP的炎癥組織病理損傷。雖然DHA具有抑制NLRP3炎癥小體改善CNP炎癥反應(yīng)的作用，但DHA對(duì)包括NLRP3炎癥小體在內(nèi)的炎癥反應(yīng)信號(hào)的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。