蚓激酶對哮喘小鼠免疫相關轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的影響①

韓兆鵬 薛征 楊艷 胡逸中 周歡 劉亞尊（山西中醫(yī)藥大學，太原 030024）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）作為一種氣道慢性炎癥性疾病，免疫細胞失衡導致的炎癥反應失控是其關鍵機制之一。Th1/Th2與Th17/Treg失衡在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用［1-2］。IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α可誘發(fā)T細胞免疫失衡，而T-bet、GATA-3、RORγt和Foxp3分別作為免疫細胞Th1、Th2、Th17和Treg的特異性轉錄因子調(diào)控初始CD4+T細胞向Th1、Th2、Th17和Treg分化［3-4］。炎癥因子與轉錄因子一定程度上可反映Th1/Th2、Th17/Treg免疫平衡情況，判斷氣道炎癥程度。通過改善Th1/Th2與Th17/Treg平衡緩解過敏性癥狀是哮喘治療的重要策略。蚓激酶作為中藥地龍中提取的一組絲氨酸蛋白水解酶，具有抗凝纖溶、抗纖維化、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用。研究顯示，蚓激酶可抑制白細胞介素-1受體相關激酶-4（interleukin-1 receptor-associated kinase-4，IRAK4）活化及NF-κB、MAPKs表達緩解炎癥反應［5］，但蚓激酶在哮喘氣道炎癥方面的研究較少。本研究擬觀察蚓激酶對哮喘小鼠炎癥因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α和細胞轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt及Foxp3的影響，探討蚓激酶對哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物4~6周齡健康SPF級BALB/c雄性小鼠40只，體質量18~22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：20170005019743，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，經(jīng)上海市中醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會批準（dw2020003），飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院SPF級動物房，20~24℃、50%~70%濕度、IVC-Ⅱ型獨立送風籠具中飼養(yǎng)，自由飲水與進食，適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物與試劑醋酸地塞米松片（0.75 mg/片，上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：HB102079）；蚓激酶（≥12 000 U/mg，上海國源生物技術有限公司，批號：20190105）；OVA（Sigma，貨號：A5503）；Al（OH）3（Thermo，貨號：77161）；蘇木素、伊紅溶液（BASO，貨號：714094、BA4099）；甲醛、二甲苯、異丙醇、無水乙醇、氯仿（國藥集團，貨號：10010018、10023418、80109218、100092680、10023419）；IL-6、IL-1β、TGF-β、TNF-αELISA試 劑 盒（X-Y Biotechnology，貨 號：XY-E20012、XY-E20533、XY-E20217、XY-E20220）；Trizol（Invitrogen，貨號：1596-026）；BCA蛋白定量試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒（Thermo，貨號：PIC?PI23223、#K0223）；逆轉錄試劑盒（Fermentas，貨號：#K1622）；蛋 白 預 染Marker（Fermentas，貨 號：SM1811）；DEPC處理水、RIPA組織細胞快速裂解液、4×蛋白上樣緩沖液、TEMED（上?；鶢栴D生物，貨 號：R1600、BYL40825、BYL40828、BYL40728）；Tween20（Amresco，貨號：BYL40713）；發(fā)光液（Milli?pore，貨號：WBKLS0100）；RORγt（Bioss，貨號：Bs-6217R）；Foxp3（Abcam，貨 號：Ab23683）；T-bet、GATA-3（Proteintech，貨號：13700-1-AP、66400-1-Ig）；GAPDH抗體（CST，貨號：#5174）；羊抗兔HRP標記的二抗（碧云天，貨號：A0208）。

1.1.3 儀器正置顯微鏡（Nikon公司，ECLIPSE Ni）；石蠟切片機、攤片機（徠卡公司，SQ2125、PPTHK-21B）；恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司，DHG-9023A）；顯微圖像分析系統(tǒng)（Nikon公司，DS-Ri2）；Real-time檢測儀（ABI公司，ABI-7300）；低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16M）；旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，K30）；電動勻漿機（FLUKO，PRO200）；酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀，MK3）；電泳儀（Bio-Rad公司，mini protean 3 cell）；電轉儀（大連競邁科技有限公司，PS-9）；移液器（吉爾森P型移液器，Pipetman）；水浴鍋（Leica，HI1210）；成像系統(tǒng)（Tanon，Tanon-5200）；超聲霧化器（PARI GmbH，PARI BOY N）。

1.2方法

1.2.1 藥物配制10 g OVA、1 g Al（OH）3溶于100 ml生理鹽水，制成10%致敏液；蚓激酶以1.75 g/（kg·d）溶于pH=6的PBS；醋酸地塞米松片溶于生理鹽水配制成0.075 mg/ml溶液。

1.2.2分組、造模及給藥40只SPF級BALB/c雄性小鼠隨機分為空白對照組（空白組）、哮喘模型組（模型組）、地塞米松組（地米組）、蚓激酶組，每組10只。造模第1、14天，模型組、地米組和蚓激酶組小鼠腹腔注射致敏液（0.5 ml/只），第21~27天將小鼠置于5 L密閉容器，霧化吸入5%OVA激發(fā)，40 min/次，1 d/次。空白組腹腔注射及超聲霧化均以等量生理鹽水代替。4組小鼠每次霧化激發(fā)1 h后，蚓激酶組灌胃給予蚓激酶［20 ml/（kg·d）］，地米組灌胃給予等量地塞米松，空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.3 標本留取各組小鼠末次灌胃24 h后脫頸處死，結扎右側支氣管，左側主支氣管以1.5 ml生理鹽水灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveo?lar lavage fluid，BALF），離心取上清；右側肺上葉用10%甲醛固定，HE染色，制備肺組織切片；右側肺下葉剪碎制成勻漿，進行RT-PCR和Western blot檢測。1.2.4 HE染色觀察肺組織病理變化右側肺上葉以10%甲醛固定48 h，流水沖洗，梯度乙醇脫水，置于無水乙醇和二甲苯混合液2 h，二甲苯脫水透明，浸蠟、包埋、切片，烤片、水化，HE染色，透明，封片，顯微鏡拍照，采集分析樣本相關部位。

1.2.5 ELISA測定BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平取BALF上清分裝，按ELISA試劑盒說明書操作，測定450 nm處吸光度，通過標準品吸光度（A）繪制標準曲線，計算標本中IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α實際濃度。

1.2.6 RT-PCR檢測肺組織T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3 mRNA表達取適量右肺組織勻漿，按試劑盒說明書操作。Trizol法提取總RNA，消除總RNA中的DNA后反轉錄合成cDNA第一條鏈，反應體系（25μl）：RNA-Primer Mix 12μl、5×RT Reaction Buffer 5μl、25 mmol/L dNTPs 1μl、25 U/μl RNase Inhibitor 1μl、200 U/μl M-MLV Rtase 1μl、RT引物1μl、ddH2O 4μl，反 應 程 序：37℃60 min、85℃5 min、4℃5 min，-20℃保存。對cDNA進行PCR擴增，反應體系（25μl）：SYBR Green Mix 12.5μl、正向 引 物0.5μl、反 向 引 物0.5μl、ddH2O 9.5μl、cDNA模板2μl，95℃10 min（95℃15 s；60℃45 s）40個循環(huán)、95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s、60℃15 s。數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶分析軟件ABI Prism 7300 SDS Software，以GAPDH為 內(nèi) 參，2-ΔCt計 算mRNA相對表達。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.2.7 Western blot檢測肺組織T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3蛋白水平取適量右肺組織勻漿，按試劑盒說明書操作，組織勻漿完全裂解后離心取上清，蛋白定量，根據(jù)標準曲線求出相應樣品蛋白實際濃度，制膠、上樣、電泳，在25 V的半干式電轉緩沖液（48 mmol/L Tris、39 mmol/L glycine、0.04%SDS、20%甲醇）中轉膜30 min，室溫下置于麗春紅染色工作液中搖動染色5 min，封閉，孵育抗原，根據(jù)說明書將抗體稀釋后4℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗（1∶1 000稀釋）37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，與配制的ECL發(fā)光液混合顯色，成像系統(tǒng)掃描，Image J軟件分析，Western blot結果表示為目標蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用±s表示。各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若方差齊則直接進行單因素方差分析，并用LSD進行兩兩比較；若方差不齊則先對數(shù)據(jù)進行變量轉換，再進行單因素方差分析，并用LSD進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠一般狀態(tài)空白組小鼠進食、飲水、活動度、毛色、體質量均正常；模型組小鼠進食、飲水減少，煩躁搔鼻，毛發(fā)蓬立且光澤度差，體質量減輕；地米組及蚓激酶組小鼠進食、飲水、毛色、搔鼻均較模型組改善，體質量較模型組增加。

2.2 4組小鼠肺組織病理學改變高倍鏡下顯示，空白組管腔平滑，未見明顯炎癥細胞浸潤；模型組造模后，小鼠管腔及周圍炎癥細胞浸潤明顯，黏膜水腫增厚；地米組和蚓激酶組上述病理變化較模型組改善（圖1）。

圖1 4組小鼠肺組織病理變化（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of lung tissue of mice in four groups（HE，×200）

2.3 4組小鼠BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平與空白組比較，模型組小鼠IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01），地米組、蚓激酶組IL-6、TGF-β水平差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），地米組、蚓激酶組IL-1β、TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，地米組和蚓激酶組IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），地米組與蚓激酶組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表2）。

表2 4組小鼠BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Levels of IL-6，TGF-β，IL-1βand TNF-αin BALF supernatant of mice in four groups（±s，n=10，pg/ml）

表2 4組小鼠BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Levels of IL-6，TGF-β，IL-1βand TNF-αin BALF supernatant of mice in four groups（±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P IL-6 9.17±1.02 19.00±2.721）14.07±1.861）3）15.72±1.591）2）23.288<0.001 TGF-β 28.15±6.56 54.97±7.591）39.35±7.361）3）44.75±5.171）2）13.760<0.001 IL-1β 13.92±2.30 22.97±4.791）15.97±4.262）16.04±4.622）4.616 0.016 TNF-α 241.74±45.38 659.12±129.861）347.99±58.453）351.86±75.413）23.125<0.001

2.4 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA水平與空白組比較，模型組小鼠T-bet mRNA水平降低，GATA-3 mRNA水平升高（P<0.01），與模型組相比，地米組與蚓激酶組T-bet mRNA表達增加（P<0.01），GATA-3 mRNA表達減少（P<0.01），地米組與蚓激酶T-bet、GATA-3 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表3）。

表3 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of T-bet，GATA-3 mRNA levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

表3 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of T-bet，GATA-3 mRNA levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P T-bet 0.017 9±0.003 8 0.005 8±0.001 31）0.014 8±0.004 62）0.013 5±0.005 22）8.384 0.001 GATA-3 0.007 5±0.002 0 0.022 7±0.003 41）0.012 3±0.002 81）2）0.014 9±0.003 71）2）21.744<0.001

2.5 4組小鼠肺組織RORγt、Foxp3 mRNA水平

與空白組比較，模型組小鼠Foxp3 mRNA水平降低，RORγt mRNA水平升高（P<0.01），與模型組相比，地米組與蚓激酶組Foxp3 mRNA表達增加（P<0.01），RORγt mRNA表達減少（P<0.01），地米組與蚓激酶的RORγt、Foxp3 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表4）。

表4 4組小鼠肺組織RORγt、Foxp3 mRNA水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of lung tissues RORγt，F(xiàn)oxp3 mRNA levels of mice in four groups（±s，n=10）

表4 4組小鼠肺組織RORγt、Foxp3 mRNA水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of lung tissues RORγt，F(xiàn)oxp3 mRNA levels of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P RORγt 0.009 7±0.001 0 0.030 6±0.005 81）0.015 7±0.003 11）2）0.017 9±0.004 21）2）24.996<0.001 Foxp3 0.016 0±0.003 8 0.005 4±0.001 71）0.012 4±0.003 51）2）0.011 5±0.002 51）2）10.908<0.001

2.6 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白水平與空白組比較，模型組小鼠T-bet蛋白水平降低，GATA-3蛋白水平升高（P<0.01），與模型組相比，地米組與蚓激酶組T-bet蛋白表達增加（P<0.01），GATA-3蛋白表達減少（P<0.05），地米組與蚓激酶T-bet、GATA-3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表5、圖2）。

圖2 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoresis of T-bet and GATA-3 protein expressions in lung tissues of mice in four groups

表5 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of T-bet and GATA-3 protein levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

表5 4組小鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of T-bet and GATA-3 protein levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P T-bet 0.395 9±0.088 1 0.054 0±0.007 71）0.269 0±0.032 31）3）0.201 0±0.014 91）3）26.791<0.001 GATA-3 0.198 4±0.109 7 0.794 7±0.019 81）0.426 2±0.274 72）0.412 8±0.181 72）6.080 0.018

2.7 4組小鼠肺組織RORγt、Foxp3蛋白水平與空白組比較，模型組小鼠Foxp3蛋白水平降低，RORγt蛋白水平升高（P<0.01），與模型組相比，地米組與蚓激酶組Foxp3蛋白表達增加（P<0.01），RORγt蛋白表達減少（P<0.01），地米組與蚓激酶的RORγt、Foxp3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表6、圖3）。

圖3 4組小鼠肺組織RORγt、Foxp3蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoresis of RORγt and Foxp3 protein expressions in lung tissues of mice in four groups

表6 4組小鼠肺組織RORγt，F(xiàn)oxp3蛋白水平比較（±s，n=10）Tab.6 Comparison of RORγt，F(xiàn)oxp3 protein levels of lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

表6 4組小鼠肺組織RORγt，F(xiàn)oxp3蛋白水平比較（±s，n=10）Tab.6 Comparison of RORγt，F(xiàn)oxp3 protein levels of lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P RORγt 0.091 2±0.057 3 0.619 9±0.087 51）0.183 4±0.062 82）0.273 5±0.093 21）2）27.142<0.001 Foxp3 0.748 1±0.079 9 0.061 8±0.002 11）0.449 1±0.110 51）2）0.491 7±0.137 91）2）25.588<0.001

3 討論

世界范圍內(nèi)哮喘患者超過3.39億，僅2016年全球就有417 918人死于哮喘［6-7］。哮喘是兒童最常見的慢性疾病，遺傳易感性與環(huán)境接觸是哮喘發(fā)病的主要原因，氣道慢性炎癥是其最重要的發(fā)病機制之一。

哮喘發(fā)病過程中存在Th1/Th2和Th17/Treg失衡，TNF-α、IL-1β可促使免疫細胞向Th2/Th17偏移。促炎因子IL-6、TGF-β過分泌在哮喘中可誘導免疫相關轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3水平向Th2/Th17傾斜；而轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3分別作為Th1、Th2、Th17和Treg最具有特征性的分子標志物，調(diào)控這些免疫細胞分化。

TGF-β在Th17/Treg分化中不可或缺，IL-6則決定了二者分化比例，且介導Th1/Th2分化。IL-6是引起炎癥反應和組織損傷的重要因子，可增加哮喘患病風險，并可作為評估哮喘的重要標志物［8］。IL-6對T細胞增殖與分化具有重要調(diào)控作用［9］。正常情況下，IL-6在IL-12作用下可刺激T-bet基因表達，從而激發(fā)Th1分化。IL-6可在IL-4作用下增加GATA-3基因表達，促進初始CD4+T細胞向Th2分化，且可誘導Th2和Th17優(yōu)勢分化，并通過巨噬細胞抑制Th1和Treg分化。過敏原刺激機體后，哮喘活動期和持續(xù)狀態(tài)的氣道中均發(fā)現(xiàn)不同程度IL-6水平升高［10-11］。IL-6基因敲除后，模型小鼠氣道高反應性降低，氣道炎癥細胞募集與Th2、Th17細胞因子表達也 明 顯 減 少［12］。TGF-β在IL-6缺 失 情 況 下增 加Foxp3 mRNA及蛋白表達，擴充Treg分化含量。而TGF-β在IL-6刺激下會誘導RORγt表達，增加Th17表達，而Th17也會分泌部分IL-6形成Th17分化的正反饋循環(huán)。

TNF-α、IL-1β同樣作為前炎癥細胞因子參與氣道炎癥反應，二者均可誘導ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表達和趨化因子分泌，還可直接作用于平滑肌細胞和細胞間質放大炎癥反應［13］。過敏原激活NLRP3后產(chǎn)生IL-1β，從而參與以Th2/Th17為優(yōu)勢的哮喘［14-15］。IL-1β可加強Th2型細胞因子IL-6、IL-13表達，也會誘導Treg向Th17分化加強炎癥反應。炎癥中TNF-α往往出現(xiàn)在IL-1β之后［16］。致敏階段，TNF-α可通過促進CD11c+細胞分泌參與Th2/Th17介導的細胞炎癥［17］。TNF-α可招募、激活嗜酸性粒細胞與中性粒細胞過表達，促進Th17向分化，通過刺激巨噬細胞活化增加細胞因子IL-6、IL-1β分泌。

藥物干預是哮喘防治過程中的重要環(huán)節(jié)，從中藥中提取的天然化合物對疾病研究及治療得到了廣泛認可。中藥地龍具有清熱定驚、通絡平喘功效，治療哮喘療效確切，但具體機制尚不明確［18］。蚓激酶作為從地龍中提取的一組蛋白水解酶，具有良好的抗凝溶纖作用，臨床被廣泛用于心腦血管溶栓治療。研究表明，蚓激酶還可通過發(fā)揮溶纖作用，改善大鼠肺纖維化癥狀，可能是地龍治療哮喘的有效組分［19］。

本研究通過腹腔致敏與OVA霧化激發(fā)建立急性發(fā)作期哮喘小鼠模型，并在激發(fā)1 h后給予蚓激酶治療，發(fā)現(xiàn)在哮喘急性期存在炎癥因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平升 高，細胞轉 錄因子GATA-3、RORγt mRNA及蛋白表達增加，而T-bet、Foxp3 mRNA及蛋白水平顯著降低。藥物治療后，哮喘小鼠肺組織炎癥因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平降低，其中IL-1β與TNF-α降至正常水平，與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究還發(fā)現(xiàn)，蚓激酶可有效抑制Th2/Th17的特異性轉錄因子GATA-3、RORγt基因表達，減少其蛋白翻譯；同時誘導Th1/Treg轉錄因子T-bet、Foxp3 mRNA及蛋白表達，因此，蚓激酶可降低IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1β水平，調(diào)節(jié)轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3基因及蛋白表達。機體Th1/Th2和Th17/Treg分化離不開炎癥因子和免疫細胞特異性轉錄因子參與，因此推測蚓激酶可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水 平 及 轉 錄 因 子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3基因及蛋白表達改善哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。本研究僅探討了蚓激酶對免疫轉錄因子的影響，擬進一步探究其對細胞免疫失衡的作用機制。

總之，本研究表明，哮喘急性發(fā)作期存在炎癥因子及免疫細胞特異性轉錄因子水平異常。蚓激酶可通過降低IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平減少GATA-3、RORγt mRNA及蛋白轉錄和翻譯，誘導T-bet、Foxp3 mRNA及蛋白表達，即通過降低相關前炎癥因子水平調(diào)節(jié)免疫細胞轉錄因子表達，達到治療哮喘的目的。